微小血管内皮上で生理的E -セレクチンを介した白血球のローリングの分析

このビデオでは、内皮細胞表面での白血球の転がりをトリガーする要因を調べるためのパラレルプレートフローチャンバー分析を示しています。内皮細胞単分子膜は、炎症誘発性サイトカインIL one betaで刺激され、Sセレクチン発現をアップレギュレートします。次に、平行プレートフローチャンバーを内皮細胞上に配置し、Sセレクチン陽性白血球を単層上に注入します。

したがって、チャンバー内の細胞相互作用は、毛細血管後および白血球接着の場合と同様の全体的なストレスを伴います。ローリングイベントは、NISエレメントとE選択独立性のためのアッセイを使用して捕捉および列挙されます。こんにちは、私はハーバード大学医学部ブリッグマン女性病院皮膚科のチャールズ・デ・ニトロ博士の研究室に所属しているジョージ・ワイスです。

今日は、生理学的血流条件下でヒト白血球がヒト骨髄内皮細胞に接着する際のeセレクチン、Eセレクチンリガンドの役割を分析する手順を示します。当研究室では、この手法を用いて、血管の内面を覆う内皮細胞に白血球や転移性がん細胞が接着する細胞表面分子の役割について研究しています。この接着イベントは、レーンを転がるボウリングボールのような転がる動作によって特徴付けられます。

それでは始めましょう。この手順の最初のステップは、フローチャンバーを覆う内皮細胞を準備することです。このプロトコルは、ヒト骨髄由来のH-B-M-E-C 60細胞を使用します。

微小血管系培養皿は、フィブロネクチンで事前にコーティングして、20マイクログラム/ミルのフィブロネクチンを含むPBSで35ミリリットルの組織培養皿をインキュベートする必要があります。これらは、摂氏4度で一晩、または摂氏37度で3時間インキュベートできます。H-B-M-E-C 60細胞を培地1 99に懸濁し、皿ごとに10〜5番目の細胞で播種し、培養物を90%以上のコンフルエンスに成長させます。

これは、増殖培地をアップレギュレートし、選択し、発現し、成長培地を吸引し、IL1ミルあたり50ナノグラムの新鮮な培地を添加し、ベータ1回を4〜6時間インキュベートするのに約2日かかります。これで、細胞単分子膜をフローチャンバーアッセイに用いる準備が整いました。H-B-M-E-C 60細胞の追加プレートは、IL one βで刺激し、中和抗ヒトeセレクチン抗体で20μg/milで摂氏37度で1時間処理することができます。

これにより、eセレクチンの機能的発現が制御されます。次に、eセレクチン陽性白血球を調製します。これらはKG1であり、ヒト造血前駆細胞です。

これらは懸濁液中で増殖し、RPMI 1640でコンフルエントするか、または1ミルあたり6細胞に傾向があります。KG one A細胞は、培養物から直接ピペットで移し、ヘモサイトメーターでカウントすることができます。Resusは、10ミリモルのHEPまたは2ミリモルの塩化カルシウムを含むHHバッファーを使用して、HBSSで10〜6細胞/milで細胞を懸濁します。

アッセイが行われるまで、細胞を氷上に保存します。次のステップでは、顕微鏡、パラレルプレートフローチャンバー、シリンジポンプを準備します。アッセイのために、顕微鏡とシリンジポンプの電源を入れます。

顕微鏡で10倍対物レンズを選択します。ホルダーに50ミリリットルの円錐管を置き、2ミリモルの塩化カルシウムを含むHHバッファーを充填します。次に、5ミリリットルのプラスチック試験管を下のホルダーに入れます。

次に、シリンジポンプに60ミリリットルのシリンジを入れます。プランジャーとシリンジの本体の両方が固定されていることを確認してください。60ミルシリンジの端に3ウェイストップコックを取り付け、次に5ミルシリンジを3ウェイストップコックに取り付けます。

