微小血管内皮上で生理的E -セレクチンを介した白血球のローリングの分析

このビデオでは、血管内皮細胞表面での白血球ローリングを誘発する要因を検討するためのパラレルプレートフローチャンバー解析について解説します。内皮細胞単層を前炎症性サイトカインであるIL-1βで刺激し、S-selectinの発現を上昇させます。その後、内皮細胞の上にパラレルプレートフローチャンバーを配置し、S-selectin陽性の白血球を単層上に注入します。

これにより、チャンバー内の細胞間相互作用には、毛細血管後での白血球接着時と同様のせん断応力が加わります。ローリング現象はNIS Elementsを用いてキャプチャおよび計数され、E-selectin依存性が解析されます。こんにちは、私はブリガム女性病院ハーバード医学大学皮膚科、Charles de Nitro博士の研究室のGeorge Weisです。

本日は、生理的な血流条件下において、ヒト白血球がヒト骨髄内皮細胞に接着する際のE-selectinおよびE-selectinリガンドの役割を解析する手順について説明します。当研究室ではこの手法を用いて、血管の内壁を構成する内皮細胞に対して、白血球や転移性がん細胞の接着を開始させる細胞表面分子の役割を研究しています。この接着現象は、ボウリングのボールがレーンを転がるようなローリング挙動によって特徴づけられます。

それでは始めていきましょう。この手順の最初のステップは、フローチャンバーの内壁を形成する血管内皮細胞を準備することです。このプロトコルでは、ヒト骨髄由来のH-B-M-E-C 60細胞を使用します。

微小血管培養皿は、あらかじめフィブロネクチンでコーティングしておく必要があります。準備には、20 µg/mLのフィブロネクチンを含むPBSを用いて、35 mLの組織培養皿をインキュベートします。これらは4 °Cで一晩、または37 °Cで3時間インキュベートしてください。HBMEC細胞をMedium 199に懸濁し、1皿あたり10⁵ cellsの密度で播種し、コンフルエンシーが90%を超えるまで培養します。

E-selectinの発現を上昇させるには約2日かかります。成長培地を吸引して除去し、50 ng/mLのIL-1βを含む新鮮な培地を添加して、4〜6時間インキュベートします。これで、細胞単層がフローチャンバーアッセイに使用可能な状態になります。別途用意したHBMEC-60細胞のプレートをIL-1βで刺激し、さらに20 µg/mLの中和抗ヒトE-selectin抗体を添加して、37 °Cで1時間処理することも可能です。

これにより、E-selectinの機能的発現をコントロールします。次に、E-selectin陽性白血球を調製します。これらには、ヒト造血前駆細胞であるKG-1を使用します。

これらはRPMI 1640中で、コンフルエントになるまで、あるいは10^6 cells/mLになるまで浮遊培養します。KG-1a細胞は、培養液から直接ピペッティングし、ヘモサイトメーターで計数することができます。細胞を、10 mM HEPNまたは2 mM CaCl2を含むHH緩衝液を用いたHBSS中で、10^6 cells/mLの濃度で再懸濁します。

アッセイを行うまで、細胞を氷上で保存します。次のステップでは、顕微鏡、パラレルプレートフローチャンバー、およびシリンジポンプを準備します。アッセイを開始する際に、顕微鏡とシリンジポンプの電源を入れます。

顕微鏡の10倍対物レンズを選択します。50 mLコニカルチューブをホルダーにセットし、2 mM塩化カルシウムを含むHHバッファーを満たします。次に、その下のホルダーに5 mLプラスチック試験管をセットします。

次に、60 mLシリンジをシリンジポンプにセットします。プランジャーとシリンジ本体の両方が確実に固定されていることを確認してください。60 mLシリンジの先端に3方活栓を取り付け、さらにその3方活栓に5 mLシリンジを接続します。

並行流路チャンバー装置を顕微鏡ステージ上に配置します。このとき、入力チューブを右側、出力チューブを左側、真空チューブを背面に配置してください。チューブを真空ポンプに接続した後、エアバルブを開いて並行プレート装置をステージに密着させます。これにより、流路チャンバーの真空スカートが気密であるかを確認します。

