方法論記事

ゼブラフィッシュ神経芽細胞腫モデルを用いた腫瘍微小環境における免疫細胞のイメージングおよび定量化

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DOI:

10.3791/72028

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2026年9月18日

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1Departments of Pharmacology and Medicine, Section of Hematology and Medical Oncology, The Cancer Research Center, Boston University School of Medicine, 2Tulane University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、複合トランスジェニックゼブラフィッシュの作製方法、幼魚および成魚ゼブラフィッシュにおける腫瘍関連免疫細胞のイメージング方法、および腫瘍微小環境内における免疫細胞頻度の定量化について解説します。

要約

腫瘍微小環境（TME）への免疫細胞の集積は、免疫調節および腫瘍進行における重要な要素です。生体内における免疫細胞と腫瘍細胞の空間的および時間的関係を研究することは、TME内の相互作用に関する洞察を得るための有用な手段となります。しかし、従来のイメージングや組織学的アプローチを用いて、完全な生体内でこれらの相互作用を可視化し定量化することは依然として困難です。ゼブラフィッシュは、遺伝的操作の容易さ、迅速な発生、および初期発生段階における光学的な透明性により、蛍光標識された細胞のin vivo可視化が可能であるため、がん研究において価値のあるモデルとなります。本稿では、神経芽細胞腫のゼブラフィッシュモデルにおいて、異なる蛍光マーカーで標識された免疫細胞および腫瘍細胞を生成、同定、イメージングし、定量化するためのプロトコルを提示します。このプロトコルには、複合トランスジェニックゼブラフィッシュの交配とスクリーニング、幼魚のライブイメージング、成魚の腫瘍担がん魚の調製とイメージング、および腫瘍領域の周囲および内部における免疫細胞の定量化が含まれます。トランスジェニックレポーターラインを用いることで、CD4+免疫細胞およびMYCN駆動の神経芽細胞腫細胞を、異なる発生段階で可視化および分析することが可能です。このワークフローにより、幼魚と成魚の両方において、腫瘍に対する免疫細胞の局在を評価でき、疾患のステージ間での免疫細胞数の比較に利用できます。本プロトコルは、ゼブラフィッシュを用いてTME内の免疫細胞をin vivoでイメージングおよび定量化するための再現性のある手法を提供し、他のがんモデルにおける免疫・腫瘍相互作用の研究を促進することが期待されます。

概要

腫瘍微小環境（TME）は、腫瘍細胞、免疫細胞、線維芽細胞、および血管細胞で構成されるエコシステムである1。TMEは、がんの進行、治療反応、および抗腫瘍免疫において不可欠な役割を果たしている。TME内において、免疫細胞は腫瘍の運命を決定する重要な調節因子であり、抗腫瘍応答への参加または免疫抑制の誘導のいずれかを行う2。TME内における免疫細胞のリクルート、分布、および機能を理解することは、腫瘍が免疫監視を回避するメカニズムを解明するために極めて重要である。しかし、エンドポイント組織学、フローサイトメトリー、シングルセルシーケンシングなどの従来のTME研究手法は、静的なスナップショットしか提供できず、しば組織構造の破壊を伴うため、空間情報や細胞間相互作用が失われるという課題がある3,4,5,6,7。さらに、これらの手法では、特に腫瘍発生の初期段階において、TME内の免疫細胞を可視化し定量化する能力に限界がある。

ゼブラフィッシュ (Danio rerio) は、低コストであること、発生が速いこと、相対的に透明であること、そして遺伝的に高度に保存されていることから、がん研究における強力なモデル生物となっています8,9。これらの利点により、再現性と拡張性のある実験系が提供され、短期間で大規模なサンプル数での試験や効率的な顕微鏡スクリーニングが可能になります10。重要な点として、ゼブラフィッシュは自然免疫と獲得免疫の両方の主要構成要素を含め、ヒトと重要な免疫学的保存性を共有しており、得られた知見をヒトの疾患に関連付けることができます1。これらの特性は、神経芽細胞腫などの小児がんの研究に特に有用です8。その結果、数多くのゼブラフィッシュ免疫レポーター系統やがんモデルが開発されてきました1。したがって、ゼブラフィッシュは腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用を研究するための貴重な in vivo モデルとして機能し、特に初期段階において免疫調節がどのように腫瘍の発達を形成するかについての洞察を提供します。

ゼブラフィッシュにおけるTMEを調査した先行研究では、腫瘍内の免疫細胞の局在を評価するために、腫瘍ゼノグラフトモデルとエンドポイントイメージングの組み合わせに大きく依存してきました12,13,14,15,16,17。これらの手法は有用な知見を提供しますが、2次元イメージングに依存しているため、TMEの3次元的な構成や、発生過程における腫瘍細胞と免疫細胞の空間的関係を完全に捉えることはできません14。加えて、腫瘍ゼノグラフトモデルはヒト腫瘍細胞を人工的に移植するため、自然な腫瘍発生を完全には再現できない可能性があります18。また、これらのモデルは通常短期間であり、腫瘍の進行や、発生過程における腫瘍と免疫細胞の空間的関係の変化を十分に捉えることができません14,19。さらに、このアプローチでは、TME内における免疫細胞挙動の空間的構成、発生学的コンテキスト、および生理学的妥当性の提示が限定的です。最近、我々および他の研究グループは、腫瘍細胞と免疫細胞を異なる蛍光マーカーで標識した複合トランスジェニックゼブラフィッシュを適用し、腫瘍に関連する免疫細胞を可視化しました20,21。これらの複合トランスジェニック魚を用いることで、個体および腫瘍の発生全般にわたるTMEの研究が可能となり、in vivoでの免疫細胞と腫瘍の相互作用の調査が促進されます。

