制御発芽と比較培養によるトマト種子関連微生物叢の単離

サマリー

このプロトコルは、標準化された種子表面滅菌と制御された発芽を組み合わせ、種子から苗への移行期におけるトマト種子関連微生物叢の再現性を可能にします。このアプローチは、乾燥種子で過小代表されている培養可能な微生物の回復を促進し、初期の苗木発生における比較培養学的研究を支援します。

要約

表面滅菌は、種子関連微生物を分離する研究において重要でありながら、しばしば最適化されていないステップです。過度に過酷な処理は内因性微生物の個体群を減少または歪めてしまう可能性があるためです。本プロトコルは、既に検証された方法論と制御された種子発芽を組み合わせた表面滅菌条件を用いて、培養可能なトマト種子関連微生物叢を単離する再現性のあるアプローチを提示します。普遍的に最適な滅菌処理を定義するのではなく、バイアスを最小限に抑え内因性微生物集団を保存しながら種子特性に応じて調整可能な標準化された条件を適用するアプローチです。

種子から苗への移行に伴う培養可能な微生物の回復を促進するため、プロトコルには微生物分離前に制御された発芽ステップが組み込まれています。乾燥した未発芽種子のマセレーションに基づく従来のアプローチとは異なり、制御発芽は無菌条件下での種子から苗への移行時に微生物の活性化を促進します。3〜5個の乾燥種子または3〜5個の発芽苗からプールされた生物複製体の比較コロニー形成単位(CFU)解析により、発芽後の培養可能な群落に顕著な変化が見られました。乾燥種子で弱い代表性があった属は発芽後に豊化し、一方で乾燥種子に多く存在していた他の分類群は相対的に代表性が減少し、苗の定着期における初期植物と微生物の相互作用の研究を支持しています。

生物学的複製群全体では、 Stutzerimonas、 Stenottrophomonas、 Priestia などの属は発芽苗から回収された分離株で一貫して豊富に見られましたが、 Paenibacillus は条件を問わず豊富に存在しましたが、種レベルの構成には顕著な変化が見られました。標準化された滅菌条件と制御された発芽および乾燥・発芽物質の比較分析を統合することで、このプロトコルは種子関連微生物群の培養分離に堅牢かつ再現性のある枠組みを提供し、初期の実生発生における機能的関連性を持ち、初期の植物と微生物の相互作用の研究を支援します。

概要

種子は内部組織と外部表面の両方に関連する細菌や菌類からなる多様な微生物群集を保持しています ^1,2,3。これらの微生物は、発芽、苗の確立、生物的および非生物的ストレスへの反応を含む、最も初期の発生段階から植物のパフォーマンスに影響を与えるため、植物生物学の不可欠な構成要素としてますます認識されています(^1,2,3)。生態学的観点から見ると、種子は植物の繁殖のための繁殖体であるだけでなく、微生物接種源の貯蔵庫としても機能するため、植物に関連するマイクロバイオームがどのように開始・維持されるかを理解するための重要な入り口となります^1,2,3。

種子関連微生物は、発芽植物が最初に接触する微生物接種源となる可能性があり、種子から苗への移行期(^1,3,4)におけるマイクロバイオームの組み立てに寄与する可能性があります。この初期接種物は、その後根や他の植物区画に定着する微生物群落に影響を与え、植物の定着やその後の植物と微生物の相互作用に影響を及ぼす可能性があります^1,4。さらに、種子の微生物群の一部は花、胚珠、花粉などの生殖構造を通じて垂直に伝播でき、微生物集団が植物の^世代4.5を超えて持続することを可能にします。この世代間の連続性は、一部の種子媒介微生物が植物の適応度や適応に一貫して寄与している可能性を示唆しています。

機能的には、種子関連微生物は植物ホルモン、抗菌化合物、その他の生物活性代謝物の産生など、植物の発育を調節したり競合他菌や病原体を抑制したりするなど、いくつかのメカニズムを通じて宿主のパフォーマンスに影響を与える可能性があります(^5,6,7)。種子を介して媒介される微生物集団は、資源利用の差異や生態学的分割を通じて共存しているように見え、種子は微生物多様性の受動的な容器ではなく選択的な生息地を表していることを示唆しています⁷。これらの発見は、種子が初期の植物発生に影響を与える可能性のある微生物集団を宿主とし、下流の機能的特徴付けの候補であるという考えを支持しています^。