密封が確認できたら、エアバルブを閉じます。次に、出力チューブラインを、すでにシリンジに接続されている三方活栓に取り付けます。これで、装置をH-B-M-E-C 60細胞の上に配置する準備が整いました。

真空ポンプを起動し、フローチャンバー装置をプレート上にゆっくりと降ろし、装置を吸引させます。空気が漏れる音がしないことを確認してください。この際、ゴムガスケットを圧縮するためにチャンバーに圧力をかける必要がある場合があります。真空状態が確立されたら、入力チューブを50 milliliterコニカルチューブに入れます。

3方活栓を60 mLシリンジ側に開き、プレート上の細胞を剥離させないようにラインから空気を除去するため、ポンプをポンプモードに設定します。シリンジポンプを毎分2 mLに設定して吸入チューブを満たします。その後、速やかに毎分0.5 mLに設定してください。

液体が装置に到達する直前に、セットアップを慎重にプライミングして気泡を避けることが極めて重要です。気泡が混入すると、プレートから単層が剥がれてしまいます。液体が60 milシリンジに流れ込んだ時点で、フローチャンバーとシリンジポンプのプライミングは完了です。次に、入力ライン、出力ライン、および真空ラインのそれぞれをテープで固定し、フローチャンバーをステージに固定します。

これにより、データの可視化および収集時に視野を一定に保つことができます。これでフローチャンバーの使用準備が完了しました。これらの手順を、細胞の投入ランごと、および新しいプレートごとに繰り返してください。

Lucasサイトのローリングイベントをキャプチャするには、デスクトップでNIS Elementsを開き、再生アイコンを押してライブ画像を表示します。自動露出により、プレートの確認と画像のフォーカス合わせが可能になります。顕微鏡のフォーカスを手動で調整し、細胞単層に正しくピントが合っていることを確認してください。

ピントが合った後、露光時間を1秒間に1フレームにリセットし、顕微鏡の光量を調整します。画像はコンピュータ上に表示され、顕微鏡の接眼レンズからは見えなくなるはずです。その後、背景の露光を取り除いたり、細胞の鮮明度を高めたりするために、光ヒストグラムを調整できます。「2x2 bin」または「live bin」をクリックし、動画撮影に最適な画像を取得してください。

メニューバーの「macro」をクリックし、「right to port」を選択してポート「com three」を指定し、「open」をクリックします。これにより、シリンジポンプとの連携のためにポートが開かれます。これで、フローチャンバーにKG1a細胞を注入する準備が整いました。入力チューブライン付近にある5 mL試験管に、KG1a細胞懸濁液を1 mLピペットで分注してください。

次に、入力ラインを試験管の底部に配置します。メニューバーに移動し、「capture」と「time lapse acquisition」をクリックします。210秒間のプロトコルを選択してください。

これはH-B-M-E-C 60細胞のローリング（接着転がり）のためのプログラムの長さです。各フェーズでは、ポンププロトコルの期間中、1秒ごとに写真を撮影するようにプログラムされています。また、ポンプを開始するためにCOM3ポート経由でコマンドを送信するように設定されています。

シリンジポンプをプログラムモードに設定します。これにより、特定の流速を手動でプログラムすることが可能になります。これにより、チャンバー内のせん断応力レベルが決定され、H-B-M-E-C 60細胞上のKG one A細胞の相互作用が規定されます。これらの相互作用における設定値は、4.2 dines per centimeter squaredで45秒間です。

1 cm²あたり3 dynesの負荷を60秒間かけ、その後15秒ごとに段階的に負荷を上げ、最大4.2 dynes/cm²まで増加させます。これで、顕微鏡とコンピュータによるタイムラプス撮影の準備が整いました。コンピュータの「start run」ボタンを押し、プログラムを実行してデータの取得を開始します。