本稿では、ゼブラフィッシュ神経芽細胞腫モデルの腫瘍微小環境（TME）における免疫細胞を研究するために、共焦点顕微鏡を利用した手法を提示します。このアプローチでは、免疫細胞を標識するゼブラフィッシュレポーターラインと、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼプロモーター（dβh）の下でヒトMYCNオンコジーンを過剰発現させ、ヒトの疾患に類似した神経芽細胞腫を発現させた遺伝子組換えゼブラフィッシュラインを使用しました20。この複合トランスジェニックゼブラフィッシュモデルでは、腫瘍細胞と免疫細胞がそれぞれEGFPおよびmCherryで差別的に標識されています。dβhプロモーターは交感神経副腎系細胞で活性化しており、複数のゼブラフィッシュ神経芽細胞腫モデルで使用されています2,23,24,25。さらに、CD4+細胞を可視化するために、mCherry蛍光を駆動させるCd4プロモーターを利用しました15。Zスタック取得による共焦点イメージングを適用し、腫瘍 perkembanganの異なる段階におけるTMEを三次元的に可視化することで、無傷の組織内における腫瘍細胞と免疫細胞の空間的関係の評価を可能にしました。本手法により、腫瘍 perkembanganの異なる段階における、腫瘍細胞に対する免疫細胞の組織化の解析が可能になります。

プロトコル

すべての動物実験は、ボストン大学チョバニアン＆アベディシアン医学部の施設動物ケアおよび使用委員会（IACUC）により、プロトコルPROTO2021001に基づいて承認されました。複合トランスジェニックゼブラフィッシュの作製、幼魚のイメージング、成魚組織の調製、および画像解析の全体的なワークフローを図1にまとめます。

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図1ゼブラフィッシュの腫瘍微小環境（TME）内における免疫細胞の可視化および定量化のワークフロー。 実験ワークフローの概略図。免疫レポーターゼブラフィッシュと腫瘍形成傾向のあるゼブラフィッシュを交配させ、免疫細胞（赤）と腫瘍細胞（緑）の両方で蛍光マーカーを発現する複合トランスジェニック個体を生成した。胚を蛍光顕微鏡でスクリーニングし、複合トランスジェニック魚を特定した。選別された個体は、幼魚期の発生過程における生体共焦点イメージングに供された（<受精後21日（21 dpf）までとするか、あるいは21 dpfより高齢の魚については、固定、凍結切片作成、および共焦点イメージングにより処理します。このワークフローにより、複数の発生段階における腫瘍微小環境（TME）に関連する免疫細胞の可視化および定量化が可能になります。イラストの一部はBioRenderを使用して作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 交配による複合トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の作製

  1. 自然交配のため、生後3か月以上の成体免疫レポーター魚および腫瘍魚を選択する。
    注：代表的な結果を得るために、免疫細胞と腫瘍細胞を区別してラベル付けできるよう、Tg(cd4-1:mCherry)ヘテロ接合体魚とTg(dβh:MYCN; dβh:EGFP)ヘテロ接合体魚を交配させた15,23。
  2. 交配の前夜に、2室式交配タンクの3分の2まで魚用飼育水を満たす。
  3. 交配室に格子状のトップインサートを設置する。仕切りを使用して、オス1匹とメス1〜2匹を分離させる。
  4. 仕切りを置いたまま一晩放置する。自然な交配条件を再現するため、水草やその他のエンリッチメントアイテムを追加する。
    注：腫瘍オス魚と免疫レポーター魚を交配させる場合、オスとメスの比率を1:2にすると、産卵成功の可能性が高まる。オス同士の競争が起こる可能性があるため、オス2匹とメス1匹で交配させてはならない。
  5. 翌朝、施設内の照明が点灯した後に仕切りを取り除く。
  6. 仕切りを楔として使用し、格子状のトップチャンバーをわずかに傾けて浅い水域を作る。少なくとも1時間、魚に産卵させる。
  7. 飼育水を細かいメッシュネットで濾して、交配室の底から卵を回収する。
  8. 卵を、密度が50 mm2あたり1個以下（100 mmディッシュあたり約20個）になるように、魚用飼育水を含む滅菌ペトリ皿に移す。
  9. 死卵および未受精卵を取り除く。
    注：健康な受精卵は半透明で円形である。白濁したもの、白いもの、未受精卵、または奇形卵は取り除く。
  10. 雌雄の混同や、トランスジェニック魚のタンク間のクロスコンタミネーションを避けるため、魚を再確認する。
  11. オスとメスをそれぞれのタンクに戻す。
  12. 胚を28.5°Cのインキュベーターに一晩置く。ステップ1.8で指定した胚密度を超えないようにする。
  13. 翌朝、汚染物質を除去するために胚を漂白処理する。
    1. 漂白剤10 µLをシステム水20 mLに溶かして、漂白用作業溶液を調製する。チオ硫酸ナトリウム0.5 gをシステム水150–20 mLに溶かして、中和溶液を調製する。
    2. 生存している胚を選別し、メッシュネットウェルインサートに移す。インサートを漂白溶液に5分間浸す。
    3. インサートを直接チオ硫酸ナトリウム溶液に移す。2分間インキュベートして、残留漂白剤を中和する。
    4. 新鮮なシステム水の最終バスで胚をすすぐ。 squirt bottleを使用して、胚を新鮮なシステム水を含む清潔なペトリ皿に慎重に移す。
  14. 漂白後、胚をインキュベーターに戻す。
  15. 受精後5–7日（dpf）以降に、幼魚を飼育用の5 pptローティファー水を含む大型タンクに移す。
    1. ストックローティファー水（15 ppt）1部とゼブラフィッシュシステム水2部を混合して、5 pptローティファー水を調製する。
    2. 幼魚を移す前に、導電率計を使用して最終塩分濃度が5 pptであることを確認する。
      注：3–5 dpfでEGFP+ MYCN幼魚を選別すると、飼育前に腫瘍発生しやすい魚の特定が容易になる。この段階でMYCN胚を選別することで、偽陰性の判定を避けることができる。これは、神経堤細胞におけるEGFPの発現が、MYCN誘導性アポトーシスにより、発生の後期に減少する可能性があるためである。