種子関連微生物を機能的に情報提供し、実験的に扱いやすい方法で調査するには、種子材料から生存可能な微生物集団を回収する必要があります。この文脈で、微生物分離は生きた微生物へのアクセスを提供し、その後実験的に特徴付け、植物と微生物の相互作用に関連する下流のアッセイで評価することを可能にします。これは特に種子システムにおいて重要であり、種子関連微生物が早期の植物定着に寄与し、機能的スクリーニングや将来の応用の候補となる可能性があります。

種子関連微生物の回収は、特に表面滅菌、組織処理、サンプル採取物質の発生段階など、サンプル準備手順に非常に敏感です。この感度は特に種子システムで重要であり、微生物バイオマスが低く、小さな手順の違いがコロニー形成ユニット数や分離組成に大きく影響するからです。これらの変数の中で、表面滅菌は最も重要で最適化が難しいものの一つです。微生物分離前に着生汚染を減らすためには滅菌が必要ですが、殺菌剤への過剰な曝露は内因性微生物の生存率や培養性を低下させる一方で、不十分な滅菌は表面関連の分類群が後続の培養を支配してしまう可能性があります ^8,9,10.したがって、滅菌の目的は化学物質曝露を最大化することではなく、表面由来の汚染を効果的に抑制しつつ、回収可能な内部微生物を保存する最も穏やかな処理を施すこと^です。

滅菌効率は植物種、組織構造、種子被覆特性および関連する微生物群落に依存するため、プロトコルは既に検証済みの方法から選択し^{、研究対象}のシステムに慎重に適応させるべき^です。トマトの種のような低バイオマス材料では、このバランスが特に重要で、過剰滅菌は微生物の回収を著しく低下させる可能性があり、殺菌不足は急速に増殖する表面汚染物質が分離株を支配する可能性を高めます。このため、滅菌効率は仮定するのではなく、定期的に検証されるべきです。最終洗浄水のメッキは残留外部汚染の実用的な制御手段となりますが、この制御は種子や苗の均質菌からの微生物回収と常に併用されるべきです。無菌洗浄制御は得られるものの、回収可能な内部微生物叢がほとんどまたは全くないプロトコルは、最大限の除染ではなく比較微生物分離を目的とする場合には適さない^{場合があります。}

したがって、意味のある比較には強力な手続き的標準化が必要です。低バイオマスサンプルでは、洗浄、移送、均質化、希釈、プレート、または培養の不整合が、微生物の総回収率および個々の分類群の見かけの表現に影響を与えます。これは特に乾燥した材料と発芽した材料を比較する際に重要であり、方法論的な差異が生物学的変化と誤認されやすいためです。

多くの種子微生物学プロトコルの大きな制約は、乾燥した未発芽種子のみを出発材料として依存していることです。これは種子活性化前の微生物分数の有用な基準値を提供しますが、休眠状態、代謝不活性、ストレス状態、または初期に相対的な存在量が低い微生物を過小評価してしまう可能性があります^2,15。

乾燥状態では、種子は生理学的に静かな環境を表し、宿主組織と関連微生物が比較的不活性にとどまることがあります。したがって、乾燥種子から直接回収された微生物集団は、発芽が始まってから回復しやすいものと完全には異なる場合があります。

発芽の過程で種子は水分の吸収、代謝の再活性化、栄養素の動員、組織の再編成を経て、これらすべてが関連する微生物が利用できる局所環境を変化させます(^11,16)。これらの変化は微生物の増殖を促進し、微生物集団の相対的な代表性を変え、乾燥種子で希少または回収が不十分だった分類群の検出や回復を促進します。さらに、根の発芽は微生物の増殖と再分布を支える新たな植物区画を生み出し、種子から苗への移行は^{微生物学解析}において特に有益な段階となります^1,17。

このため、乾燥種子と発芽苗の並行処理は、乾燥種子単独の分析よりも有益な実験設計を提供します。乾燥種子は活性化前に存在する培養可能な個体群の基準を確立し、発芽物質は初期発生時に回収しやすい分類群の比較評価を可能にします。このアプローチは、回収可能な微生物のカタログ作成だけでなく、種子から苗への移行に関連する分類群を特定し、分離株を優先的に下流の特徴付けに優先的に行うことにも特に有用です(図1)。

図1:比較隔離ワークフローの概念的および手続き的概要。 (A) 発芽前の乾燥トマト種子状態の概念的表現。(B) 種子から苗への移行期における発芽トマト種子状態の概念的表現。(C) プロトコルの概略的ワークフロー:種子表面滅菌、すすぎ制御評価、乾燥種子の直接処理または制御発芽、プールされた生物複製体の均質化、連続希釈およびプレート、CFUベースの定量化、分離回収、分類学的同定、乾燥および発芽物質の比較分析。ワークフローで強調される重要な管理ポイントには、滅菌効率、等価生物複製、一貫したプレートおよびCFU分析が含まれます。パネルAとBは、視覚表現のみのためのAI支援コンセプトイラストとして作成されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

