本プロトコルは、ナノ材料スキャフォールド上で培養されたヒト歯科幹細胞の増殖能ならびに骨分化および歯牙分化能を評価するための、標準化され再現性のあるワークフローを提供する。研究間での比較可能性を確保するため、標準的なアッセイ（ALP活性、RANKL免疫蛍光染色［骨分化］、およびDMP-1免疫蛍光染色［歯牙分化］）および標準化戦略を用いる。
方法論記事
ナノ材料スキャフォールド上におけるヒト歯髄幹細胞の分化および増殖を評価するための標準化されたIn Vitroプロトコル
この記事について
サマリー
要約
骨分化および歯分化、ならびに幹細胞増殖の信頼性の高い評価は、スキャホールドを用いた再生戦略の生物学的性能を評価する上で不可欠である。しかし、実験プロトコル、アッセイの選択、およびデータ解釈のばらつきが、再現性や研究間の比較を制限することが多い。本論文で述べるプロトコルは、バイオマテリアルスキャホールド上で培養した幹細胞の骨分化、歯分化、および増殖能をin vitroで評価するための、標準化され再現可能なワークフローを提示する。骨分化へのコミットメントは、アルカリフォスファターゼ（ALP）酵素活性およびReceptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand（RANKL）免疫蛍光染色により評価し、歯分化へのコミットメントはDMP-1（dentin matrix protein-1）免疫蛍光染色により評価する。これら両方のタンパク質エンドポイントは、標準化されたH-score法を用いて定量化される。細胞播種密度、誘導期間、アッセイ条件、標準化戦略（タンパク質標準化ALP活性、細胞標準化3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）生存率、および免疫蛍光H-scoreを含む）、およびデータ解析手法を含む重要な実験パラメータを詳述し、技術的なばらつきを最小限に抑えるためのトラブルシューティングガイドを併記する。この手法は、複数のスキャホールドを用いた実験研究に標準的な枠組みとして適用されており、その堅牢性と再現性が実証されている。包括的で検証済みの枠組みを提供することで、本論文は幹細胞とスキャホールドの相互作用の標準的な評価を促進し、前臨床再生研究における比較可能性を向上させることを目的としている。
概要
再生歯内療法は、幹細胞、成長因子、およびスキャフォールドを用いて歯髄の生命力を回復させることに焦点を当てた、歯科治療におけるパラダイムシフトである1,2。歯髄の生命力を維持することは、感覚機能や免疫応答にとって不可欠であり、特に壊死した歯髄を持つ未完成歯において、根管の発育を継続させるために極めて重要である2。
ヒト歯髄幹細胞（DPSCs）および根尖乳頭由来幹細胞（SCAPs）は、高い増殖能、自己複製能、免疫抑制特性、および適切な微小環境条件下で象牙芽細胞様細胞へ分化する能力を有しているため、これらの処置における主要な候補であり、再生医療や細胞ベースの治療介入における将来的な応用のための極めて有望な候補となっている3,4,5.
ケイ酸カルシウム系セメントのような従来の処方材料が検討されてきましたが、ナノ粒子による修飾が生体材料と細胞の相互作用に大きな影響を与える可能性を示すエビデンスが現れています6。ナノ構造生体材料は、より生体模倣的な微小環境を提供し、幹細胞の接着や系統特異的な分化を促進させる可能性があります7。しかし、ナノ粒子形態のNeoMTA2のような新規材料の生物学的挙動は、ナノヒドロキシアパタイトなどの確立された材料と比較して、まだ十分に理解されていません8。本プロトコルでは、これらの相互作用を正確かつ再現性高く評価するための、標準化された手法の枠組みの必要性に対応します。
この標準化されたフレームワークは、同一の生物学的条件下で新規バイオマテリアルやナノマテリアル足場を評価し、研究間の比較可能性が極めて重要となる研究に特に適しています。本手法は、生存率スクリーニング（MTT）、初期骨分化へのコミットメント（ALP活性）、およびタンパク質レベルの分化（免疫蛍光Hスコア）を単一のワークフローに統合することで、単一アッセイによるアプローチよりも優れた利点を提供します。従来のアリザリンレッド染色や単一時点のアッセイを用いている研究者は、このマルチパラメータフレームワークを採用することで、観察者のバイアスを軽減し、定量的な解像度を向上させることができるでしょう。ただし、本プロトコルは、適切な適応なしに3次元オルガノイド培養、共培養システム、または動物由来幹細胞モデルに使用することを意図したものではありません。遺伝子発現プロファイリング（例：RUNX2、OCN、またはDSPPのRT-qPCR）を必要とする研究者は、本プロトコルがタンパク質および酵素的エンドポイントにのみ焦点を当てているため、分子アッセイで本ワークフローを補完してください。
歯科幹細胞の二機能的な分化能を包括的に捉えるため、本プロトコルでは、異なる生物学的エンドポイントを反映する2つの相補的な免疫蛍光マーカーを用います。RANKL（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand）は、骨分化へのコミットメントのマーカーとして使用されます。骨芽細胞様細胞におけるRANKLの発現は、カルシウムイオン駆動のミネラル化シグナル伝達および骨形成細胞の活性化を反映しており、これはSCAPsを評価した複数の研究での使用法と一致しています4,8,9。同時に、DMP-1（dentin matrix protein-1）を象牙質分化の特異的マーカーとして使用します。象牙芽細胞様細胞におけるDMP-1のアップレギュレーションは、象牙質マトリックス形成および歯髄特異的な硬組織修復の誘導を反映しており、特に標的細胞集団がDPSCsである場合に重要となります10。Hスコア法を用いて同一の実験枠組みの中でRANKLとDMP-1の両方を定量化することで、本プロトコルにより、個別の実験設計を必要とせずに、幹細胞とスキャフォールドの相互作用による重複しつつもメカニズム的に異なる2つの結果である、骨分化と象牙質分化のコミットメントを区別することが可能になります。
プロトコル
本プロトコルは、アイン・シャムス大学歯学部の倫理委員会によって承認されました（承認番号：FDASU-Rec IM112105）。ヒト組織を用いるすべての手順は、ヘルシンキ宣言に準拠して実施されました。抜歯および幹細胞の採取に先立ち、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得ました。
1. ナノ材料の調製および特性評価
- 特定の要件に従ってナノ材料を合成する10,11。Nano-NeoMTA2の場合、遊星ボールミル（材料表を参照）を用いて、350 rpmで3分間のON/OFF間隔を設け、10時間粉砕を行う。ジルコニア製粉砕ジャー内で、直径5 mmのジルコニア製ボールを用い、ボール対粉末重量比を10:1とする。次へ進む前に、透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて最終的な粒子径を確認する（目標値：<200 nm）。