2. ゼブラフィッシュにおける蛍光マーカーのスクリーニング

  1. システム水を用いて0.4% (w/v) のトリカインストック溶液を調製する。
  2. 魚を、底面を覆う程度のシステム水のみが入った清潔なシャーレに移す。
  3. トリカインストック溶液を加え、最終濃度を、14 dpf未満の魚では約0.05% (50 mg/L)、14 dpf以上の魚では0.012% (120 mg/L) に調整する。自発的な動きがほとんど、あるいは全くないことを確認し、十分な麻酔状態であることを確かめる。
  4. 魚が麻酔状態となり、泳げなくなった時点で、鰓蓋や心臓の動きが視認できる状態を維持しつつ、シャーレから余分な水を取り除く。
  5. 魚の蛍光をスクリーニングする。期待される領域（例：MYCN魚の間腎腺領域）に緑色または赤色の蛍光があるかを確認する。
  6. 硬いブラシ付きのソーティングツールを用いて、魚をグループ別に分ける。
    注：後の発生段階におけるMYCN誘導性の細胞死（アポトーシス）により、偽陰性と判定される可能性があるため、腫瘍が発生しやすい魚はできるだけ早期に選別すること。免疫リポーター魚については、幼魚期のイメージング直前、または成魚研究の場合は生後2～4ヶ月の間に選別を行う。この方法により、ハンドリングに伴うストレスを最小限に抑え、生存率を最大化できる。
  7. 陽性個体と陰性個体を、飼育を継続するためのシステム水が入った別々のタンクに移す。
    注：ステップ3では、21 dpf未満の幼魚のハンドリングとイメージングについて説明している。ステップ4～6では、より成長した魚の固定、組織調製、イメージング、および画像解析について説明している。

3. 幼魚のライブマウントおよびイメージング

  1. 分級後の幼魚を、トリカインを含む魚用水が入った10 mmペトリ皿に置く（年齢に応じた濃度についてはステップ2.3を参照）。
  2. 鎮静させた幼魚を、ガラスボトムのイメージングディッシュに移す。
  3. 幼魚を覆い、鎮静状態を維持するのに十分な量の溶液のみを使用する。
  4. 魚用水で1%–1.5%の低融点アガロースを調製する。アガロース溶液を完全に溶解するまで加熱する。
  5. アガロースを1–2分間冷却させる。マウンティング前に凝固するのを防ぐため、ヒートブロックを使用してアガロースを30°Cに維持する。
  6. イメージングディッシュ内で各幼魚を側方に配置する。
  7. 幼魚を固定するため、約30–200 µLのアガロースを幼魚の上に塗布する。幼魚が大きい場合は多めの量を、小さい場合は少なめの量を使用する。
  8. アガロースが凝固したら、アガロースの上に約100 µLの0.05%トリカイン溶液を加える。
  9. 共焦点顕微鏡を用いて幼魚をイメージングする。
    1. 共鳴スキャナーを備えた標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用する。開口数（NA）が1.10より大きい40×対物レンズを使用する。
    2. すべてのイメージングチャネルのピンホールを1.0 Airy unit (AU) に設定する。
    3. EGFP励起には48 nmレーザーを、mCherry励起には594 nmレーザーを使用する。光退色と光毒性を最小限に抑えるため、レーザー出力は25 mW未満に保つ。画素の飽和とブラッククリッピングを避けるため、レンジインジケータールックアップテーブル（LUT）を用いて検出器ゲインとレーザー出力を調整する。高電圧は過剰なノイズを導入するため、検出器ゲインは80 Vを超えないようにする。
    4. ボクセルサイズを0.42 × 0.42 × 6.0 µm (x, y, z)、解像度を1024 × 1024ピクセル、Zステップ間隔を6.0 µmとして使用する。通常、総イメージング深さが90–120 µmにわたる関心領域の全ボリュームを通じて、連続的に光学切片を取得する。16ビット取得モードで動作する高感度光検出器を使用する。
    5. 共鳴スキャン周波数3.3 kHz（画素滞在時間は約1.58 µs）の一方向ラインスキャンを用いて画像を撮影する。レーザー曝露を制限しつつ、モーションアーチファクトを低減するために2×または4×の平均化処理を行う。
      注意：イメージング中の幼魚の生存を維持するため、トリカインへの曝露を最適化すること。イメージング後、イメージングディッシュの約半分になるまで魚用水を加える。
  10. イメージング後すぐに、イメージングディッシュに新鮮な魚用水を加える。
  11. 硬い毛先の棒を用いてアガロースから幼魚を慎重に取り出し、回復させるために清浄な魚用水が入ったディッシュに移す。
  12. 通常の遊泳行動が回復したら、魚を元の水槽に戻す。
    注意：21 dpfより高齢の魚の場合、高解像度の共焦点イメージングを可能にするために、凍結切片法によって腫瘍上の皮膚を除去する必要がある。