このプロトコルは乾燥した物質と発芽した物質からの微生物回収を比較することを目的としているため、厳格な方法論的一貫性が不可欠です。すべての比較は、同じ種子ロット、同一の滅菌条件、同じ培養培地、同等の希釈、プレート、培養手順を用いて行うべきです。このレベルの標準化がなければ、乾燥サンプルと発芽サンプルの見かけ上の差異は、生物学的に意味のある濃縮ではなく技術的な差異を反映している可能性があります。これは特に分離ワークフローにおいて重要であり、回収された分画は生物学的サンプルと実験手順自体の選択効果の両方によって形作られます(^4,15)。

生物学的複製も同様に不可欠です。低個体分類群は種子バッチごとに異なり、低バイオマスサンプルからの微生物回収は、厳密に制御された条件下でも本質的に確率的です。強固な比較のために、各疾患ごとに少なくとも5つの独立した生物学的複製が推奨されます。このワークフローでは、各生物複製は3〜5個の乾燥種子または3〜5個の発芽苗から集められた物質を単一のサンプルとして処理します。さらに、滅菌後の操作はすべて無菌条件下で行うべきであり、二次汚染を最小限に抑え、得られた分離株セットの解釈可能性を保つ必要があります。

発芽期間も慎重に選ぶ必要があります。その長さは、根の発芽と早期の苗の発育を可能にするほど長くなければなりませんが、後期の成長が種子から苗への移行に伴わない追加の生態学的複雑さをもたらすほど長くは必要ありません。トマトの場合、不菌条件下で最大5日間の発芽期間が実用的に有効であり、その間、苗は種子環境と密接に結びつきながら、早期の微生物活性化と再分布がすでに起こることが可能です。実験間での一貫したタイミングは不可欠です。なぜなら、発生段階の違い自体が微生物の回復パターンに影響を与える可能性があるからです。このワークフローは、標準化された条件下で発芽関連シフトを評価することを目的とする場合、低バイオマス種子システムからの培養可能な微生物叢の比較回収に最も適しています。種子マイクロバイオームの総多様性の直接推定や、より広範な微生物群集を捉えるために培養に依存しないアプローチが必要な実験システムにはあまり適していません。

このプロトコルの目的は、標準化された表面滅菌と制御された種子発芽を統合することで、培養可能なトマト種子関連微生物群の分離のための再現可能な枠組みを提供することです。この手法は、3〜5個の乾燥種子または3〜5個の発芽苗からプールされた生物的複製を用いて、発芽依存的な群落形成単位(CFU)回復および分類学的組成の変化を評価することを可能にします。種子から苗への移行期における滅菌バイアスを最小限に抑え、微生物の回復を促進することで、初期苗の発生時に機能的に関連性のある微生物の分離を促進し、初期の植物と微生物の相互作用の下流研究を支援します。

プロトコル

1. 試薬、培地、滅菌材料の調製

1. 滅菌蒸留水を使って70%(v:v)のエタノール溶液を準備します。
2. 市販漂白剤から20%(v:v)の作動溶液を、5%の次亜塩素酸ナトリウムを含む20 mLの漂白剤を80 mLの滅菌蒸留水に希釈して作製します。
3. 洗浄工程には滅菌蒸留水を用意してください。
4. 均質化および連続希釈のために無菌0.45%NaClを準備し、この溶液をワークフロー全体で一貫して使用してください。
5. ルリア・ベルタニ(LB)寒天培地(1リットルあたり:トリプトン10g、酵母抽出物5g、NaCl10g、寒天15g)を準備し、事前に無菌条件下でプレートを注ぎます。
6. 滅菌後に種子や苗に接触するすべての器具(鉗子、乳棒、スプレッダー、ハサミ、チューブラックなど)は、オートクレーブまたは認証済み無菌処理で滅菌してください。
7. 種子取り扱いを始める前に、無菌のペトリ皿、チューブ、ピペットチップ、培養皿を層流フード内に並べてください。
   注意:種子関連の微生物バイオマスが低い可能性があるため、不要な取り扱い時間を最小限に抑え、滅菌開始前にすべての材料を準備することが重要です。化学処理、洗浄、メッキ、発芽準備の遅れは、回収にばらつきが生じることがあります。他の実験システムでも代替の無菌バッファーが使用されることがありますが、比較実験全体では単一のバッファーを保持する必要があります。Reasonerの2A(R2A)や選択培地などの追加培地も拡張された培養学ワークフローに含まれることがありますが、ここで述べた比較プロトコルの標準培地としてLB寒天が使用されました。