注意： NeoMTA2粉末を吸入すると、呼吸器への刺激を引き起こす可能性がある。すべての乾式粉砕工程は、認定されたドラフトチャンバー内で、N95マスク、保護メガネ、およびニトリル手袋を着用して行うこと。 - 湿式化学沈殿法を用いてナノヒドロキシアパタイトを調製する8,11,12：10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O。脱イオン水を用いて、0.5 M硝酸カルシウム溶液1 Lと0.3 Mリン酸アンモニウム溶液0.6 Lを調製する。400 rpmで連続撹拌しながら、硝酸カルシウム溶液をリン酸アンモニウム溶液に約2–3 mL/minで滴下し、70 °Cまで加熱する。その際、水酸化アンモニウムを滴下してpH 10–12に維持する8。
注意： 水酸化アンモニウムは腐食性があり、毒性のあるアンモニア蒸気を放出する。必ず化学用ドラフトチャンバー内で取り扱うこと。耐酸性手袋、飛沫防止ゴーグル、およびラボコートを着用すること。皮膚に付着した場合は、直ちに水で15 min以上洗い流すこと。 - 得られたアパタイト沈殿物を、オートクレーブを用いて140 °C、0.3 MPaで2–3時間水熱処理する10。精製した沈殿物を、真空度≤0.05 mbar、-50 °Cで48時間凍結乾燥させる8。
- 以下の通り、ゾル-ゲル法を用いてバイオアクティブガラス45S5ナノ粒子を調製する。
- 室温にてポリプロピレン製ビーカーを用い、300 rpmで連続撹拌しながら、40 mLのテトラエチルオルソシリケート（TEOS）に酸触媒として10 mLの2 M硝酸（HNO₃）を混合し、前駆体溶液を調製する。
- 30分後、目標とするモル組成（45 mol% SiO₂、24.5 mol% CaO、24.5 mol% Na₂O、および6 mol% P₂O₅）となるように、硝酸カルシウム四水和物（Ca(NO₃)₂·4H₂O）と硝酸ナトリウム（NaNO₃）を添加する。リン前駆体としてリン酸トリエチル（TEP）を添加する。
- 室温で24時間撹拌する。密閉容器に入れ、60 °Cで24時間熟成させる。120 °Cで24時間乾燥させる。マッフル炉を用い、650 °Cで3時間焼成する（昇温速度：2 °C/min）。粉砕後、TEMおよびX線回折（XRD）により相組成を確認する4,9。
注意： TEOSおよびエタノールは可燃性である。HNO₃は腐食性である。すべての手順は、火気のないドラフトチャンバー内で行うこと。
- 調製したすべてのナノ粒子について、高分解能TEMおよびXRDを用いて粒子径と結晶性を評価する8。動的光散乱（DLS）を用いて平均粒子径、多分散指数（PDI）、およびゼータ電位を測定し、コロイド安定性を確認する。平均粒子径が<200 nmであり、かつゼータ電位が<−15 mVまたは>+15 mVであるバッチを採用する。
2. 幹細胞の採取および培養
- 書面によるインフォームドコンセントを得た後10、抜歯直後の埋伏下顎第三臼歯からDPSCsまたはSCAPsを採取する。抜歯した歯は2時間以内に処理し、4 °Cの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で運搬する。
注：ドナーの適格性基準は、18～35歳の全身的に健康な成人、非喫煙者、過去3ヶ月以内に抗生物質の使用歴がないこと、歯周病がないこと、および放射線写真で根尖周病変の所見がないこととする。 - 酵素消化法を用いて細胞を単離する9。歯科組織を1–2 mmの大きさに細切し、無血清Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 中に濃度3 mg/mLのコラゲナーゼ type I溶液を加え、37 °Cでロッキングプラットフォームを用いて60 rpmで連続的に撹拌しながら1時間消化する8。完全培地で中和し、70 µmのセルストレーナーでろ過する。
注意：コラゲナーゼ type Iにはエンドトキシンが含まれている可能性がある。エンドトキシン試験済みの組織培養グレードのコラゲナーゼのみを使用すること。手袋を着用し、吸入を避けること。 - DMEM、10% 胎児牛血清 (FBS)、および1% ペニシリン/ストレプトマイシン（材料表）からなる完全培地を用い8、単一細胞懸濁液を75 cm2フラスコに初期密度1 × 104 cells/cm2で播種する。
- フラスコを37 °C、5% CO₂雰囲気下でインキュベートする8。倒立位相差顕微鏡を用いて、増殖とコンタミネーションの有無を毎日観察する10。48～72時間ごとに培地を交換する。コンタミネーションの兆候（濁り、変色、不規則な細胞形態）が見られるフラスコは廃棄する。
- 第3継代後、コンフルエンシーが約70–80%に達した時点で細胞を回収する8。継代を行う際は、培地を吸引し、PBSで洗浄した後、0.25% trypsin-EDTAを用いて37 °Cで3–5分間細胞を剥離させる。完全培地で中和し、300 x g で5分間遠心分離し、1 × 104 cells/cm2で再播種する。表現型の安定性を維持するため、継代数3から6までの細胞のみを使用すること。
3. 幹細胞の特性評価
- フローサイトメトリーを用いて、単離した細胞の免疫表現型を評価する8,10。継代3回目の細胞で特性解析を行う。無染色のネガティブコントロールと、使用する各フルオロクロムのシングル染色コンペンセーションコントロールを含めること。
- PBSを用いて細胞数を106/mLに調整する。800 x gで10分間遠心分離し、ペレットをPBSで2回洗浄する8,10。
- 間葉系マーカー（CD44、CD73）および造血系マーカー（CD45）に対する抗ヒト抗体を用い、製造元の推奨希釈率（通常は1%牛血清アルブミン (BSA) 含有PBSで1:100 (材料表)）で細胞を染色する8,10。暗所、4 °Cで45分間インキュベートする。PBSで2回洗浄し、300 µLのPBSに再懸濁してデータ取得を行う。
- フローサイトメトリー解析ソフトウェア（材料表）を用いて細胞を解析し、免疫表現型（CD44およびCD73の発現、および造血系除外マーカーとしてのCD45）を評価する。以下の順にシーケンシャルゲーティングを適用する：(a) スキャッターゲーティング（FSC-A vs. SSC-A）、(b) ダブレット除外（FSC-H vs. FSC-A）、(c) 無染色コントロールに基づいて設定したフルオロクロム特異的ゲート。ゲーティング戦略とともに、各マーカーの陽性細胞率を報告する。
4. 安全な物質濃度の決定（半数最大有効濃度、EC₅₀）
- EC50を決定する₅₀ 統計解析ソフトウェア（GraphPad Prism 9）を用い、用量反応データを非線形回帰シグモイド曲線（4パラメータロジスティックモデル：Y = Bottom + (Top − Bottom) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × HillSlope))). EC50を報告する。₅₀ ～における値 µg/mL 95%信頼区間を用いて8.
