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ソリューション
- 神経節細胞の細胞内溶液（mMで）：100 K -グルコン酸、8のKCl、1のMgCl 2、1 EGTA、10 HEPES、4 ATP、0.5 GTP、90μMスルホローダミンBの（染色用）、でpH = 7.4に調整KOH
- 90 K -グルコン酸、8のKCl、1のMgCl 2、10 BAPTA、10 HEPES、4 ATP、0.5でpH = 7.4に調整GTP、90μMスルホローダミンB（染色用）、：双極細胞（mMで）のための細胞内液KOH
- 細胞外リンゲル溶液（mMで）：112塩化ナトリウム、5グルコース、5 HEPES、NaOHでpH = 7.75に調整2のKCl、2のCaCl 2、1のMgCl 2、。ソリューションの酸素化は必要ありません。
録音室を準備する
私たちの記録室は、よく別の接着剤から切り出された小さなシリコンブロックは組織切片のために安定性を提供するために配置されるだけでなく接着剤付き顕微鏡のスライドで構成されています。
網膜スライスの準備
光受容体の漂白を避けるために、郭清は、IRまたは暗赤色灯の光で行われる。一方が棒の経路からの応答を記録に興味を持っている場合は、唯一の赤外光は、（IRは、顕微鏡となく、部屋の明かりを解剖。追加の赤外線ゴーグルが顕微鏡下で行われない手続きのために使用される）を使用する必要があります。一、主に記録のコーンの光の応答に興味を持っている場合は、薄暗い赤い部屋の光または赤色閃光灯を使用することができます。顕微鏡は、しかし、それでもIR接眼レンズが必要です。
光受容体の入力が実験には無関係である場合、プロシージャは通常の顕微鏡を使用して、通常の室内光で行うことができる。
- よく接着剤、シリコーンを持つ2つの顕微鏡スライドを準備してください（フィルタをプッシュ各スライド上にシリコーングリースの二つの平行なバンド（約0.5センチメートル離れて）を作成し、スライドの片側にフィルター長方形の紙を置いて、両方のグリースバンド交差それがうまくスライドにアタッチされるようにカミソリの刃の部分と紙）
- 動物はその後、断頭し、ダブルpithed、30分間氷浴中に置かれている：確立されたプロトコルに従ってサンショウウオを生け贄に捧げる。
- サンショウウオの頭から目を削除し、氷冷リンゲル液で湿らせたティッシュの紙の上に解剖顕微鏡下に置く
- 目から結合組織を取り除く
- 角膜に小さなカットをするためにカミソリの刃を使用して、
- 目にその添付ファイルに沿ってハサミでそれを除去しながら鉗子で角膜を切るホールド
- 鉗子でレンズを取り外す
- 鉗子で虹彩を持ち、虹彩を削除するには、鋸状縁に沿って切断
- 二つの長方形の部分にアイカップを切る
- （非常に慎重に押し下げながら、ピースを平らに確認してください）作品の一つをピックアップし、ろ紙上強膜側を上に置きます
- 静かに今ファイラ紙に添付すべき、網膜から強膜を持ち上げ
- すぐに良くするために、氷冷リンゲル液を追加する
- 番目の部分に同じことを繰り返します。
- 200 -300μmの広いスライスをカットする特注のスライサーに配置されたカミソリの刃を使用してください。
- フィルター紙の側でスライスをピックアップしてピンセットを使用して、網膜の層が見えるようになるので、それを裏返し、真空グリースバンドの上に置きます
- 無傷に見える一は、いくつかのレイヤーを認識できる場合（倍率が充分ではないとして層は解剖顕微鏡下で確認することが困難である、しかし、スライスは通常、十分である網膜の層を示す水平バンドを表示するスライスを選択してください。それは）正立顕微鏡下で観察されると、スライスを使用するかどうかの最終決定は、しかし、行われる。つのスライドの間に呼び出し音のブリッジを構築することにより、記録のチャンバースライドに移動
- スライスが傾いていないようにろ紙が録音室でゴムブロックに押し付けていることを確認してください（神経節細胞と光受容器が同時に焦点が合うはず）
レコーディング機器で組織を配置する
- 記録のスライドは、顕微鏡下に置き、重力の灌流systeを通じてリンゲルソリューションで灌流され
- 準備は10倍と40倍の水浸対物レンズと正立顕微鏡で可視化です。
- 再び、我々は唯一の光受容体の漂白を防ぐために赤外光を使用してください。赤外線カメラは、テレビ画面に接続されている顕微鏡のサイドポートに接続されている。
視覚刺激
視覚刺激はPsychtoolboxを使用して、MATLABでプログラミングされており、顕微鏡画像インジェクタ（MBFバイオサイエンス）を用いて顕微鏡の最上位ポートを介して網膜上に投影されています。ビット+ +デジタルビデオプロセッサ（ケンブリッジリサーチシステム）は、14ビット輝度のスケールを取得してsynchrにするために使用されますデータ収集と刺激プレゼンテーションをonize。このビデオで使用される視覚刺激は、安定した一様な背景（上2秒のために提示された100％のコントラストの明るいまたは暗いバー（幅=460μm）であり、輝度= 8 * 10 4光子/μm/ sの、サイズ：1.84 X 1.38ミリメートル）。
電気生理学
- マイクロピペットプラーで：パッチ電極は、ホウケイ酸ガラス（1.5mmのID 84ミリメートル。。OD）から抜き出されます。神経節細胞の場合、抵抗値は2〜4 Mohmをです。双極細胞の場合、4と8 Mohmを間に高い抵抗値が使用されます。
- 電圧クランプ記録はMulticlamp 700A（Molecular Devices社）、アンプとLabVIEWでプログラミングされた研究室内部のソフトウェアを使用して実行されます。
- 薬は、8チャンネルの灌流システムを介して灌流されています。 microperfusion電極は、スライス（あなたが血流をオンとオフ、1つのニーズが、プレッシャーはスライスがろ紙から切り離さになることができるように強すぎではないことに注意するときに組織が目に見えて移動する必要があります）の近くに配置されています。実験中にmicroperfusionは絶えず記録は血流のオンとオフを切り替えることによって邪魔されないように（何の薬が必要ない場合は、コントロールのソリューションを灌流する）オンにする必要があります。