2. 種子の選択と配分

1. 可能な限り、実験ごとに単一のトマト種の種を使いましょう。
   注:ここで説明する代表的なワークフローでは、各実験全体で1つの種子ロットのトマト種子が使用されました。Money Maker。
2. 種子を目で確認し、損傷した種や目に見える割れた種、奇形の種は捨ててください。
3. 種子を研究に必要な実験群に分けます。最低限、種子は以下の通りに割り当ててください:滅菌後の乾燥種子分離、発芽後から苗の分離。
4. 複数の滅菌条件を試験する場合は、種子の大きさや状態による処理バイアスを避けるために、滅菌処理ごとに種子をランダムに割り当ててください。
   注:すべての下流比較は、同じ種子バッチを並行処理した場合により強力です。ワークフローは他のトマトの遺伝子型や品種にも適用可能ですが、実験内の比較は単一の種子ロットを並行処理して行うべきです。

3. トマト種子の表面滅菌

1. 層流フード内の各滅菌2mLマイクロ遠心分離管に3〜5個の種子を移します。
2. 1本のチューブに70%(v:v)のエタノール1mLを加え、種子を完全に浸します。
3. チューブを5分間孵化させ、チューブローターで25回転で優しく混ざらせます。
4. 滅菌ピペットでエタノールを完全に除去します。
5. すぐに各チューブに20%(v:v)の次亜塩素酸ナトリウム作業液1mLを加え、種子を完全に浸します。
6. チューブを10分間孵化させ、チューブの回転数25回転で優しく攪拌します。
7. 滅菌ピペットを使って次亜塩素酸ナトリウム溶液を完全に除去します。
8. 種は1回の洗浄で1mLの滅菌蒸留水で3回洗います。
   1. 洗浄ごとに滅菌水を加え、30秒ほど優しく混ぜ、種を30秒ほど沈殿させ、洗浄液を完全に除去してから新鮮な滅菌水を加えます。
9. 各チューブの最終洗浄水は滅菌効率の管理のために保持してください。
10. 滅菌された種子は、すぐに乾燥種子として処理するか制御発芽に使うかに応じて、無菌のペトリ皿または無菌チューブに移します。
    注意:次亜塩素酸ナトリウムは適切な個人用防護具を使用して取り扱い、施設の化学物質安全手順に従ってすべての手順を行ってください。
    注:ここで使用されたエタノール-次亜塩素酸ナトリウム配列は、以前に検証された滅菌ワークフローに基づき、トマト種子の標準作業条件として選ばれました。比較実験に含まれるすべてのサンプルに対して同じ滅菌条件を用いてください。複数の滅菌体制を評価する場合は、各処理を並行させ、各疾患ごとに独立して滅菌効率を評価します。最終洗浄から下流処理までの時間を最小限に抑え、微生物の回復の変動を減らしましょう。

4. 滅菌効率の検証

1. 最終洗浄水を無菌0.45%NaClで10倍に連続希釈し、100μLのすすぎ水を900μLの希釈液に移し、同じ工程を連続して^10-4まで繰り返します。各希釈物を100μLをLB寒天にプレートし、乾燥種子および発芽苗均質菌に適用するのと同じプレート法を用います。
2. プレートを28°Cで24〜48時間培養します。
3. 培養後はプレートの菌株成長を点検してください。
4. 各希釈ごとにコロニーの有無を記録します。コロニーが存在する場合は、希釈レベル、おおよそのコロニー数、目に見えるコロニー形態を記録します。
   注意:実験全体を通じて同じプレート量とフォーマットを使用して、洗浄対照と生物学的サンプルの直接比較が可能です。希釈されていないまたは最も希釈された洗浄プレートでコロニーが検出されない場合は、培養条件下で検出可能な成長がないと記録します。