- ナノ材料の連続希釈液（50、25、12.5、6.25、3.12、および 1.56 µg/mL)を1 mLのPBSに懸濁する。ストック懸濁液を30秒間ボルテックスし、次に超音波処理を行う（プローブ型超音波発生装置、40 W、30秒間オン/10秒間オフを3サイクル、以下の条件で）。 4 °C)均一な懸濁液にする。バイオセーフティキャビネット内でUV灯を用いて30分間UV滅菌する。
- 幹細胞を密度1で培養する × 104 96ウェルプレートを用いて、さまざまな濃度で72時間、1ウェルあたり[数値]個の細胞を培養し、トリパンブルーを用いて生存細胞数を算出してEC値を算出する。₅₀ ステップ4.1で説明した4パラメータロジスティックモデルを用いて。
- 各濃度につき3つの独立したウェルを用いてn = 3のトリプリケートで実験を行い、少なくとも3回の生物学的反復を設けてください。EC値を報告してください。₅₀ 平均値としての値 ± 標準偏差（SD）を求め、反復試行間の変動係数（CV%）を算出する（許容されるCV <15%).
5. 骨分化および歯分化の評価
注意：このセクションでは、同一の細胞調製物を用い、並行して免疫蛍光アッセイを行うことで、2つの相補的な分化経路を評価します。RANKL（ステップ 5.5）を骨分化マーカーとして、DMP-1（ステップ 5.6）を歯分化マーカーとして使用します。どちらも同一のH-score法（ステップ 5.8）で定量化します。同時に調製した別々のカバーガラスを用いて、両方のアッセイを実施してください。
- 6ウェルプレートに、密度4.5で幹細胞を播種する。 × 105 1ウェルあたり〇〇個の細胞を播種する。分化を開始する前に、完全培地を用いて24時間細胞を接着させる。
- サンプルを、陰性対照群（DMEMのみ）、陽性対照群（骨分化／歯分化誘導培地）、および試験群（ECにおけるナノ材料）の4つのグループに割り当てます。₅₀由来の安全濃度）。
- DMEMに10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM の各成分を添加し、骨分化誘導培地を調製する。 β-グリセロリン酸、 50 µg/mL アスコルビン酸（L-アスコルビン酸-2-リン酸）および100 nMのデキサメタゾン。48時間ごとに培地を交換する。以下の条件で72時間インキュベートする。 37 °C および5% CO2₂.
- ALP活性の測定
- 24ウェル培養プレートに、1の密度で細胞を播種する × 104 細胞/ウェルで、～にてインキュベートする 37 °C 5% CO₂含有加湿条件下で₂ 72時間。
- 培地を吸引し、ウェルをPBSで洗浄した後、以下を添加して細胞を溶解する。 200 µL ウェルあたり（PBS中0.1% Triton X-100）の溶解バッファーを加え、以下の条件でインキュベートする。 4 °C 緩やかに揺らしながら10分間置く。
- 溶解物を回収し、500 x gで遠心分離する。 g 5分間、〜で 4 °C上清を以降のすべてのALP測定に使用します。移し替えて 50 µL 各テストサンプルの、および 100 µL p-ニトロフェノール標準液を96ウェルマイクロタイタープレートに分注する。AMP基質バッファー（材料表）を加え、触媒反応を開始させる。
- その後、30分間の二次インキュベーションを（以下温度などの条件）で行った後、 37 °C、〜を添加して反応を停止させる 50 µL ウェルあたり0.5 M NaOHを添加します。吸光度マイクロプレートリーダーを用いて、直ちに405 nmでの吸光度を測定します（材料一覧表).
- 吸光度対p-ニトロフェノール濃度の標準曲線を 작성し、ALP活性をU/Lで算出する。
- Bradford法またはBCA法を用いて、同一の細胞溶解液の全タンパク質量を測定する。ALP活性を全タンパク質量で標準化し、最終結果をU/mgタンパク質として報告する。
- 骨形成マーカー（RANKL）
- 免疫蛍光染色を用いてRANKLタンパク質の発現を評価する。まず、アイソタイプコントロールおよび二次抗体のみのコントロールを以下のように調製する。(a) 一次抗体の代わりに、同濃度のアイソタイプ一致ラビットIgGを用いる。(b) 別のウェルにおいて、一次抗体を完全に省略する。
- 室温で、PBSで調製した新鮮な4%ホルムアルデヒドを用いて細胞を15分間固定する。PBSで3回洗浄（各5分間）する。
- PBSで希釈した0.1% Triton X-100を用いて10分間透過処理を行い、次いでPBSで希釈した5%正常ヤギ血清を用いて室温で1時間ブロッキングし、非特異的結合を抑制する。洗浄せずに、ブロッキングバッファーで1:200に希釈したウサギ抗RANKL一次抗体を直接添加する（材料表）の後、一晩インキュベートします。 4 °C.