4. 魚類の固定および凍結切片作成

  1. 承認済みの機関動物ケアガイドラインに従って、魚を安楽死させる。
  2. 肛門孔から胸帯まで腹側に切開を加え、腹腔を露出させて内部組織への固定液の浸透を促進する。
  3. ピンセットを用いて魚を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で調製した4%パラホルムアルデヒド（PFA）を含む1.5 mLチューブ、または組織体積の少なくとも10倍量の固定液に移す。
    注：組織の完全性を維持するため、腫瘍を含む領域への接触は避ける。
  4. サンプルを緩やかな連続攪拌（30 rpm）に設定したニューテーティングロッカーに置き、4°Cで少なくとも12時間、一晩インキュベートする。
    注意：PFAは危険で毒性があり、発がん性の可能性がある。手袋や保護メガネを含む適切な個人用保護具を着用すること。PFAを使用するすべての手順はドラフトチャンバー内で行い、蒸気の吸入を避ける。
  5. PFAを除去し、1.5 mLの1× PBSでサンプルを少なくとも4回洗浄する。各洗浄時にチューブを2〜3回ゆっくりと転倒混和させる。
  6. 魚をPBSで調製した30%スクロース溶液に移す。
  7. 個体が直立したチューブの底に沈むまで（約12時間）、コールドルームで一晩インキュベートし、スクロースが十分に浸透したことを確認する。
  8. 実験用ティッシュで魚を軽く吸い取り、余分なスクロース溶液を除去する。
  9. 魚を保存チューブに移す。
  10. イメージングまでサンプルを−80°Cで保存する。
    注：蛍光タンパク質の分解と信号の損失を最小限に抑えるため、3か月以内にサンプルを処理すること。
  11. 固定した魚をドライアイスでクライオスタット室まで運ぶ。
  12. プラスチック製モールドに、魚の正中線側の一方が下を向くように平らに置く。
  13. 魚が完全に覆われるまでOptimal Cutting Temperature（OCT）コンパウンドを加える。
  14. OCTが白くなるまで、モールドを−20°Cまたはクライオスタット内で凍結させる。
    注：一貫した切片作成を容易にするため、凍結前に魚をできるだけ平らに配置する。
  15. その後のホールマウントイメージングに向けて、皮膚を除去するため、ゼブラフィッシュを矢状面で凍結切片作成する。
    1. クライオスタットのチャックを冷却する。
    2. 室温のOCTをチャックに塗布する。
    3. OCTで包埋した魚のブロックを、OCT層にしっかりと押し付ける。
    4. 新しく塗布したOCTが白くなるまで、チャックとブロックを凍結させる。
    5. チャックをクライオスタットに取り付ける。
    6. ブレードが個体に達するまで、厚さ14 µmでブロックを凍結切片作成する。
      注：凍結中に個体が移動することがあり、魚が想定よりもブロックの高い位置にある場合がある。不透明なOCTの背景に代わって半透明の組織が現れたとき、個体に到達したと判断する。
    7. 切片の厚さを7 µmに減らす。
    8. さらに1回切断を続ける。
      注：この手順により、個体全体にわたって均一な矢状プロファイルを維持したまま皮膚を除去できる。
    9. 回収した切片の中に皮膚が確認できれば、終了とする。
      ​注：切片における皮膚の出現は、眼の形態よりも信頼性の高い指標となる。この手順は、皮膚が腫瘍微小環境のイメージングを妨げる場合にのみ行う。
  16. 手でチャックをゆっくりと温める。
  17. ピンセットを用いて、チャックからOCTブロックを取り出す。個体の切断面を乱さないように注意する。
  18. OCTが凍結したままの状態で、魚の周囲の余分なOCTをトリミングする。
  19. OCTが粘性の柔らかい状態になったら、ピンセットを用いてOCTブロックから魚を取り出す。

5. 皮膚を除去した魚の固定およびイメージング

  1. 魚をガラス底シャーレに入れ、切断した正中矢状面がガラス面に接するように配置する。
    注：ハンドリング中は魚の向きを維持してください。OCTブロックから魚を取り出した後、切片化された面の識別が困難になる場合があります。
  2. 1%～1.5%の低融点アガロースを調製する。
  3. 約30〜50 µL 魚の背面と腹面にアガロースを塗布し、サンプルを固定します。
    注意：アガロースを魚の下に配置すると画質が低下する場合があるため、避けてください。安定化に必要な最小限のアガロースのみを使用してください。
  4. 輸送中はサンプルを氷上で保持してください。マウント後2時間以内にサンプルのイメージングを行ってください。
  5. サンプルを共焦点顕微鏡室へ運搬してください。
  6. 共焦点顕微鏡を用いてサンプルのイメージングを行う。
    1. レゾナントスキャナーを備えた標準的な共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してください。自家蛍光により画像品質が制限される場合は、2光子顕微鏡を使用しても構いません。補正済みの20× 開口数（NA）0.80以上の対物レンズ。
    2. すべてのイメージングチャンネルについて、ピンホールを1.0エアリー単位（AU）に設定してください。
    3. EGFPの励起には488 nmのレーザーを、mCherryの励起には594 nmのレーザーを使用してください。レーザー出力は25 mW以下に維持します。画素の飽和（サチュレーション）および黒潰れ（ブラッククリッピング）を避けるため、レンジインジケーターのルックアップテーブル（LUT）を用いて、検出器のゲインとレーザー出力を調整してください。電圧が高くなると過剰なノイズが発生するため、検出器のゲインは80 Vを超えないようにしてください。
    4. 画像取得パラメータを次のように設定します。
      1. ボクセルサイズは0.42を使用してください。 × 0.42 × 6.0 µm 解像度1024における(x, y, z) × 1024ピクセル、およびZステップ間隔の 6.0 µm.
      2. 関心領域の全ボリュームにわたって分光イメージスタックを取得します。通常、Zスタックの総取得範囲は90～120 µm （15～20個の光学切片）。
      3. 組織表面の直上にある液体空間から画像取得を開始し、標本の全領域を確実にカバーするために、目的とするイメージング深さまで継続してください。
      4. 16ビット取得モードで作動する高感度光検出器を用いて画像を撮影する。
    5. 共振スキャン周波数 3.3 kHz（約 1.58 µs ピクセルドウェル時間）を8で× ライン平均化

