2.13: 養殖および土壌試料からの細菌を列挙します。

1. 土壌の希釈液の調製

1. 手順を開始するには、土壌サンプルの 10 g を量り、95 mL の脱イオン水を加えます。よく、懸濁液を振るし、"A"としてラベルを付けます。
2. 土が落ち着く前に滅菌ピペットで懸濁液の 1 mL を削除し、容量 9 mL の脱イオン水空白にそれを転送します。渦徹底的と"B"とラベル。
3. この希釈手順 3 回、毎回前懸濁液 1 mL、9 mL の脱イオン水空。C、D、および E をチューブ、順番にこれらをラベルします。これは、結果 10^-1 10^-5グラムの 1 mL あたり土 ~ のシリアル希薄、

2 細菌培養用、拡散板

1. 細菌のコロニーを成長し、C、D、および e. 渦のサンプル C として、D と E、および各プレート上に 0.1 mL のピペットなど 3 つの事前に用意されたペプトン酵母寒天とラベルを取る。これは 10 の要因によってさらに、希釈価値を高める (C 10^-3D = 10^-4E を = = 10^-5)。
2. 次に、ガラス スプレッダーをエタノールに浸し。数秒を発火させ、エタノールを燃焼火炎の拡散機を配置します。これは、スプレッダーを滅菌します。
3. 炎が消滅するまでは、最初のプレートの上散布を保持します。蓋を閉じるを保持しているプレートを簡単に開けます。接種から寒天にスプレッダーをタッチ (接種文化を開始するために使用するセルの =) クール、そして自由液体の痕跡が消えるまで寒天の表面を菌のドロップを普及します。プレート蓋を取り付けます。
4. 再炎の拡散機と次のプレートは、迅速に作業を繰り返して浮遊生物、寒天培地を汚染しないように
5. 1 週間室温で細菌の版を孵化させなさい。寒天培地の表面に落下からの凝縮から水分の低下を防ぐために潜伏中にプレートが反転されていることを確認します。

放線菌のため 3. 拡散板

1. 放線菌の成長、3 つの事前に用意されたグリセロール-カゼイン プレートを取ると前述のテクニックとして B、C、および D. を使用してそれらのラベル、拡散板 B、C、および D. 懸濁液から 0.1 mL放線菌は、通常細菌の人口の 1/10^thとしているため、低い希釈 (B = 10^-2C = 10^-3D = 10^-4)。
2. 2 週間室温 (反転) 放線菌プレートを孵化させなさい。

4. 細菌や放線菌数

1. インキュベーション後、慎重に、すべての細菌の版を調べるし、コロニーのサイズと形状の違いに注意してください。寒天上に成長した、細菌は無色透明からピンクや黄色、明るいオレンジ色に至るまでぬるぬるしたコロニーを生成します。対照的に、放線菌のコロニーは、しっかりした、革のようなされて、他の細菌のコロニーが中傷する圧力の下で入ります。これにより滅菌ループとの接触によって区別される植民地です。
2. カウントし、放線菌を含む細菌のコロニーの数を記録します。プレート プレートごと 30 200 コロニーとカウントされます。

5. 純粋培養の分離

1. 個々 の細菌のコロニーをプレートのいずれかから選択します。土に特に興味がある場合より多くの植民地を選択できます。それは、よく分離されている純粋な植民地を持っている傾向がある高希釈プレートを使用します。近隣植民地から十分に分離、互いから明瞭な形態学的に見えるコロニーだけを選択します。
2. ループをアルコールに浸漬し、それを炎で滅菌します。すぐに、関心のペトリ皿を開き、それを冷却する寒天培地の裸地にループをタッチします。少量のループに関心の植民地を削除します。
3. 連勝数センチを作る新鮮なペプトン酵母プレートを取って 1 つの側面に長い。消毒し、再度、クールな最初のパスでのみ初期の連勝を越える連勝をします。同様にさらに 2 回繰り返します。この光線「希釈」は、互いから分離されているループのセルに結果します。2 週間室温でインキュベートする暗い部分にプレートを配置します。

環境細菌の正確な数を決定することは、土壌生態系の健康状態を評価するために重要です。これは、適切な希釈液で細菌コロニーを培養することで達成できます。

土壌細菌は、健康な土壌生態系の重要な部分であり、分解、窒素固定、および栄養素循環の役割を果たしています。表層土壌は、空気や水で満たされた細孔を取り囲む複雑なマトリックスを形成する有機粒子と無機粒子の基質です。これらの条件はバクテリアにとって理想的な生態系を作り出し、表面の土壌には通常、グラムあたり100万個以上のバクテリアが含まれています。

この高濃度のバクテリアのため、成長培地にめっきする前に希釈する必要があります。段階希釈により、元の土壌サンプルの濃度を、培地プレート上で単一のコロニーを成長させるのに十分な低レベルまで下げることができ、土壌サンプル中の細菌の初期カウントを計算できます。

このビデオでは、土壌サンプルの連続希釈の準備方法、これらの細菌サンプルのプレートの方法、希釈プレートからの土壌細菌数の計算方法について説明します。

バクテリアは単純な原核生物ですが、種や生態系の点では非常に多様です。放線菌は細菌のサブセットであり、糸状構造により、互いにつながれて成長して菌糸を形成するため、しばしばユニークなグループと見なされます。

通常、放線菌は土壌中の全細菌個体数の10%を占めています。バクテリアと放線菌は、地球上のほぼすべての環境に豊富に存在しますが、土壌には比類のない多様性と豊富に見られます。

土壌細菌は列挙され、希釈めっきによって培養および同定される可能性があります。ここでは、土壌サンプルを水で段階希釈した後、寒天成長プレートに分散させます。その後、結果として生じるコロニーがカウントされます。この値は、希釈係数とともに、土壌中の細菌の初期濃度を解明するために使用されます。