- PBSで3回洗浄した後、ブロッキングバッファーで1:500に希釈したヤギ抗ウサギIgG蛍光標識二次抗体とともにインキュベートします（材料表）室温・暗所で1時間8二次抗体によるインキュベーション後、PBSで3回洗浄し（各5分間）、そのままステップ5.7の封入工程に進む。
注意： ホルムアルデヒド（4%溶液）は毒性のある固定剤であり、発がん性の疑いがあります。認定された化学薬品用ドラフトチャンバー内でのみ調製および使用してください。ニトリル手袋、飛沫防止ゴーグル、および白衣を着用してください。廃棄物は施設等のガイドラインに従って処理してください。
注：細胞の同定は、免疫蛍光スコアリングの前（ステップ5.10参照）に、位相差顕微鏡および形態学的基準によって行います。
- 歯牙形成マーカー (DMP-1)
注：歯牙形成への分化（odontogenic commitment）を評価するため、ステップ5.5と並行して、免疫蛍光染色を用いてDMP-1（dentin matrix protein-1）タンパク質の発現を評価してください。- 同じ細胞調製から得た別のカバーガラスを用いて、アイソタイプコントロールおよび二次抗体のみのコントロールを含め、ステップ5.5に記載されているすべての固定、透過処理、およびブロッキングの手順を繰り返します。
- ブロッキング後の洗浄は行わず、そのまま抗DMP-1一次抗体を添加します（参照 材料表）をブロッキングバッファーで1:200に希釈し、以下で一晩インキュベートする 4 °CPBSで3回洗浄した後、適切な蛍光標識二次抗体とともにインキュベートします（RANKLに使用したものとはスペクトルの異なる蛍光色素を使用してください。参照： 材料一覧表）をブロッキングバッファーで1:500に希釈し、室温・遮光下で1時間反応させる。
- 象牙芽細胞様分化の指標としてDMP-1の発現を評価するため、10倍の倍率で蛍光画像を撮影する。10二次抗体によるインキュベーション後、PBSで3回洗浄（各5分間）し、そのままステップ5.7の封入操作に進む。
- 抗退色封入剤を用いてスライドを封入する（参照 材料一覧表）後、室温で一晩静置する。RANKLおよびDMP-1で染色したスライドをそれぞれ封入し、明確にラベルを貼る（例： "RANKL群1" および "DMP-1グループ1"）して、イメージングを行う。
- 直ちに蛍光顕微鏡でスライドを観察するか、または以下に保存してください。 4 °C 遮光して保存する。標準化された4段階のスコアリングシステム（0：染色なし、1+：弱、2+：中等度、3+：強）を用いて染色強度を評価し、タンパク質発現量を定量する。
- すべての実験群において、同一の顕微鏡設定（露光時間、レーザー強度、およびゲイン）を用いて画像を撮影する。各マーカー（RANKLおよびDMP-1）について個別に同一の設定を適用し、群間におけるマーカー内の一貫性を確保すること。
- ウェルあたりにランダムに選択した高倍率視野（20倍対物レンズ）を最低5視野スコア判定する。2名の独立した盲検評価者にスコアリングを行わせ、コーエンのカッパ係数（許容値：kappa ≥ 0.7）を報告する。
- 次の式を用いてHスコアを算出する：H-score = Σ(i × Pi）、ここでiは染色の強度（1、2、または3）であり、Pi = 各強度レベルにおける細胞の割合（0–100%）。
注：Hスコアの範囲は0から300までである10. - ウェル間の細胞密度の差を考慮するため、免疫蛍光イメージング前に位相差顕微鏡下で各視野内のすべての可視細胞を手動で計数して算出した1視野あたりの総細胞数で、Hスコアのデータを正規化する。
- 2つの分化経路を直接比較できるよう、RANKL（骨形成エンドポイント）とDMP-1（歯形成エンドポイント）のHスコアをそれぞれ算出し、報告してください。
6. 増殖能および生存率の評価
- ヘモサイトメーターを用いた細胞計数およびトリパンブルー染色を行い、生存細胞と死細胞を区別する。培養液1mLあたりの生存細胞の総数を算出する。統計的信頼性を確保するため、1サンプルあたり少なくとも100個の細胞を計数すること。
- ミトコンドリアの代謝活性を測定するためのMTTアッセイを実施する8,10.
- 最終濃度が0.5 mg/mLとなるようにMTT溶液を添加し（材料表）を細胞に添加し、〜で4時間インキュベートする。 37 °C溶液を除去し、可溶化剤（例：SDS-HCl；参照 材料一覧表）、分光光度計を用いて570 nmにおける吸光度を測定する（参照波長：630～650 nm）。
- 細胞生存率は次のように算出します：生存率 (%) = (処理細胞の吸光度 / 未処理コントロール細胞の吸光度) × 100. 数値 >100%は陰性対照に対する増殖刺激を示す。バックグラウンド補正用にブランクウェルを含めること。
- 並行して実施したトリパンブルー染色による細胞計数を用いて、結果を細胞数で標準化する。すべてのアッセイは3連（n = 3ウェル/群、生物学的反復3回以上）で実施すること。
注意： SDS-HCl可溶化バッファーは腐食性があります。適切な個人用保護具（PPE）を着用して取り扱ってください。フォルマザンを含む廃棄物は、施設内の規定に従って廃棄してください。
結果
ここに提示されるすべての結果は、同一の研究グループが統一された機関倫理承認（FDASU-Rec IM112105）の下で実施した関連研究4,8,9,10から引用・改変したものである。
ナノ材料の特性評価および幹細胞の単離
標準化されたワークフローにより、まずスキャフォールドの特性および幹細胞の表現型の定量的な確認が行われます。合成後、作製したナノ材料を高分解能TEMおよびXRDを用いて検証し、粒子径と結晶性を確認します（図 1A,B）。同時に、酵素消化により単離したDPSCsまたはSCAPsが、完全培地中で強固な接着と増殖を示すことを確認します。フローサイトメトリー解析により、継代3代目の回収細胞の免疫表現型を検証し、間葉系マーカー（CD44, CD43）の高発現と、CD45の欠損による非造血細胞由来であることを確認します（図 1C）。
安全な材料濃度および増殖の確立
ナノ材料の連続希釈系列（50–1.56 µg/mL72時間培養後、生存細胞数の4パラメータロジスティック回帰を行うことで、信頼性の高いEC₅₀値を算出できる（ステップ4.1で説明した非線形シグモイド用量反応モデル）。MTT生存率の値が100%を超えている場合は、未処理のコントロール群に対して増殖刺激が起こったことを示している。これは、値が陰性コントロール群（未処理細胞を100%とする）に対して正規化されているためである。例えば、Nano-NeoMTA2で約196%という値が得られた場合は、単なる生存ではなく、ミトコンドリア活性の生物学的刺激を反映している。 >100%の絶対細胞生存率9.