6. 画像解析および定量化

  1. Fiji（バージョン1.54p）を用いた画像の可視化。
    1. 共焦点Zスタック画像を開きます。
    2. 「Image」を選択し、色をマージしてチャンネルオーバーレイを確認します。 > 色 > チャンネルの統合
    3. 「Image」を選択して、イメージング領域を含む全z範囲の投影図を生成します。 > スタック > Zプロジェクション。関心のあるスライス範囲および最大強度投影（Max Intensity projection）のタイプを入力します。これにより、画像の2D投影が表示されます。
      注：稚魚の場合、共焦点顕微鏡を用いて腫瘍微小環境（TME）全体を捉えることが可能です。したがって、TMEの解析には体積ベースの標準化および定量法を推奨します。成魚の場合、共焦点顕微鏡でTME全体を捉えることは不可能です。そのため、面積ベースの標準化および定量法の適用を推奨します。稚魚を用いた解析および定量に基づくと、どちらの手法でも信頼性の高い生物学的結果を得ることができます。
  2. 幼魚における腫瘍微小環境（TME）の体積正規化および定量化。
    1. MATLAB R202b（MathWorksのウェブサイトからパッケージをダウンロード）およびBio-Formatsパッケージ（openmicroscopyのウェブサイトからダウンロード）を用いた腫瘍体積の定量化。
    2. ユーザーは、以下のタスクを実行するスクリプトを実行します。
      1. ユーザーにコンピューターから.CZIファイルを選択するように促してください。
      2. 画像を読み込み、腫瘍領域を含むチャネルからデータを抽出してください。
      3. 蛍光強度による閾値処理（ユーザーによる入力または機械学習による設定が可能）を用いて、各スライスにおける腫瘍領域を特定します。一貫性を保つため、解析するすべての画像に対して同一の閾値を適用してください。
      4. 腫瘍領域をアウトラインし、ユーザーが確認できるよう、全スライスのコラージュ画像に腫瘍領域のアウトラインを表示してください。
      5. スライスあたりの腫瘍領域の面積をピクセル単位で算出し、mmに変換する。2 画像のスケールおよび撮像設定を用いて。
      6. 腫瘍領域の面積に、ファイルメタデータに保存されている厚みを乗じて、各スライスの体積を算出します。
      7. 各スライスの算出値を合計し、撮像された腫瘍およびその周囲領域の総体積をボクセル数またはmm³で算出する。3.
      8. 両方の容量測定値を10倍してスケールアップしてください。4 腫瘍体積および10について6 周辺領域に対して行います。これにより、標準化における細胞数と体積の比率がより適切になります。
    3. 細胞数の定量化
      1. 共焦点zスタック画像を開きます。
      2. 「Image」を選択し、色をマージしてチャンネルオーバーレイを確認します。 > 色 > チャンネルの統合
      3. 「Image」を選択して、撮像領域を含む全z範囲の3Dビューを生成します。 > スタック > 3Dプロジェクト。投影法として「Brightest Point」を選択し、その他の設定を任意の値に設定します。
      4. 細胞数が少ないため、細胞を個別にカウントして表にまとめ、腫瘍境界内に位置する細胞と腫瘍境界外に位置する細胞を区別してください。
        注：腫瘍領域の境界上にある細胞は、領域外としてカウントします。
    4. 正規化
      1. 腫瘍領域内の浸潤細胞については、細胞数をスケーリング後の腫瘍体積で除してください。腫瘍領域外の細胞については、腫瘍領域外の細胞数を、スケーリング後の画像全体の体積から腫瘍体積を差し引いた値で除してください。
      2. 以下の見出しを含む表を作成してください：「魚の識別」、「腫瘍体積」、「腫瘍領域内の細胞数」、「腫瘍領域外の細胞数」、「正規化後の領域内細胞数」、「正規化後の領域外細胞数」。
  3. 腫瘍微小環境（TME）の領域ベースの正規化および定量化。
    1. 長方形選択ツールまたはフリーハンド選択ツールを使用して腫瘍を囲み、腫瘍の関心領域（ROI）を定義します。
    2. [ボタン]を押して、ROIをROIマネージャーに追加します。 T または、選択して 分析 > 器具・ツール > ROIマネージャー > 追加.
    3. 以下の方法を用いてROI領域を測定します。 分析する > 測定.
    4. 確認してください 領域 以下で選択される 測定値の設定 測定値を記録する前に。
    5. ROIマネージャーにROIを保存します。
    6. 以下の方法を用いて、すべての画像に同一のROIを適用します。 ROIマネージャー > さらに詳しく > マルチメジャー.
    7. 画像間でROIのサイズを変更しないでください。
    8. ROI内の細胞数を手動でカウントします。細胞数が多い場合は、Cell Counterプラグインを使用して、以下を選択し細胞数をカウントします。 プラグイン > 解析 > 細胞計数器
    9. 細胞の重心がROI内にあるとき、左クリックしてカウントした各細胞にマークを付けてください。
    10. zスタックをスクロールして、細胞の同一性を確認します。
    11. 複数の画像平面にわたって、同一の細胞を重複してカウントしないようにしてください。
    12. 浸潤細胞が腫瘍境界に接触しているか、あるいは境界内部に位置しているかに応じて、個別にカウントしてください。
    13. 細胞の重心がROI外にある場合でも、浸潤細胞を独立したカテゴリーとして記録してください。
    14. ROI領域をピクセルからmmに変換する2.
    15. ピクセル幅、ピクセル高さ、およびZステップ間隔を〜から取得します。 画像 > 特性.
    16. 正規化細胞数の算出。
      1. 魚ごとの生細胞数を、対応するROI面積値で除してください。
      2. 得られた値を正規化細胞数として記録する。
      3. 絶対密度の測定では、以下の方法で得られた画像キャリブレーション値を用いて物理的な面積を算出してください。 画像 > 特性.
      4. 生の細胞数を算出された面積（mm²）で除します。2).
      5. 結果をcells/mmで表した細胞密度として記録してください。2.