5. 乾燥(発芽していない)種子の処理

1. 生物的複製1個に相当する3〜5個の滅菌済み乾燥種子を、無菌2 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移し、そのチューブには1 mLの無菌0.45% NaClを含みます。
2. 種子を均質化し、無菌の使い捨て乳棒で種の組織が目に見えて破壊され、完全な種子構造が残らないまで続けます。
3. ホモジネートを30秒間渦巻きさせて微生物細胞を均一に再懸濁させます。
4. 無菌0.45%NaClでホモジネートを10倍連続希釈し、最初の希釈のために100μLホモジネートを900μLの希釈液に移し、同じ比率を連続して^10-6まで繰り返します。
5. 選択された希釈物の100μLをスプレッドプレートを用いてLB寒天にプレートします。
6. プレートを28°Cで24〜72時間培養します。
7. 下流のCFU推定と分離回収のために、希釈範囲に対応するプレートを選択し、分離および可算コロニーを得ます。
8. 複製間の成長パターンの違い、コロニーの総数、可視化された形態型を記録します。
   注意:同じ培養培地、希釈方法、プレート容量、培養条件を用いて、発芽苗サンプルと並行してドライシード処理を行うこと。ここで説明する比較ワークフローの標準培地としてLB寒天が使用されました。成長遅い分類群のより広範な回復が必要な場合、追加の培地を拡張分離ワークフローに組み込むことがあります。

6. 滅菌種子のアクセン発芽

1. 滅菌種子はムラシゲやスクーグ(MS)寒天培地などの無菌発芽支持材に置きます。
2. 芽が出た苗同士の接触を避けるため、均等に種まきを散らします。
3. 外部汚染を減らしつつ通常の発芽を可能にする実験室用シーリングフィルムまたは同等の材料でプレートを密封します。
4. 暗闇の中、25°Cでプレートを水平に孵化します。
5. 種子は無菌状態で発芽させ、早期根の定着がはっきり見えるまで待ちます。代表的な実験では、これは5日間の潜伏に対応しました。
6. プレートを定期的に点検し、汚染、異常発芽、過剰な結露の兆候がないか確認してください。
   注:発芽条件は複製ごとに一定に保つべきです。発芽期間や苗の段階の変化は、研究対象の効果とは独立して微生物の回復に影響を与えることがあります。他の無菌発芽サポート(フィトアガープレートや滅菌モイストフィルターペーパーなど)も、各実験内でサポートが一定であれば、適応されたワークフローで使用可能です。発芽容器によっては別のプレート向きがインキュベーションに使われることもありますが、実験内での向きは一定に保つべきです。(間)発芽苗は必要に応じて4°Cで短時間保持して処理してもよいですが、可能な限り即時処理が望ましいです。

7. 発芽苗からの微生物の分離

1. 発芽した苗木は、層流フード内で滅菌鉗子を使って採取します。
2. 3〜5株の発芽苗からプールされた物質を、生物複製1個に相当し、無菌の2 mLマイクロ遠心分離機チューブに移します。
3. 各チューブに1mLの滅菌0.45%NaClを加えます。
4. 無菌の使い捨て乳棒を使って、芽生えた根と残存する種子組織の両方を含めて、組織が目に見えるほど破壊されるまで、溜まった苗木を徹底的に均質化します。
5. ホモジネートを30秒間ボルテックスして微生物細胞を均一に放出し再懸浮させます。
6. 無菌0.45% NaClでホモジネートを100μLの希釈液に移し、最初の希釈時に同じ比率を連続して^10-4まで繰り返し、0.45%NaClで10倍連続希釈します。
7. 選択された希釈物の100μLをセクタープレートでLB寒天にプレートし、ドロッププレートを施します。
8. プレートを28°Cで24〜72時間培養します。総コロニー数、目に見えるコロニー形態型、乾燥種子サンプルとの差を記録します。
   注意:1つの生物複製を3〜5株の発芽苗からプールした物質と定義し、すべての複製を同じ希釈方法、プレート量、培養培地、培養条件を用いて並行処理します。発芽苗サンプル間の一貫性を維持するために、残存種子組織と発芽根の両方を均質質に含めます。

8. コロニーカウントと分離回収

1. 培養後、計数可能で十分に分離されたコロニーが得られる希釈プレートを選択します。CFU推定には30〜300コロニーを含むプレートを使用します。
2. 選択したプレート上のコロニー数を数え、生物学的複製あたりのCFUを以下の式で計算します。
   複製あたりのCFU=(希釈係数×コロニー数)/プレート体積(ミリリットル)
   1. 同じ希釈から複数のプレートを使用する場合は、その希釈の平均コロニー数を計算してから式を適用してください。
3. 標準化された記述子を用いて、サイズ、形状、色、辺、高さ、不透明度などのコロニー形態を記録します。
4. 下流の分離のためにコロニーを選択し、サンプリングバイアスを最小限に抑えましょう。コロニー数が少ない場合は、すべての識別可能な形態型を選択し、コロニー数が多い場合はプレート全体で複数のコロニーをランダムに選択します。
5. 選ばれたコロニーを新鮮なLB寒天プレートに再ストリークし、純粋な培養を得ます。
6. 各分離株がプレート上で均一なコロニー形態を示すまで、繰り返し再ストリークを繰り返します。
   注:CFU値が生物複製ごと、単位バイオマスあたり、または他の正規化手法を用いて表現されているかを明確に報告してください。バイオマスベースの正規化を含む追加の正規化手法が適用される場合は、データ解析のセクションで計算方法を明示的に説明してください。