この標準プロトコルを適用した複数の研究において、4パラメーターロジスティックモデル（ステップ 4.1）を用いて7.9 µg/mL（Nano-NeoMTA2、SCAPs）8および9.92 µg/mL（Nano-NeoMTA2、DPSCs）10のEC₅₀値が設定されており、本プロトコルで述べる分化アッセイに使用するための安全な作動濃度であることが確認されています。これらの値は、代表的なバリデーション指標として表 1に組み込まれています。
骨分化および歯分化の定量化（二重マーカー評価）
二重免疫蛍光法を用いることで、同一の細胞調製物から2つの異なる相補的なアウトカム指標を得ることができる。骨分化の評価において、RANKLのHスコアによって全4群に統計的な有意差が認められた。Nano-NeoMTA2とともに培養した細胞は、陰性対照群よりも著しく高いRANKL発現を示し、これは骨芽細胞様活性の上昇と一致していた（Figure 2A、Table 1)8,9。歯分化の評価では、DMP-1のHスコアにより、Nano-NeoMTA2とともに培養したDPSCsに強力な歯芽細胞様分化が認められ、Hスコアはナノヒドロキシアパタイト群および陰性対照群よりも有意に高く、優先的な象牙質形成能への分化が確認された(Figure 3A、Table 1)10。スコアリングに先立ち、位相差顕微鏡および特徴的な形態学的基準（紡錘形または多角形の形態）によって細胞の同定を確認した。
ALP活性を405 nmで分光光度計を用いて全群間で区別し、骨分化および歯分化の両方における早期酵素マーカーとして評価した（表1）。分光光度法によるMTT解析の結果、EC₅₀から導出された安全な濃度におけるすべてのナノ材料は、陰性対照と比較して高い細胞生存率を維持していることが確認され、これは提示された代表値と一致していた（表1）。
最適でない実験結果および不成功事例
最適でない結果について表2にまとめる。MTTアッセイにおける低い細胞生存率は、通常、ナノ材料濃度がEC₅₀閾値を超えているか、UV滅菌が不十分であったことを示している。ALP吸光度の不一致（CV > 20%）は、一般的に播種密度の不均一または溶解バッファーの均質化不足を示している。RANKLまたはDMP-1のいずれかにおける免疫蛍光信号の減衰または消失は、抗体の失活、透過処理の不足、または過剰固定に起因することが最も多く、新鮮な4%ホルムアルデヒドの使用および抗体分注液の使い切りによって解決される。RANKLチャンネルとDMP-1チャンネル間の交差反応性は、スコア判定前に二次抗体のみのコントロール画像を確認することで除外されるべきである。
図1ナノ材料の標準化された特性評価および幹細胞表現型の検証。 (A）ナノ粒子の結晶相および構造的完全性を確認するXRDスペクトル。（B) 合成したバイオマテリアルのナノスケール粒子径、形態、および均一な分散を示す代表的なTEM画像。NeoMTA2とヒドロキシアパタイトを比較している。(a) NeoMTA2および(b) ヒドロキシアパタイトの低倍率像を、(c) NeoMTA2および(d) ヒドロキシアパタイトの高倍率像をそれぞれ示す。スケールバーは左下に表示されている。 (C幹細胞特性評価のためのフローサイトメトリー・ゲーティングプロトコル。代表的な多パラメータドットプロットは、CD44、CD73（元のプロットではCD43 PEと表記）、およびCD45で染色された細胞を示している。CD44+およびCD73+のサブポピュレーションは、CD45の発現に対応してゲーティングされた。パネルAおよびCはZakiらから改変したものである。8 (CC BY-NC-SA) およびパネルBは、Habibらより改変。10 (CC BY-NC) こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2RANKL免疫蛍光染色による骨分化の定量的および半定量的評価 (A) 2Dスキャフォールド微小環境内における重要な骨形成タンパク質マーカーRANKLの発現を捉えた代表的な高解像度免疫蛍光顕微鏡写真。(a) 陰性対照細胞は、膜上に淡いRANKL発現を伴う小さなコロニーを形成している。一方、(b) 陽性対照細胞は、濃厚で均一な発現を示す骨芽細胞様コロニーの数の増加を示している。(c) NHAP、(d) NHAP/キトサン、および (e) 生体活性ガラスナノ粒子で処理した幹細胞は、高度な分化を示しており、膜および核の両方に強固で均一なRANKLの局在を伴う、大型で融合した骨芽細胞様コロニーによって特徴付けられる。Elshahatらより改変。4. (B）異なる研究間におけるRANKL発現のHスコア定量化を示す棒グラフ。免疫蛍光データの正規化に対するHスコア法の適用。視覚的な染色強度（0〜3段階で評価）と陽性染色細胞の割合を数学的に統合することで、Hスコアは定性的な顕微鏡観察結果を堅牢な半定量的な指標に変換し、観察者による主観的なバイアスを大幅に低減する。(a) Nano-NeoMTA2（7.9 µg/mL）およびバイオアクティブガラスナノ粒子（NBG； 500 µg/mL) を、骨分化誘導培地陽性対照（OM-PC）およびDMEM陰性対照（DMEM-NC）と比較した。その結果、NBGが最高の発現プロファイルを示した（p &p < 0.001)。Abdelazizら 9 (CC BY-NC-ND 4.0) より改変。(b) ナノヒドロキシアパタイト (NHAP; 10µg/mL）、NHAP/キトサン複合体（10 µg/mL)、およびNBG（500 µg/mL）対照群と比較して、NHAP/キトサンが最大のHスコアを示した。Elshahatらの報告より改変。4 (CC BY 4.0). (c) Nano-NeoMTA2の評価 (7.9 µg/mL) と NHAP (10 µg/mL) およびコントロールにおいて、Nano-NeoMTでRANKLの発現が有意に上昇していることが示された（Zakiらより改変）。8. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 代表的な免疫蛍光画像およびHスコア解析。(A) 実験群における象牙質基質タンパク質 (DMP-1) 発現の免疫蛍光顕微鏡評価。緑色の蛍光はポリクローナル抗DMP-1抗体の陽性染色を示す。(a) 陰性対照：未分化培地 (UM) 中のヒト歯髄幹細胞 (hDPSCs) は、わずかな細胞凝集体と、淡く均一なDMP-1発現 (+) を示す。(b) 陽性対照：象牙質分化培地 (OM) 中のhDPSCsは、高密度で均一なDMP-1シグナル (++) を伴うコロニーの拡大を示す。(c) ナノヒドロキシアパタイト (10 μg/mL) および (d) Nano-NeoMTA2 (9.92 μg/mL)：分化したhDPSCsは、膜および核に局在する強力かつ均一なDMP-1発現を示す象牙芽細胞様細胞の、大きく融合したコロニーを形成する。倍率：×10。黄色い円は象牙芽細胞様コロニーを示し、黄色い矢印は強力なDMP-1発現を示す。(B) 各研究群における象牙質基質タンパク質発現のHスコア定量化を示す棒グラフ。評価群間で極めて有意な差が認められ、最高スコアはNano-NeoMTA2群 (169.33 ± 4.04) で観察され、次いでナノヒドロキシアパタイト (140.33 ± 2.52)、陰性対照 (15.33 ± 1.53) の順であった。パネルAおよびBはHabibら10 (CC BY-NC)より改変。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
| アッセイ / パラメーター | ナノ材料 / 細胞型 | 代表値（平均値 ± 標準偏差） | 正規化 | ソース |
| 細胞生存率（MTTアッセイ） | ||||
| MTT生存率測定 | Nano-NeoMTA2（7.9 µg/mL) / SCAPs | ~196% (OD = 1.56 ± 0.24) | 未処理コントロールで標準化 (DMEM-NC = 100%) | Abdelazizら⁹ |