入力および出力チューブ内を常に培地で満たし、システム内に気泡が混入するのを防ぐため、KG one A細胞を含むチューブに必ず培地を追加してください。タイムラプスが中断された場合、ポンプは自動的に停止しないため、リセットする必要があります。「キャンセル」を押すとライブ画像に戻ります。

非刺激の血管内皮細胞単層を本実験の陰性対照として用います。そのために、まず未処理のH-B-M-E-C 60細胞上のフローチャンバーにKG-1A白血球を注入し、E-selectin非依存性を制御します。次に、血管内皮細胞単層をIL-1βで刺激し、これらの細胞上に白血球を注入することで、さらにE-selectin非依存性を制御します。H-B-M-E-C 60細胞をIL-1βで処理し、続いて抗ヒトS-selectin抗体で処理します。

次に、これらの細胞における白血球のローリング現象を解析します。細胞のローリングはSセレクトリンだけでなく、白血球細胞表面のシアル酸残基によっても決定されます。これを示すために、KG one A細胞を0.1 units/mLのニューラミニダーゼで37°Cにて1時間消化します。

次に、刺激したH-B-M-E-C 60細胞上のローリングイベントを解析します。白血球表面の糖タンパク質も細胞のローリングにおいて重要です。これは、KG-1A細胞を37°Cで1時間、0.2 units/mLのbromelainで処理した後、フローチャンバーに注入することで実証できます。

タイムシーケンスの取得後、データは解析可能な状態になります。データを保存し、メニューバーの「measure」タブに移動して「defined threshold」を選択します。目的の細胞が赤色に塗りつぶされるようにバーを動かし、すべての画像を選択して「okay」をクリックします。これで、タイムラプスシーケンス全体に、赤色で可視化された転がる細胞が反映されます。

「Measure」へ進み、「Restrictions」を選択します。これにより、ローリング細胞に該当しない閾値オブジェクトを除外することができます。これらは主にH-B-M-E-C 60単層によって作成された背景であり、ローリング白血球に最適な最小値および最大値を入力します。

伸長性と円形度についても、この手順を繰り返します。「measure」を選択し、次に「create binary using restrictions」を選択します。前のステップで設定した制限値がそのまま使用され、内皮細胞単層上のローリング白血球を認識するようにNIS elementsソフトウェアが最適化されます。「measure」に戻り、「field data」を選択して、「reset data」を選択します。

メニューを閉じ、「measure」に戻ってスキャンフィールドを選択し、「measure field data」を開いてオブジェクト数を選択します。次に、すべてのフィールドを選択し、データをMicrosoft Excelにエクスポートします。最後に、「clear data」を選択します。

NISエレメントは、さらなるデータ収集が可能な状態になりました。これらの代表的なデータは、白血球と内皮細胞の相互作用が生理的な剪断応力にどのように反応するかを示しており、特に接着リガンドであるEセレクトンの役割を検証しています。

内皮細胞をIL-1βで事前刺激すると、強力な白血球のローリングが起こります。この結果を非刺激のコントロールと比較すると、細胞のローリングがサイトカイン刺激に依存していることが明らかになります。HBMEC細胞をIL-1βで処理した後、抗ヒトE-セレクチン抗体で処理することで、細胞のローリングが特異的にE-セレクチンに依存していることが明確になります。

このアッセイは、他のパラメータの検討にも使用できます。例えば、刺激した細胞をsaseまたはbrolinで前処理すると、結果の堅牢性が低下します。これらのデータは、細胞表面の糖タンパク質だけでなく、末端のslic acid残基の重要性を強調しています。

Sセレクトリンのリガンド活性について、白血球と血管内皮細胞間のEセレクトリンに基づいた接着相互作用を、白血球が血液から組織へと移行する循環系領域である毛細血管後静脈に存在する力学的条件を模倣して分析する方法を説明しました。この手順を行う際は、本アッセイ系においてそれぞれのセレクトリンおよびそのリガンドが必要であることを検証するために、適切なブロッキング抗体または酵素処理コントロールを使用することを忘れないでください。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。