パラレルフローチャンバー装置を顕微鏡ステージに置き、入力チューブを右側に、出力チューブを左側に、真空管を後ろに置きます。チューブを真空に接続した後、エアバルブを開いて、平行プレート装置がステージに接着できるようにします。これにより、フローチャンバーのバキュームスカートが気密かどうかがテストされます。

シールが確定したら、エアバルブをオフにしてください。次に、シリンジにすでに接続されている3方向ストップコックに出力チューブラインを取り付けます。これで、装置をH-B-M-E-C 60セルの上に置く準備が整いました。

真空をオンにし、フローチャンバー装置をプレート上に静かに下げ、装置を吸引させます。空気が漏れる音はなく、この時点で、ゴム製ガスケットを圧縮するためにチャンバーに圧力をかける必要がある場合があります。真空が確立されたら、入力チューブを50ミリリットルの円錐管に入れます。

3方向ストップコックを60ミルシリンジに開き、ポンプをポンプモードにして、プレート上の細胞を持ち上げずにラインから空気を取り除きます。毎分2ミルに設定されたシリンジポンプを使用して、インテークチューブを満たします。その後、すぐに毎分0.5ミルに設定します。

流体が装置に到達する直前に、セットアップを慎重にプライミングし、単層をプレートから持ち上げる気泡を避けることが重要です。液体が60ミルシリンジに移動すると、フローチャンバーとシリンジポンプがプライミングされます。次に、チャンバー内の流れをステージに固定し、入力、出力、真空の各ラインにテープを張ります。

これにより、データを視覚化および収集するときに視野が一定に保たれます。これで、フローチャンバーを使用する準備が整いました。これらのステップは、各セルインプットランおよび新しいプレートごとに繰り返す必要があります。

Lucasサイトのローリングイベントをキャプチャするには、デスクトップでNIS要素を開き、ライブ画像の再生アイコンを押します。自動露出により、プレートを見て画像の焦点を合わせることができます。顕微鏡で手動で焦点を調整して、顕微鏡が細胞単層に適切に焦点を合わせていることを確認してください。

画像にピントが合ったら、露出を1秒あたり1フレームにリセットし、顕微鏡の光を調整します。画像がコンピューターに表示され、顕微鏡に表示されなくなります。その後、ライトヒストグラムを調整することができます 背景の露出を削除したり、セルの鮮明度を向上させたりするために、2つずつビンまたはライブビンをクリックして、ムービーキャプチャに最適な画像を取得します。

メニューバーのマクロをクリックし、ポートに右を選択し、ポートcom threeを選択して開きます。これにより、シリンジポンプと調整するためのポートが開きます。これで、フローチャンバーにKG one A細胞ピペット1ミルのKG one A S懸濁液をインプットチューブライン近くの5ミル試験管に注入する準備が整いました。

次に、入力ラインを試験管の底に配置します。メニューバーに移動し、キャプチャとタイムラプス取得をクリックします。210 秒間のプロトコルを選択します。

これは、H-B-M-E-C 60セルでローリングするためのプログラムの長さです。各フェーズは、ポンププロトコルの期間中、毎秒写真を撮るようにプログラムされています。また、comm threeポートを介してコマンドを送信してポンプを始動するように設定されています。

シリンジポンプをプログラムモードに設定すると、特定の流量を手動でプログラミングできます。これにより、チャンバー内の純粋なストレスレベルが決定され、H-B-M-E-C 60細胞に対するKG one A細胞の相互作用が決まります。これらのインタラクションの設定は、4.2 ダイネ/センチメートルの 45 乗です。

ポイント 3 ダイネッツ/センチメートルの 2 乗を 60 秒間、ステップ アウェイは 15 秒ごとに増加し、最大 4.2 ダイネ/センチメートルの 2 乗になります。これで、顕微鏡とコンピューターがタイムラプス写真を撮影する準備が整いました。コンピューターで[実行開始]を押して、プログラムの実行中にデータの取得を開始します。