結果

実験全体のワークフローを図1に示す。成体のTg(cd4-1:mCherry)ゼブラフィッシュとTg(dβh:MYCN;dβh:EGFP)ゼブラフィッシュを交配させ、CD4+細胞とdβh発現細胞がそれぞれmCherryおよびEGFP蛍光で区別して標識された複合トランスジェニック個体を作製した。胚をスクリーニングして適切な蛍光マーカーを確認し、その後、幼魚の発育過程における生体共焦点イメージング、または成熟個体における固定および凍結切片作製後の共焦点イメージングによって解析を行った（図1）。

幼生の発達過程における前がん性神経芽細胞腫病変とCD4+細胞との関連を評価するため、受精後（dpf）7日および14日の複合トランスジェニック魚をイメージングした。これらのタイムポイントは、ゼブラフィッシュのリンパ球発達段階に基づいて選択した26,27。代表的な共焦点画像を図2Aに示す。7 dpfでは、コントロール魚およびMYCN発現魚の両方において、dβh発現領域内またはその周囲にCD4+細胞が観察されることは稀であった（Figure 2A; Supplementary Videos 1 and 2）。14 dpfでは、コントロール魚の神経堤由来交感神経副腎前駆細胞領域と比較して、MYCN発現魚では神経堤由来の前がん性腫瘍に関連するCD4+細胞数の増加が認められた（Figure 2A; Supplementary Videos 3 and 4）。

腫瘍サイズの個体差および、共焦点顕微鏡で仔魚の腫瘍全体を撮影できる能力を考慮し、体積ベースおよび面積ベースの両方の標準化方法を比較しました。重要な点として、仔魚においては体積ベースおよび面積ベースの標準化方法で同等の結果が得られたことから、共焦点顕微鏡で腫瘍体積全体を撮影できない成魚の腫瘍において面積ベースの標準化を用いることが支持されました。定量化した結果、いずれの時点においても、群間での周囲のCD4+細胞数に有意な差は認められませんでした（Figure 2B、下；コントロール群およびMYCN群において、7 dpfでn = 4および6、14 dpfでn = 4および5）。対照的に、14 dpfにおいて、MYCN発現魚はコントロール魚と比較して、解析領域内へのCD4+細胞の浸潤が有意に増加していました（Figure 2B、上；P < 0.05；コントロール群およびMYCN群においてn = 4および5）。データは腫瘍体積あたりの標準化された細胞数（cells/mm3）として提示し、平均値 ± SEMで表記しています。

figure-results-1
図2受精後14日目における、MYCN発現神経芽細胞腫病変へのCD4+細胞の集積の増加。 (A）の代表的な共焦点画像 Tg(dβh:EGFP;Cd4-1:mCherry) 対照魚および Tg(dβh:MYCN;dβh:EGFP;Cd4-1:mCherry) 受精後7日および14日（dpf）の魚。EGFP陽性細胞（緑）は、 dβh発現している神経堤由来/神経芽細胞腫細胞、およびCD4+ 細胞はmCherry（赤色）で標識されている。矢印は代表的なCD4を示す。+ 神経堤／腫瘍領域に関連する細胞。スケールバー = 50 µm. (BCD4の定量+ コントロール群およびMYCN発現魚の7 dpfおよび14 dpfにおける、神経堤/腫瘍領域を囲む（下）および浸潤する（上）細胞。細胞数は腫瘍体積で標準化した（cells/mm³）。3）。データは平均値として提示されています。 ± SEM。統計的比較は、非対応の両側検定を用いて行われた。 t-試験。 P < 0.05。対照群およびMYCN群について、7 dpfではn = 4および6、14 dpfではn = 4および5。3回の独立した実験から得られた代表的なデータ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