| MTT生存率試験 | キトサン-nHA（10 µg/mL) / SCAPs | ~99.97% | 未処理コントロールで正規化 (DMEM-NC = 100%) | Elshahatら⁴ |
| MTT生存率試験 — ポジティブコントロール | OM-PC / SCAPs | 113.46% (OD = 0.93 ± 0.03) | 未処理コントロールで正規化 (DMEM-NC = 100%) | Abdelazizら⁹ |
| MTT生存率試験 — 陰性対照 | DMEM-NC / SCAPs | 100% (OD = 0.82 ± 0.02) — リファレンスベースライン | DMEM-NCを100%と定義する 全群の参照試料 | Abdelazizら⁹ |
| アルカリホスファターゼ (ALP) 活性 | ||||
| ALP活性 | 生物活性ガラスナノ粒子 (500 µg/mL) / SCAPs | 69.86 ± 0.98 U/L | 総タンパク質含量で標準化 (U/mgタンパク質、Bradford法/BCA法) | Abdelazizら⁹ |
| ALP活性 — ポジティブコントロール | OM-PC / SCAPs | 77.68 ± 1.28 U/L | 総タンパク質含量で標準化 （U/mgタンパク質、ブラッドフォード法/BCA法） | Abdelazizら⁹ |
| ALP活性 — 陰性対照 | DMEM-NC / SCAP（骨髄由来間葉系幹細胞） | 55.81 ± 1.6 U/L | 総タンパク質含量で標準化 (U/mgタンパク質、ブラッドフォード法/BCA法) | Abdelazizら⁹ |
| 安全材料濃度 (EC₅₀) | ||||
| EC₅₀ (SCAP) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7.9 µg/mL | 4パラメータロジスティックモデル （非線形シグモイド線量反応、 GraphPad Prism 9) | Zakiら⁸ |
| EC₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / 歯髄幹細胞 | 9.92 µg/mL | 4パラメータロジスティックモデル （非線形シグモイド用量反応、 GraphPad Prism 9) | Habibら10 |
| Hスコア — RANKLタンパク質発現（骨形成マーカー） | ||||
| Hスコア (RANKL) 骨形成マーカー | Nano-NeoMTA2（7.9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 （スケール 0–300） | 1視野あたりの総可視細胞数 （位相差顕微鏡法） | Zakiら⁸ |
| Hスコア (RANKL) 骨形成マーカー | nHA（10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 （スケール 0–300） | 1視野あたりの総可視細胞数 （位相差顕微鏡法） | Zakiら⁸ |
| Hスコア（RANKL） 陽性対照 | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 （スケール 0–300） | 1視野あたりの全可視細胞数 （位相差顕微鏡法） | Zakiら⁸ |
| Hスコア (RANKL) 陰性対照 | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 （尺度 0–300） | 1視野あたりの総可視細胞数 （位相差顕微鏡法） | Zakiら⁸ |
| Hスコア — DMP-1タンパク質発現（歯原性マーカー） | ||||
| Hスコア (DMP-1) 歯原性マーカー | Nano-NeoMTA2（9.92 µg/mL) / 歯髄幹細胞（DPSCs） | 169.33 ± 4.04 （スケール 0–300） | 1視野あたりの総可視細胞数 （位相差顕微鏡法） | Habibら10 |
| Hスコア (DMP-1) 歯原性マーカー | nHA（10 µg/mL) / 歯髄幹細胞 (DPSCs) | 140.33 ± 2.52 （スケール 0–300） | 視野あたりの総可視細胞数 （位相差顕微鏡法） | Habibら10 |
| Hスコア (DMP-1) 陰性対照 | DMEM-NC / 歯髄幹細胞（DPSCs） | 15.33 ± 1.53 （尺度 0–300） | 1視野あたりの総可視細胞数 （位相差顕微鏡法） | Habibら10 |
| Hスコア (DMP-1) 歯原性マーカー [陽性対照 -OM-PC] | 有機分子太陽電池 / 染料感作太陽電池 | Hスコア 〜103 （スケール 0–300） | 視野あたりの総細胞数 （位相差顕微鏡法） | Habibら Eur Endod J, 202610 |
| Hスコア = Σ(i × Pi): i = 染色強度（1、2、または3）；Pi = 各強度レベルにおける細胞の割合（0–100%）；範囲 0–300。MTT生存率は、DMEM-NCを100%の参照値として相対的に的に表記。ALP活性は、p-ニトロフェニルリン酸の酵素的脱リン酸化によるU/Lとして表記し、さらに総タンパク質含有量で標準化した（U/mg protein）。OM-PC = 骨分化/歯分化誘導培地（陽性対照）。DMEM-NC = Dulbecco’s Modified Eagle Medium（陰性対照）。 | ||||
表1：標準化されたin vitro評価ワークフローによる代表的な結果。標準化されたプロトコルを用いて実施された細胞増殖、アルカリフォスファターゼ活性、および免疫蛍光分析を示す、既報の研究からの代表的な定量結果。
| 観察された問題 | 潜在的な原因 | 推奨溶液 |
| MTTアッセイにおける低い細胞生存率 (OD < 未処理対照群) | ナノ材料の濃度がEC₅₀を超えている、あるいはUV滅菌が不十分であるか、またはナノ粒子の分散が不適切である。 | EC₅₀の決定（セクション4）を再実施する。UV滅菌時間を30分まで延長する。プローブ超音波処理（40 W、30秒オン/オフ、3サイクル）により、ナノ粒子懸濁液が均一であることを確認する。 4 °C使用直前に。 |
| MTT生存率CV >反復試行間で15% | ピペッティング誤差、不均一な細胞播種、またはMTT反応のインキュベーション時間や温度の変動。 | すべての添加操作には、校正済みのマルチチャンネルピペットを使用してください。播種前に、血球計数器を用いて播種密度を確認してください。以下で指定する条件にて、4時間の厳密なインキュベーションを維持してください。 37 °C 加湿CO₂インキュベーター内で。バックグラウンド補正用にブランクウェルを含めること。 |
| 不一致なALP吸光度測定値（CV >（ウェル間で20%以内） | 細胞播種密度の不均一、不完全な細胞溶解、または基質添加時のピペッティングの不一致。 | 24ウェルプレートに1ウェルあたり1 × 10⁴個の細胞を厳密に播種する。ライシスバッファーは使用前に十分にボルテックスして混合する。ライシスによるインキュベーション時間は一定（10分間）に維持する。 4 °C（緩やかに揺らす）。セルを含まないブランクウェルを用いてバックグラウンド吸光度を確認する。 |
| RANKL免疫蛍光染色の弱化または消失 シグナル（ステップ 5.4a） | 不適切な保存による抗体の不活性化、過剰固定によるエピトープへのアクセシビリティの低下、または透過処理の不足。 | 使用直前に4%ホルムアルデヒド新鮮に調製する。ブロッキングの前に、0.1% Triton X-100を用いて透過処理（10分間、室温）を行う。一次抗体の希釈倍率を検討する（1:200から開始）。陽性対照として組織切片を含める。凍結融解の繰り返しを避けるため、抗体ストックは分注して保存する。 |