入力出力チューブを媒体でいっぱいに保ち、気泡がシステムに侵入するのを防ぐために、KG one Aセルを含むチューブに媒体を必ず追加してください。タイムラプスが中断されると、ポンプは自然に停止しなくなり、リセットする必要があります。キャンセルを押してライブ画像に戻ります。

刺激を受けていない内皮細胞単層は、この実験のネガティブコントロールとして機能します。これを行うには、KG one A白血球を未処理のH-B-M-E-C 60細胞上のフローチャンバーに注入して、e選択の独立性を制御し、内皮細胞単層にIL one betaを注入し、これらの細胞に白血球を注入して、eectの独立性をさらに制御します。H-B-M-E-C 60細胞をIL one βで処理し、次に抗ヒトSセレクチン抗体で処理します。

次に、これらの細胞の白血球ローリングイベントを解析します。細胞のローリングは、Sセレクチンだけでなく、白血球細胞表面のスリク酸残基によっても決定されます。これを示すには、KG one A細胞を0.1単位/milのノイラミニダーゼで摂氏37度で1時間消化します。

次に、刺激されたH-B-M-E-C 60細胞上のローリングイベントを解析します。白血球表面の糖タンパク質も細胞のローリングに重要です。これは、KG one Aセルを1ミルブロマレーンあたり0.2ユニットで摂氏37度で1時間処理し、フローチャンバーに注入することで実証できます。

時系列が取得されると、データを分析できるようになります。データを保存し、メニューバーの「測定」タブに移動して、「定義済みしきい値」を選択します。目的のセルが赤く色付けされるようにバーを動かし、すべての画像を選択してから、タイムラプスシーケンス全体を赤いローリングセルで変更する必要があります。

測定に移動し、制限を選択します。これにより、ユーザーはローリングセルを表さないしきい値オブジェクトを除外できます。これらは主にH-B-M-E-C 60単層選択領域と入力最小値と最大値によって作成された背景であり、ローリング白血球に最適です。

この手順を elongation と circularity に繰り返します。[メジャー] を選択し、[制限を使用してバイナリを作成] を選択します。前のステップで設定したのと同じ制限値を使用して、NIS elementsソフトウェアを最適化し、内皮細胞単層上のローリング白血球を認識します。戻って測定に戻り、フィールド データを選択し、データのリセットを選択します。

メニューを閉じ、測定に戻ってスキャンフィールドを選択し、測定フィールドデータを開いて、番号またはオブジェクトを選択します。次に、すべてのフィールドを選択し、データを Microsoft Excel にエクスポートします。最後に、[データのクリア] を選択します。

これで、NIS エレメントをさらにデータ収集する準備が整いました。これらの代表的なデータは、白血球内皮細胞の相互作用が生理学的に急激にストレスにどのように応答するかを示しており、特に接着性リガンドの役割をテストしています。Eセレクチン。

堅牢な白血球ローリングは、内皮細胞にIL one βを事前に刺激すると発生します。この結果を刺激されていない対照と比較すると、細胞のローリングがサイトカイン刺激に依存していることは明らかです。H-B-M-E-C 60細胞をIL one betaで処理し、次に抗ヒトEセレクチン抗体で処理することにより、細胞のローリングがeセレクチンに特異的に依存することが明らかになります。

このアッセイは、他のパラメータの試験にも使用できます。例えば、刺激された細胞をサーゼまたはブローリンで前処理すると、結果は堅牢性が低下します。これらのデータは、細胞表面の糖タンパク質だけでなく、末端のスリル酸残基の重要性を強調しています。

Sセレクチンリガンド活性については、白血球が血液を離れて組織に入る循環系の領域である毛細血管後静脈に存在する力を模倣する条件下で、白血球と内皮細胞との間のeセレクチンベースの接着相互作用を解析する方法を示しました。この手順を実行する際には、適切なブロッキング抗体または酵素処理コントロールを使用して、このアッセイシステムにおけるそれぞれのセレクチンとそのリガンドの必要性を検証することを忘れないでください。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。