確立された腫瘍におけるCD4+細胞の関連性を調べるため、ソートした複合トランスジェニック魚を成魚まで育成し、固定、凍結切片作成、および共焦点イメージングによる解析を行った（図 1）。4ヶ月齢の魚における局所性および転移性神経芽細胞腫の代表的な画像を図3Aに示す。EGFP陽性の腫瘍細胞が末梢交感神経節以外で検出された場合、その腫瘍を転移性と分類した。共焦点顕微鏡では腫瘍全体の体積を捉えることができないため、面積ベースの定量法を適用した。解析の結果、局所性腫瘍と比較して、転移性腫瘍の周囲または内部に浸潤しているCD4+細胞数が有意に増加していることが明らかになった（図 3B；P < 0.05；各群 n = 4）。データは腫瘍面積あたりの標準化された細胞数（cells/mm2）として示し、平均値 ± SEMで表記した。

figure-results-2
図 3転移性神経芽細胞腫ではCD4の発現が増加している。+ 腫瘍微小環境内への細胞浸潤。 (A) 4ヶ月齢の兄弟個体において発生した局所性および転移性神経芽細胞腫の代表的な共焦点画像 Tg(dβh:MYCN;dβh:EGFP;Cd4-1:mCherry) ゼブラフィッシュ。腫瘍細胞はEGFP（緑色）で標識されており、CD4+ 細胞はmCherry（赤）でラベル付けされている。矢印は代表的なCD4を示す。+ 腫瘍組織に関連する細胞。20倍で取得した画像× および63× 対物レンズは独立した視野として示されています。スケールバー = 100 µm (20×）および 50 µm (63×). (B) 総CD4の定量+ 局所および転移性腫瘍の周囲または浸潤している細胞。細胞数は、プロトコルに記載の通り、腫瘍サイズで正規化した。データは平均値として提示される。 ± SEM。統計学的比較は、非ペアの両側検定を用いて行われた。 t-試験。 P < 0.05。各群 n = 4。3回の独立した実験から得られた代表的なデータ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

これらの知見は、本プロトコルを用いて、ゼブラフィッシュにおける腫瘍形成の複数の段階で神経芽細胞腫病変に関連するCD4+細胞を可視化および定量できることを示しています。

補足ビデオ1. 受精後7日目の対照ゼブラフィッシュの代表的な共焦点zスタック画像。受精後7日目（dpf）のTg(dβh:EGFP;Cd4-1:mCherry)対照ゼブラフィッシュの三次元共焦点イメージング。EGFP陽性の神経堤由来細胞を緑色で、CD4+細胞を赤色で示している。この発生段階では、dβh発現領域内またはその周囲にCD4+細胞はほとんど観察されない。 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足ビデオ2. 受精後7日目のMYCN発現ゼブラフィッシュの代表的な共焦点zスタック画像。受精後7日目（dpf）のTg(dβh:MYCN;dβh:EGFP;Cd4-1:mCherry)ゼブラフィッシュの三次元共焦点イメージング。EGFP陽性のMYCN発現前悪性神経芽腫細胞を緑色で、CD4+細胞を赤色で示している。コントロール個体と同様に、この初期発生段階では、腫瘍領域内またはその周囲にCD4+細胞はほとんど観察されない。 こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ビデオ3. 受精後14日目のコントロールゼブラフィッシュの代表的な共焦点zスタック画像。 受精後14日目（dpf）のTg(dβh:EGFP;Cd4-1:mCherry)コントロールゼブラフィッシュの三次元共焦点イメージング。EGFP陽性の神経堤由来細胞を緑色で、CD4+細胞を赤色で示している。CD4+細胞はまばらに分布しており、dβh発現領域との関連性は限定的である。 こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ビデオ 4. 受精後14日目のMYCN発現ゼブラフィッシュの代表的な共焦点zスタック画像。 受精後14日目（dpf）のTg(dβh:MYCN;dβh:EGFP;Cd4-1:mCherry)ゼブラフィッシュの三次元共焦点イメージング。EGFP陽性のMYCN発現前がん性神経芽細胞腫細胞を緑色で、CD4+細胞を赤色で示している。同日齢の対照魚と比較して、腫瘍領域の拡大に伴いCD4+細胞の蓄積と浸潤の増加が観察され、これは図2Bに示す定量結果と一致している。 ここをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本プロトコルでは、ゼブラフィッシュをin vivoモデルとして利用し、TME内の免疫細胞を可視化および定量化します。この手法を成功させるには、いくつかの要因が重要となります。第一に、適切な複合トランスジェニック・ゼブラフィッシュ系統の選択と検証が不可欠です。幼魚において期待される蛍光発現パターンを確認し、必要に応じてジェノタイピングで確認する必要があります。実験群と対照群を正確に割り当てるため、実験前に免疫レポーターおよびオンコジーンの発現を確認してください。第二に、共焦点イメージングにおいて、関心領域（ROI）を正確に特定することが極めて重要です。明視野イメージングを用いて解剖学的指標を確認し、標的組織の局在化を容易にすることができます。例えば、体前部の腫瘍をイメージングする場合、眼を指標として局在化の補助に利用できます。第三に、イメージング領域を十分に露出させるために、魚を適切に配置することが不可欠です。位置合わせが不適切であると、画質が低下したり、目的の組織が遮られたりする可能性があります。最後に、ライブイメージング中のモーションアーチファクトを最小限に抑えるため、適切なマウントと固定が必要です。幼魚の生存能を維持しつつ画質を保つために、トリカイン濃度とイメージング時間を最適化してください。

生細胞イメージング中の光毒性は、レーザー強度と露光時間を短縮することで最小限に抑えることができます。成体サンプルの場合、繰り返しの融解は組織の完全性を損なう可能性があるため、取り扱いおよびイメージング準備中は組織を氷上で保持してください。特に、凍結切片作成後およびOCTコンパウンドブロックから取り出した後のサンプル操作には細心の注意が必要です。