| DMP-1免疫蛍光染色の弱化または消失 シグナル（ステップ 5.4b） | 凍結融解サイクルの繰り返しによる抗体の不活性化、一次抗体の希釈倍率の不適切さ、または二次抗体の宿主種の不適合。 | 凍結融解サイクルを避けるため、抗DMP-1抗体を分注してください。希釈倍率は1:200から開始して滴定してください。一次抗体（DMP-1）と二次抗体のホスト種の適合性を確認してください。DMP-1の陽性対照として、象牙質組織切片を含めてください。 |
| RANKLとDMP-1の間の交差反応性 蛍光チャンネル | 2つの二次抗体に同一の蛍光色素を使用した場合の放出スペクトルの重なり、あるいは蛍光顕微鏡におけるチャネル分離の不十分さ。 | RANKLおよびDMP-1には、スペクトルの異なる二次抗体蛍光色素を使用してください（例：一方のマーカーにAlexa Fluor 488、もう一方にAlexa Fluor 594を使用）。スコア付けを行う前に、各チャネルの二次抗体のみのコントロール画像を個別に確認してください。RANKLおよびDMP-1の画像は、シーケンシャル撮影モードを用いて個別に取得してください。 |
| ～における高い非特異的バックグラウンド 免疫蛍光染色 | タンパク質によるブロッキングの不足、二次抗体濃度の過剰、またはインキュベーション間の洗浄ステップの不十分さ。 | ブロッキング時間を室温で2時間に延長する。二次抗体の希釈倍率を1:1000に上げる。二次抗体のみのコントロール（一次抗体なし）を用いて特異性を確認する。すべてのPBS洗浄が完全に行われていることを確認する（各5分間を3回）。 |
| Hスコアの観察者間変動 (コーエンのカッパ係数 <0.7、ステップ 5.6) | 観察者間における4段階の染色強度スケール（0, 1+, 2+, 3+）の適用における不一致、またはスコアリングセッション前のキャリブレーション不足。 | 正式なスコアリングの前に、代表的なトレーニング画像を用いて合同キャリブレーションセッションを実施してください。すべての観察者に対し、同一の画像表示設定（明るさ、コントラスト）を適用してください。1ウェルあたり最低5つの高倍率視野をスコアし、ドリフトを監視するため、10視野ごとにカッパ係数を算出してください。 |
| EC₅₀曲線が収束しない または適合性が低い場合（ステップ4.1） | データポイントの不足、濃度範囲の狭さ、あるいは播種前の懸濁液の均一化不足。 | 段階希釈の範囲を拡張し、50–から始まる少なくとも6つの濃度を含めるようにしてください。1.56 µg/mL各希釈ステップの直前に必ずプローブ超音波処理を行ってください。少なくとも3回の独立した生物学的反復で再現性を確認してください。変動係数（CV）を確認してください。 <反復試行間で15%である。 |
表2：重要なパラメータおよびトラブルシューティングガイド。プロトコル中に発生する一般的な技術的問題、その潜在的な原因、および実験の再現性とデータ品質を向上させるための推奨解決策。略称：CV = 変動係数、RT = 室温。
ディスカッション
本プロトコルにおける重要なステップは、正確なEC₅₀の決定、ナノ材料懸濁液の均質化、および生物学的アッセイ出力の標準化です。非線形回帰（4パラメータロジスティックモデル）によるEC₅₀の算出は、線形補間よりも厳密な用量反応推定が可能であり、十分なデータポイントが得られている場合に推奨されます13,14。細胞曝露の直前にプローブソニケーションを行い、ナノ粒子懸濁液の均質性を確保することが極めて重要です。分散不十分な懸濁液は、信頼性の低い用量反応曲線をもたらし、EC₅₀の推定値を混乱させます。NeoMTA2のような新規材料の場合、バルクの粒子径は表面反応性およびその後の生物活性を大幅に変化させるため、ナノスケールまで粉砕することが不可欠な最初のステップとなります13,14。安全であると予想される濃度で低い細胞生存率が観察された場合、研究者はEC₅₀アッセイを繰り返す前に、UV滅菌プロトコルを確認し、粉砕および分散手順を再検討する必要があります10。
本プロトコルの根幹となるのは、異なるが重複する分化経路を反映する2つの相補的な免疫蛍光マーカーの使用である。骨芽細胞様細胞におけるRANKLの上昇は、カルシウムイオン駆動の骨形成シグナルを反映しており、骨形成細胞の数に比例する8,9。一方、DMP-1の発現は、象牙芽細胞様分化および象牙質形成活性の特異的な指標として機能するため、標的細胞集団がDPSCである場合に特に重要となる10。H-score法を用いて両方のマーカーを定量化することで、本プロトコルでは、単一の標準化されたアッセイシステム内で骨形成系と象牙質形成系の系譜決定を区別することが可能となり、これは骨形成と象牙質形成の決定を区別できない単一マーカーを用いた手法に対する進歩である。研究間での比較可能性を維持するため、本プロトコルを使用するすべての論文では、RANKLとDMP-1の両方のH-scoreを報告すべきである。研究者は、チャンネルのオーバーラップを防ぐために、2つの二次抗体に対してスペクトルの異なる蛍光色素を使用し、スコアリング前に二次抗体のみのコントロール画像を確認しなければならない。
このプロトコルを別のバイオマテリアルや細胞モデルに適応させる場合、いくつかの手法的な修正が必要になる可能性があります。不透明度が高い、あるいは着色されたスキャフォールドを使用する場合、570 nmにおけるMTT吸光度への干渉が起こる可能性があるため、スキャフォールド材料による光学的な干渉を受けにくいCellTiter-Glo（発光法）やPrestoBlue（レサズリン還元法）などの代替生存率アッセイを検討する必要があります。DPSCではなくSCAPを使用する研究者は、SCAPはより強い骨分化能を反映してRANKLの発現が強くなる傾向がある一方、DPSCはより強い歯牙形成能/象牙質形成能への分化傾向を反映してDMP-1の発現がより顕著になることに留意してください。継代数は重要な変数であり、継代6回以降の細胞は、分化能の低下や表面マーカー発現の変化が見られる可能性があるため、使用を避けるべきです。
本手法の枠組みにおける制限として、評価期間が短期的（72 h）であるため、通常14–21日を要する後期相のミネラル化イベントを捉えられない可能性があることが挙げられます。また、in vivoでの検証が行われていないことは、実用化に向けた大きな課題（translational gap）となっています。H-scoreの使用は観察者間でのばらつきを招く可能性があるため、セクション5.10で報告されている観察者間信頼性（Cohen's kappa）をすべての公開結果に含める必要があります。
このフレームワークは、既存のシングルエンドポイントアプローチに対していくつかの利点を提供します。従来の骨分化アッセイは、アリザリンレッド染色または単一時点のALP活性のみに依存することが多くありました。MTT生存率スクリーニング、ALP活性の定量、およびRANKLとDMP-1の二重免疫蛍光Hスコアリングを単一のワークフローに統合することで、同一の実験条件下で異なるスキャフォールドタイプ間での直接的な統計比較を可能にするマルチパラメトリックな出力を得ることができます。記述された正規化戦略（タンパク質1 mgあたりのALP活性、未処理コントロールに対するパーセンテージとしてのMTT結果、および1視野あたりの総細胞数で正規化したHスコア）により、ウェル間のばらつきによる混乱が排除されます4,8。
今後の研究では、この手法を応用して、炎症マーカーや血管新生反応へのバイオマテリアルの影響、あるいは別の幹細胞モデルの評価を行うことができる。また、このアッセイ手順は3Dスキャフォールド形式にも適応可能である。最終的に、独立した研究室間でこの標準化された枠組みが採用されることで、前臨床的な再生歯科研究におけるスキャフォールドの性能について、有意義なメタ解析的な比較が促進されるであろう15.