9. 精製分離株の保存

1. 純粋なコロニーを液体LB培養培地に接種し、目に見える成長が得られるまで培養します。
2. 標準的な微生物学的慣習に従い、無菌80%グリセロールと1:1、v:vを混合培養します。
3. クリオストックは-80°Cで保存します。
4. 各分離株については、サンプルの起源、複製回数、状態(乾燥種子または発芽苗)、滅菌処理、分離日、プレート培地、コロニー形態、下流の同定状況などを含むデジタル記録を保持してください。
   注:種子段階、処理、生物学的複製にリッチングパターンを紐付けるためには、正確な分離株メタデータが不可欠です。

10. 分離株の分子同定

1. 製造元の指示に従い、細菌DNA抽出キットを用いて精製された細菌培養からゲノムDNAを抽出します。
2. 細菌の16S rRNA遺伝子は、V5-V8の超可変領域またはほぼ全長の16S rRNA遺伝子のいずれかを用いて増幅します。
   1. V5–V8領域(~700 bp)の増幅には、プライマー799F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)および1392R(5′- ACGGGCGTGTGTGTRC-3′)を使用します。
   2. ほぼ全長の16S rRNA遺伝子(~1500 bp)を増幅するには、プライマー27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)および1492R(5′-GGTTACCTGTGTTACGACTT-3′)を使用します。
   3. 各ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を最終体積25μLでPCRマスターミックス、各プライマー0.4μM、テンプレートDNA1μLを用いて準備します。
   4. サーマルサイクラーで以下の条件下で動作します:95°Cで2分間の初期変性;95°Cで変性を40サイクル3秒、45°Cでアニーリングを30秒、72°Cで2分間伸縮を繰り返す。その後、72°Cで7分間の最終延長が行われました。各PCRランにテンプレートなしコントロールを含めてください。
3. 1%アガロースゲルで電気泳動でPCR産物を検証し、ゲル電気泳動およびイメージングシステムを用いてアンプリコンを可視化します。
4. 製造元の指示に従い、PCRクリーンアップキットを使用してPCR産物を精製し、精製アンプリコンをサンガーシーケンスに提出してください。
5. 品質チェック、トリミング、必要に応じて完成した配列を組み立てます。
   1. 各配列を、BLASTn(非常に類似配列のためのメガブラスト設定)を用いて国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のヌクレオチドデータベースと比較します。
   2. 最も支持度の高いヒットを使って分類を割り当ててください。最良のヒットが十分なアラインメントカバレッジと少なくとも94.5%の配列同一性を示す場合、分離株を属レベルに割り当てます。
   3. 暫定的な種レベルの割り当ては、最良のヒットが少なくとも98.7%の配列同一性を示し、高いクエリカバレッジを示し、近縁種間で矛盾しないトップマッチがない場合のみ使用してください。
   4. 繰り返し増幅が失敗したり配列の品質が不十分な場合は、分離株を未識別として記録します。16S rRNAの類似性だけでは近縁な細菌種を解消できない可能性があるため、すべての種レベルの割り当ては暫定的なものとして扱い、必要に応じて系統解析やゲノム解析で確認してください。
6. 最高支援される分類学的解像度でアイソレート同一性を報告します。これらの同定を用いて形態学に基づくグルーピングの検証や、下流のゲノム解析および機能解析のために代表的な分離株の優先順位付けを行います。
   注:この分子同定ステップは、分離分類と代表株選択を支援することを目的としています。この方法を用いて、群集構造や処理をまたぐ定量的な個体分布パターンを推定するのに使うべきではありません。

