プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

サマリー

我々は、開発中の主要な造血器官として胎盤を同定した。我々はその造血幹細胞（HSC）が生成され、ユニークな微環境のニッチの胎盤で展開されている両方とも発見。ここで、我々はマウス胎盤における造血幹細胞の分離と可視化に必要な実験手法を説明します。

要約

造血幹細胞（HSC）は、自己更新し、個々の生涯を通して血液系統のすべての細胞型を生成する機能を持っている。すべての造血幹細胞は、それらのプールサイズは自己複製細胞分裂によって維持され、その後、胚発生時に出現する。多くの解剖学的部位が胎児の造血中に参加するとHSCの開発の過程を調節する造血幹細胞との重要な発達のイベントの解剖学的起源を特定することはややこしくなっている。最近、我々は造血幹細胞がユニークな微環境のニッチ（スゲカス、ら、2005、ロードス、ら2008）で生成し、展開されている主要な造血器官として胎盤を同定した。その結果、胎盤は、彼らの出現と初期の展開時の造血幹細胞の重要な源です。

この記事では、我々はそれぞれ、造血幹細胞および胎盤におけるHSCプールの大きさのピークの開始の発達段階に対応するE10.5からマウス胎盤の分離およびE12.5胚の解剖の技術を、示す。さらに、我々はフローサイトメトリーまたは機能アッセイで使用するための単一細胞懸濁液中に胎盤組織の酵素的および機械的解離のために最適化されたプロトコルを提示する。我々は、胎盤の単細胞懸濁液のためのコラゲナーゼの使用は、造血幹細胞の十分な収量を示すことを発見した。胎盤からHSC収量に影響を与える重要な要因は、前に機械的解離の度合い、及び酵素処理、の期間です。

我々はまた彼らの正確な細胞のニッチにおける免疫組織化学によって開発造血幹細胞の可視化のための固定凍結胎盤組織切片の調製のためのプロトコルを提供しています。造血特異的な抗原はパラフィン包埋切片の準備中に保持されていないとして、我々は日常的に胎盤造血幹細胞および前駆細胞をローカライズするための固定凍結切片を使用してください。

プロトコル

1。胚の除去と胎盤切開

1. 開始するには、胚が最初に妊娠した母獣から分離する必要があります。
2. 動物は、承認された手順に従って安楽死させる - 私たちのケースで我々は、イソフルラン麻酔薬の致死量を使用するつもりです
3. 最初に、エタノールで腹をスプレーし、ハサミで小さな切開を行います。
4. 腹部を明らかにし、腹膜を切り開くために両手で皮膚を離れて引き裂く。
5. 鉗子で、子宮角をピックアップし、それぞれの先端にはさみを使用してそれらを収集する。 PBSと氷の上で場所で満たされたペトリ皿の子宮角に置きます。また、胎盤を分離する前にPBSで数回洗浄してください。我々は現在、胎盤を分離することができます。
6. two鉗子で、慎重に胚のconceptusesを周囲の子宮内膜組織を離れて剥離を開始。これはその後の解剖の手順を複雑にするので一つは、胚への構造的な損傷を与えていない穿刺またはそうでなければ注意する必要があります。
7. 氷上でPBSで新しいペトリ皿の中で孤立conceptusesを置き、すべてのconceptusesが子宮内膜から解放されるまで続けます。
8. 顕微鏡下と離れて胎盤から脱落膜ピールtwoピンセットで配置されたPBSで新しいペトリ皿一つ受胎を転送する。脱落膜の細胞は単一細胞懸濁液およびフローサイトメトリーを妨害するため、可能な限り脱落膜の限りを削除します。滑らかな連続的な剥離動きが最良の結果を達成することをお....

ディスカッション

このプロトコールに記載される実験手順は、胎盤組織と造血幹細胞や前駆細胞の分離と可視化が可能になります。胎児の発育を通して胎盤や他の胎児の造血臓器における造血幹細胞の予想される細胞の収量と数に関する包括的な概要については、我々はスゲカスらを参照してください。 2005年。胎盤で造血幹細胞および他の造血細胞の開発のローカライズのために我々はローズ、らを参照してください。 2008

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材料

材料のリスト ：
100mMのグルコース
10mMのNaN3
15 mlコニカルチューブ（BD）
16 G、18 G、20 G、22 G、25 G針（BD）
30％のショ糖液
35ミリメートルのペトリ皿（BD）
4％パラホルムアルデヒド
50 - mのセルのフィルタ（Celltrics）
5 mlのシリンジ（BD）
アルカリホスファターゼ基質キットI（ベクトル赤、ベクトル）
アルカリフォスファターゼ基質キットIII（ベクトル青、ベクトル）
抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン、P / S）ソリューション
コラゲナーゼI型（シグマ）
Cryomold使い捨てビニール片金型（10mm x 10mmの× 5mmの、組織- Tek社）
サイトケラチン一次抗体（DakoCytomation）
解剖ピンセット、ステンレス鋼やチタン、5番または55
DRIERITE
ウシ胎児血清（FBS）
Fisherbrandプラスチック顕微鏡スライドメーラー（フィッシャー）
グルコースオキシダーゼ1000u/ml
レバミゾール（ベクター）
マウントメディア、水性ベースのマウンティングメディウム（VectamountTM AQ）
正常ウマ血清（ベクトル）
最適な切削温度（OCT、ティッシュ- Tek社）
ペルオキシダーゼ基質キットDAB（ベクトル）
リン酸塩は、カルシウム/マグネシウム（WのCa2 + / Mg2 +を）と緩衝生理食塩水（PBS）
リン酸塩は、カルシウム/マグネシウム（W / OのCa2 + / Mg2 +は）なしで緩衝生理食塩水（PBS）
プラスチック製のスライドボックス（100スライドを保持する）
プラスチックチューブ（Nalgene 180 PVC無毒オートクレーブ可能）
ポリプロピレン丸底試験管5 mlの（12x75ミリメートル、BDファルコン）
プロテイナーゼK 20mg/ml溶液（Amresco）
研究プロダクツインターナショナルコーポレーションスーパーパップペンHT *スライドマーカー（2,5 mmの、フィッシャー）
組織培養U字型（丸底）治療を96ウェルまたは24ウェルプレート（BDファルコン）
Tween20を、SigmaUltra（シグマ）
チラミド増幅キット（Invitrogen社）
ベクタステインABCアルカリホスファターゼスタンダードキット（ベクター）
ベクタステインABC標準エリートキット（ベクター）