イメージング結果の解釈には、レポーターの特異性を考慮する必要があります。いくつかの免疫レポーター系統では、複数の免疫細胞集団がラベルされます。例えば、CD4の発現は、マクロファージを含む、従来のT細胞以外の細胞集団でも報告されています28。加えて、mpegの発現はマクロファージ以外にB細胞でも検出されます29。Lyscは好中球とマクロファージの両方をラベルする可能性があります30。したがって、蛍光レポーターの発現のみでは、細胞の同一性を確定的に割り当てるには不十分な場合があります。RNAscope、フローサイトメトリー、定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、またはシングルセルRNAシーケンシングなどの追加の検証手法を用いることで、イメージングに基づく観察を補完し、ラベルされた細胞集団のさらなる分子生物学的特性を明らかにできる可能性があります。

本手法にはいくつかの限界があります。このアプローチは蛍光レポーターの発現に依存しているため、免疫細胞の同一性や機能状態を独立して確認することはできません。加えて、成魚を対象とした現在のワークフローにおける画像解析は、層数が限定的な共焦点データセットの投影に基づいているため、腫瘍微小環境（TME）内における複雑な三次元的な細胞関係を十分に捉えきれない可能性があります。最後に、本手法では複合トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の作製と維持が必要であり、一部の研究室にとって導入の障壁となる可能性があります。

これらの限界はあるものの、本プロトコルはゼブラフィッシュにおける神経芽細胞腫病変に関連する免疫細胞を可視化するための実用的なアプローチを提供します。従来の終点組織学的解析と比較して、この手法は組織構造を維持し、未処置の組織内で蛍光標識された細胞のイメージングを可能にします20,21。このワークフローは複数の発達段階に適用でき、他の蛍光リポーター系統にも適応させることが可能です。神経芽細胞腫以外にも、メラノーマとCD4+細胞、マクロファージ、CD8+細胞などの免疫細胞との相互作用を解析するために、TMEのイメージングを行った研究が数多く存在します15,21,31,32。以上の特徴により、本プロトコルはゼブラフィッシュのTME内における免疫細胞の局在を研究するための有用なプラットフォームとなります。

開示事項

著者らは、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、米国国立衛生研究所（NIH; 1UL1TR01430, CA215059, NS140967）、アメリカがん協会（RSG-17-204-01-TBG）、全米科学財団（191253）、およびAlex’s Lemonade Stand FoundationからH.F.への支援、ならびにWarren Alpert Distinguished Scholars FellowshipからX.Q.への支援を受けて実施されました。Y.W.は、ボストン大学学部生研究機会プログラム（UROP）およびSt. Baldrick’s Summer Fellowship Programの支援を受けました。M.V.は、St. Baldrick’s Summer Fellowship Programの支援を受けました。本論文の内容は著者らの責任に帰属するものであり、必ずしもNIHの公式な見解を代表するものではありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
20 µL ゲルローディングチップMilliporeSigma102-060稚魚の操作に使用
人工水草The Hidden Reef628742000任意の繁殖用エンリッチメント
漂白剤Fisher Scientific50371500胚の除染に使用
Cell Counter プラグインNational Institutes of Health (NIH)N/A細胞定量に使用するFijiプラグイン
コンピュータおよびモニターHP2TB68A8#ABA画像取得および解析に使用
共焦点顕微鏡ZeissLSM 710稚魚および成魚のイメージングに使用
クライオモールド（プラスチック製）Epredia2-050-160OCT包埋に使用
クライオスタットThermo Fisher Scientific95-64-0EC70凍結切片作成に使用
ドライアイスFisher ScientificN/Aサンプルの輸送に使用
Fiji ソフトウェアNational Institutes of Health (NIH)Version 1.54p画像解析ソフトウェア
細目ネットCarolina Biological651345胚の回収に使用
魚用インキュベーターVWR35960-05628.5°Cに維持
ピンセット（Forceps）Fisher Scientific10-316Bサンプルの取り扱いに使用
ガラス底ディッシュIBIDI81218-200イメージングに使用
低融点アガロースProlab Supply9012-36-6稚魚および成魚の固定（マウント）に使用
交配タンク（メインタンク、仕切り、格子状セクション）Carolina Biological161937ゼブラフィッシュの繁殖に使用
ニューテーティングロッカーMidsciR2D-30一晩のインキュベーション中の固定に使用
OCTコンパウンドTissue-Tek4583凍結切片作成用の包埋剤
パラホルムアルデヒド (PFA)Sigma Aldrich158127-500G固定液
ペトリ皿（プラスチック製）MilliporeSigmaBR4520胚および稚魚の取り扱いに使用
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco14080-055洗浄および固定手順に使用
プラスチック製移送ピペットFisher Scientific50-98-10胚および稚魚の移送に使用
カミソリブレードFisher Scientific12-640サンプル調製中に使用
導電率計YSIEC30ACC-04ロチファー培養水の塩分濃度確認に使用
ロチファーThe Hidden Reef116151603稚魚の飼育に使用
チオ硫酸ナトリウムThermo Fisher ScientificAAA1762936漂白剤の中和に使用
スクロースFisher ScientificS2590A凍結保護剤
トリカインメタンスルホナートWestern ChemicalNC0872873麻酔薬；Fisher Scientificより販売
ピンセット（Tweezers）Fisher Scientific12-0-12サンプルの取り扱いに使用
正立型蛍光顕微鏡LeicaM165蛍光スクリーニングに使用

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