11. データ分析

1. 各条件につき少なくとも5つの生物学的複製を用いて実験を行う。
   注:このワークフローでは、各生物複製は3〜5個の乾燥種子または3〜5個の発芽苗から集められた材料を1つのサンプルとして処理します。
2. 各条件について、(i) CFU回収総数、(ii) 可視化コロニー形態型の数、(iii) 精製分離株数、(iv) 回収された培養可能な微生物叢の属レベルおよび該当する場合は種レベルでの分類学的構成を定量化します。
3. 乾燥種子と発芽苗のサンプルを比較し、発芽依存的な総回復および分類組成の変化を評価します。
4. 各分類群の相対的な代表を、各条件下で回収されたCFUの総回収率の割合として計算します。絶対CFU値を用いてフォールド変化を計算します。
5. 適切な統計解析ソフトウェア(例:GraphPad Prism [v11.0.2])を使って定量データを解析してください。平均±標準偏差(SD)としてデータを報告してください。
   1. 乾燥種子サンプルと発芽苗サンプルのペアワイズ比較では、データが正規性の仮定を満たす場合、両側の学生t検定を用います。
   2. これらの仮定が満たされない場合は、マン・ホイットニーU検定を用います。p < 0.05で統計的に有意な差を考えます。
6. 表示される各値が絶対CFU、相対CFU由来のパーセンテージ、または絶対CFU値から計算されたフォールド変化に対応しているかを明確に報告してください。
   注意:研究全体を通じて同じ計算基準を使用して、乾燥種子と発芽苗のサンプルを直接比較できるようにしてください。分類学的構成を示す際は、属レベルか種レベルかを明確に示してください。

12. 重要な品質管理ポイントとトラブルシューティング

1. 無菌最終洗浄だけでは、選択された滅菌方式が実験目的に最適であることを示すものではありません。外部汚染を抑えつつ、内部または種子に密接に結合した菌株の回収を保つこと。洗浄効果と乾燥種子および発芽苗均質菌からの微生物回復を解釈します。
2. 乾燥サンプルと発芽サンプルの両方で回収が低い場合は、過剰滅菌、過度に過酷な均質化、不適切な培養条件、またはサンプル処理の遅延を示す可能性があります。これらの場合、滅菌時間が一貫して適用されているか、組織破壊が十分かつ過剰でないこと、希釈、プレート化、培養がサンプル全体で即時かつ同じ条件下で実施されているかを確認しましょう。
3. 洗浄制御における高い汚染や少数の菌株による急速な過剰増殖は、殺菌不十分または殺菌後の取り扱い時に汚染が導入されていることを示す可能性があります。このような場合、滅菌のタイミング、洗浄手順、無菌取り扱い、層流フード内の材料の整理状況を確認してから実験を繰り返します。
4. 発芽段階、生物複製構造、培養培地、希釈方法、プレート量、培養条件が実験全体で標準化されている場合のみ、乾燥サンプルと発芽サンプルの違いを生物学的に解釈します。
5. 低バイオマス種子材料を扱う場合、ある条件下で特定の分類群が見かけないのは、真の不在ではなく過小サンプリングを反映している場合もあります。このため、発芽に関連するシフトを強固に解釈するために、一貫した複製処理と分離レベルの同定を行う必要があります。

13. 他のアプローチのためのサンプル保存

1. 滅菌効率の検証後、メッキ前に、各乾燥種子または発芽苗均質体各200μLアリコートを無菌1.5mLのマイクロ遠心分離機管に移します。
2. 各チューブにサンプルの種類、生物学的複製数、処理状態、採取日をラベル付けしてください。
3. アリクオートはすぐに冷凍し、-80°Cで保存し、下流分析で使用するまで保管してください。
4. 保存された均質物質は、DNAベースの分析、顕微鏡検査、または同じ開始生物学的複製を必要とする確認実験などの補完的なアプローチに活用します。
   注意:アリコートは希釈およびメッティング前に保管し、元の均質組成を保つこと。複数の下流解析を計画する際には、別々のアリクオートを準備することで、繰り返される凍結・融解サイクルを避けましょう。

結果

表面滅菌の実施および外部汚染の制御
既に検証された方法に基づく標準化された条件を用いた表面滅菌は、種子由来物質から培養可能な微生物の回収を保つと、外部微生物汚染を効果的に減少させることに成功しました。最終的な洗浄水の板付けでは、検出可能なコロニー成長はなく、使用された条件下で表面関連微生物の効果的な除去が認められたことを示しました。

重要なのは、洗浄対照で微生物の増殖がなかったにもかかわらず、乾燥種子や発芽苗均質菌からの回収可能な微生物の喪失を伴わなかったことです。これは、適用される滅菌条件が外部汚染を効果的に最小限に抑えつつ、加工種子から培養可能な微生物の回収を妨げないことを示しています。これらの観察結果を総合すると、このプロトコルは滅菌効率と下流微生物回収の意図したバランスを達成したことを示しています。

乾燥種子からの培養可能な微生物叢の回収と組成の制限
滅菌された乾燥で発芽し...