開示事項
著者は利益相反がないことを宣言します。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 24ウェル培養プレート | Corning | 3527 | ALPアッセイに使用 |
| 96ウェルプレート | Corning | 3596 | ALP吸光度測定およびMTTアッセイに使用 |
| ALPアッセイキット | Abcam | ab83369 (or equivalent) | アルカリホスファターゼ活性の測定に使用 |
| ALP基質バッファー (2-amino-2-methyl-1-propanol) | Sigma-Aldrich | N/A | ALP触媒反応の開始に使用 |
| 水酸化アンモニウム (NH4OH) | N/A | N/A | ナノヒドロキシアパタイト合成時のpH調整に使用。腐食性あり |
| Anti-DMP-1一次抗体 | N/A | N/A | 歯原性マーカー；ブロッキングバッファーで1:200に希釈；4 °Cで一晩 |
| Anti-human CD44抗体 (CD44-FITC) | Beckman Coulter | N/A | フローサイトメトリーに使用；間葉系幹細胞陽性マーカー |
| Anti-human CD45抗体 (CD45-PC5) | Beckman Coulter | N/A | フローサイトメトリーに使用；造血系陰性マーカー |
| Anti-human CD73抗体 (CD73-PE) | Beckman Coulter | N/A | フローサイトメトリーに使用；間葉系幹細胞陽性マーカー |
| オートクレーブ (水熱反応器) | Tuttnauer | N/A | 140 °C, 0.3 MPaでのナノヒドロキシアパタイトの水熱処理に使用 |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 (or equivalent) | ALP活性の正規化のための総タンパク質濃度の決定に使用 |
| CO2 インキュベーター | Thermo Fisher Scientific | N/A | すべての細胞培養ステップにおいて37 °C、5% CO2に設定 |
| コラゲナーゼ Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | 幹細胞分離時の歯科組織の酵素消化に使用 |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | 基礎培養培地；陰性対照群としても使用 |
| 胎児ウシ血清 (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | 完全培養培地用サプリメント；分化培地にはMSC認定FBSを使用 |
| フローサイトメーター (Navios) | Beckman Coulter | Navios | 幹細胞の免疫表現型解析に使用 |
| フローサイトメトリー解析ソフトウェア (Navios) | Beckman Coulter | N/A | フローサイトメトリーパネルのゲーティングおよびデータ解析に使用 |
| 蛍光顕微鏡 | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | 免疫蛍光イメージングおよびH-score算出に使用 |
| 凍結乾燥機 (リオフィライザー) | Labconco | N/A | −50 °Cでナノ材料沈殿物を乾燥させるために使用 |
| ヤギ抗ウサギ IgG 二次抗体 (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | 蛍光二次抗体；1:500に希釈；室温で1時間 |
| ヤギ抗ウサギ IgG 二次抗体 (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (or equivalent) | A-11012 (or equivalent) | マルチプレックス染色を行う際のDMP-1免疫蛍光に使用するスペクトルの異なる二次抗体 |
| GraphPad Prism ソフトウェア | GraphPad Software | Version 9 | EC50算出および統計解析に使用 |
| 血球計数器 | Neubauer | N/A | 手動細胞計数およびH-score正規化のための総細胞数算出に使用 |
| 倒立位相差顕微鏡 | Olympus | N/A | 細胞の増殖および形態の日次モニタリングに使用 |
| 封入剤、退色防止剤 (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | 免疫蛍光染色の後のスライド封入に使用 |
| MTT試薬 | Invitrogen | M6494 | 細胞代謝活性の評価に使用；0.5 mg/mL, 37 °Cで4時間 |
| ナノヒドロキシアパタイト (NHAP) | Nanogate, Cairo, Egypt | N/A | 湿式沈殿法により合成または市販品を調達；10 µg/mLで使用 |
| NeoMTA2 パウダー | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | N/A | 遊星ボールミルによるNano-NeoMTA2調製の出発原料 |
| 正常ヤギ血清 | N/A | N/A | 一次抗体適用前のブロッキングに使用 (PBSで5%) |
| 骨分化/歯分化培地 | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | N/A | 陽性対照培地；DMEM, FBS, アスコルビン酸, β-グリセロリン酸, デキサメタゾンを含む |
| パラホルムアルデヒド (4%) | Sigma-Aldrich | P6148 | 免疫蛍光前の細胞固定に使用。毒性あり — ドラフトチャンバー内で使用すること |
| PBS (リン酸緩衝生理食塩水, pH 7.4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | 細胞洗浄、抗体希釈、およびナノ材料懸濁に使用 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | 抗生物質サプリメント；完全培養培地で1%で使用 |
| 遊星ボールミル | Retsch (or equivalent) | PM 400 | NeoMTA2パウダーのナノサイズ化に使用；350 rpm, 10時間 |
| p-ニトロフェノール標準液 | Sigma-Aldrich | N/A | ALP活性標準曲線の作成に使用 |
| ウサギ抗RANKL一次抗体 | Abcam | ab9957 | 骨分化マーカー；1:200に希釈；4 °Cで一晩 |
| ウサギ IgG アイソタイプコントロール抗体 | N/A | 免疫蛍光の陰性対照；一次抗体と同濃度のものを使用 | |
| SDS-HCl 可溶化溶液 | Sigma-Aldrich | N/A | MTTホルマザン結晶の溶解に使用。腐食性あり |
| 6ウェル組織培養プレート | Corning | 3516 | 分化アッセイに使用 |
| 水酸化ナトリウム (NaOH), 0.5 M | Sigma-Aldrich (or equivalent) | N/A | 吸光度測定前のALP反応停止に使用。腐食性あり |
| ソニケーター (プローブ / 超音波バス) | Branson Ultrasonics | N/A | 生物学的アッセイ前のナノ粒子分散に使用 |
| T-75 培養フラスコ | Corning | 430641 | 幹細胞の拡大培養に使用 |
| TEOS (テトラエチルオルソシリケート) | N/A | N/A | 45S5バイオアクティブガラスゾルゲル合成のためのシリカ前駆体。引火性あり |
| 透過電子顕微鏡 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | ナノ材料のサイズおよび形態評価に使用 |
| Triton X-100 (PBSで0.1%) | N/A | N/A | 免疫蛍光前の細胞膜透過処理に使用 |
| トリパンブルー溶液 (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | 細胞生存率の評価に使用 |
| X線回折計 (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | ナノ粒子の結晶構造解析に使用 |
参考文献
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