ディスカッション

ここで示した結果は、標準化された表面滅菌と制御された種子発芽の統合が、種子関連微生物叢の培養学的分離に強固な枠組みを提供することを示しています。このプロトコルの重要な成果は、外部汚染物質の効果的な除去と内因性微生物集団の保存のバランスを取る能力です。このバランスは培養研究において重要であり、過度に厳格な滅菌は微生物の回復を妨げ、不十分な滅菌は着生微生物の増殖によるバイアスを生じさせる可能性があります(^6,16)。普遍的に最適な滅菌条件を定義するのではなく、このプロトコルは種子特性や実験目的に応じて調整可能な既に検証された方法論に基づくアプローチを採用し^{ています。}これらの結果は、ここで用いられた標準化された条件が外部汚染を最小限に抑えつつ、培養可能な微生物の回復を維持したことを示しています。

種子は植物関連微生物叢の重要な入り口であり、成長初期から植物の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガー	Sigma-Aldrich	01916-500G	LBアガー培地の成分; 15 g/L.
オートクレーブ	Lab1st	SV120H	器具や材料の滅菌や無菌処理の検証に使用。
細菌DNA抽出キット	Promocell	PK-MB708-206-100	DNA抽出
コロニー数え/記録セットアップ	OCS	B079Y5W57N	CFU、形態型、プレートの違いを記録するために必要; 原稿ではカウンター/モデルは指定されていない。
凍結保存バイアル	Sigma-Aldrich	Z359033	グリセロール株の-80 °Cでの保存に推奨; 明示的に名前は付けられていないが、保存手順に必要。
デジタル分離記録システム	原稿には記載されていない	該当なし	分離のメタデータを記録するために使用: 起源、複製、条件、滅菌処理、分離日、プレート培地、形態、同定状況。
エタノール	VWR	83813440	種子の表面滅菌用70% v/vエタノール溶液の調製に使用。
濾紙	Fisher Scientific	11718772	発芽サポートのオプションの代替品。
鉗子/ピンセット	Sigma-Aldrich	930229	種子の移動や発芽した苗の収集に使用。
ゲノムDNA抽出キット	PromoCell	PK-MB708-206-100	精製された細菌培養物からゲノムDNAを抽出するために使用; 正確なキット/方法は指定されていない。
グリセロール、無菌80%	VWR	24388364	液体培養液と1:1 v/vで混合して凍結ストックを調製。
ラミナーフローフードBio48	Faster	LAB-CAP-22	無菌種子の取り扱い、滅菌移送、無菌材料の準備に必要。
LBアガー培地	VWR	846495000	比較培養に使用する標準培地; 1リットルあたり: 10 gのトリプトン、5 gの酵母エキス、10 gのNaCl、15 gのアガー。
マイクロ遠心管	Ratiolab	RATI5615000	種子の滅菌とサンプル処理に使用。
MS培地	Sigma	M0404-10L	無菌発芽用の発芽サポートとして言及。
NZYTaq II 2×マスターミックス	Nzytech	MB35803	PCR増幅用ミック
パラフィルム	Parafilm/Merck	HS234526A	発芽プレートを密閉し、汚染を減らすために使用。
ペトリ皿	Labbox	PDIP-E9N-500	発芽セットアップ、プレート化、無菌種子の取り扱いに使用。
ファイトアガー	Duchefa Biochemie	9002-18-0	オプションの代替無菌発芽サポートとして言及。
ピペットセットとチップ	Merck	EP3123000918-1EA	滅菌溶液の除去、洗浄、希釈、プレート化に使用。
R2Aアガー培地	HI-MEDIA	M1743-500G	拡張された培養工程用の追加培地のオプション。
塩化ナトリウム、NaCl	Fisher Chemical	10040460	均質化と連続希釈用の無菌0.45% NaClの調製に使用; LB培地の成分でもある。
次亜塩素酸ナトリウム	Carlo Erba	370323	種子の表面滅菌用20% v/v次亜塩素酸ナトリウム溶液の調製に使用。腐食性; 個人用防護具が必要。
滅菌使い捨てピストル	Eppendorf	EP0030120973	乾燥種子と発芽苗の均質化に使用。
ボルテックスミキサー	Fisher Scientific	15901137	ホモジネートの微生物細胞を再懸濁するために使用。