希釈めっきは、細菌の計数に一般的で安価で簡単な方法ですが、いくつかの欠点があります。希釈中に土壌が沈殿することは許されるべきではありません、それは偏った成長につながる可能性があります。一部の土壌細菌は、プレート上で培養しないか、成長が遅すぎて観察できません。さらに、この方法では、コロニーは単一の細菌から形成されることを前提としていますが、複数の細胞の塊から発生することもあります。

特定の細菌種は、異なる増殖培地でよりよく成長します。広範囲の細菌を培養するための一般的な基質は、寒天ペプトン酵母プレートです。放線菌は、グリセロール-カゼインベースのプレート上で優先的に増殖するため、これらの糸状細菌の増殖により適しています。

細菌の列挙の背後にある概念を理解したところで、このプロセスが実験室でどのように実行されるかを見てみましょう。

手順を開始するには、10 gの土壌サンプルを秤量し、95 mLの脱イオン水に加えます。サスペンションをよく振って、「A」とラベルを付けます。土壌が落ち着く前に、滅菌ピペットで懸 ?? 液1 mLを取り出し、9 mLの脱イオン水に移します。.徹底的に渦巻き、「B」とラベルを付けます。

この希釈ステップを3回繰り返し、毎回1 mLの前の懸濁液と9 mLの脱イオン水で繰り返します。これらをチューブC、D、Eとして順番にラベル付けします。これにより、1mLあたり10-1〜10-5グラムの土壌の段階希釈が得られます。

細菌コロニーを増殖させるには、あらかじめ調製したペプトン酵母寒天プレートを3枚取り、C、D、Eとラベル付けします。対応するサンプルをボルテックスし、各プレートに0.1mLをピペットで移します。CFU は mL あたりで報告されるため、0.1 mL を使用すると、希釈がさらに 10 倍に増加します。

次に、ガラススプレッダーをエタノールに浸します。スプレッダーを炎に数秒間入れて、エタノールに点火して燃焼させます。これにより、スプレッダーが滅菌されます。

炎が消えるまで、スプレッダーを最初のプレートの上に保持します。蓋を近くに持って、プレートをすばやく開きます。スプレッダーを接種物から離れた寒天に触れて冷まし、遊離液の痕跡が消えるまで接種液の滴を表面の周りに広げます。プレートの蓋を元に戻します。

スプレッダーを再燃焼させ、次のプレートでこのプロセスを繰り返し、プレートが空気中の生物で汚染されないように迅速に作業します。水滴が寒天に落ちないようにプレートを反転させ、室温で1週間インキュベートします。

放線菌を増殖させるには、あらかじめ調製した3つのグリセロール-カゼインプレートを取り、B、C、およびDとして標識します。前述の手法を使用して、懸濁液B、C、およびDから0.1 mLをプレートに広げます。放線菌は通常、細菌集団の1/10として存在するため、より低い希釈が使用されます。

最後に、これらのプレートを裏返し、室温で2週間保存します。

インキュベーション後、すべてのバクテリアプレートを注意深く調べ、コロニーのサイズと形状の違いに注意してください。寒天で増殖させると、バクテリアは無色から明るいオレンジ、黄色、ピンクまでのぬるぬるしたコロニーを生成します。対照的に、放線菌のコロニーは白亜質で、硬く、革のようで、圧力がかかると壊れますが、他の細菌のコロニーは汚れます。これにより、コロニーは滅菌ループとの接触によって区別することができます。

放線菌を含む細菌コロニーの数を数え、記録します。プレートあたり30〜200コロニーのプレートのみをカウントします。

特定の個々の細菌の培養物を増殖させるには、いずれかのプレートから個別のコロニーを選択し、隣接するコロニーから十分に分離されたコロニーを選択します。拡散ループを滅菌してから、プレートを開き、ループを空の場所に触れて冷却します。次に、目的のコロニーを少量ずつループにピックします。

新鮮なペプトンイーストプレートを取り、片側に数センチの長さの縞を作ります。滅菌して再度冷却してから、最初のパスでのみ最初のストリークを横切るストリークを作成します。このプロセスを同じ方法でさらに 2 回繰り返します。このストリーキングの「希釈」により、ループ上の細胞が互いに分離されます。プレートを暗い場所に置いて、室温で2週間インキュベートします。

細菌および放線菌のコロニー数から、土壌のグラムあたりのコロニー形成単位を決定できます。土壌1グラム当たりのコロニー数は、プレート上に数えられたコロニーの数に希釈メッキの逆数を掛けたものに等しい。たとえば、0.1 mLの接種剤を使用して10-5の希釈プレートで46コロニーを数えると、土壌1グラムあたりのCFUは10-6 x 46、つまり土壌1グラムあたり4,600万CFUに等しくなります。

細菌の計数と培養を行うことは、多くの科学的調査やプロトコールにおける重要な第一歩です。

健康な土壌には、グラムあたり106〜108個のバクテリアが含まれています。土壌の細菌列挙は、関心のある土壌の健康状態を判断するために使用でき、グラムあたりの細菌数が106および108未満の場合は、不健康な土壌または貧弱な土壌を示します。これは、栄養素や有機物の不足、極端な土壌pHによる非生物的ストレス、または土壌汚染によって引き起こされる可能性があります。

今日の医学で使用されている多くの種類の抗生物質は、土壌に生息する細菌や真菌から最初に特定されました。土壌培養物から純粋な菌株を分離することは、科学者が新しい抗生物質化合物を特定するのに役立つ可能性があります。ここでは、試験細菌または目的の単離された化合物を、細菌の芝生で成長させたプレートに加えることができ、それらが芝生の成長に及ぼす影響が記録されます。試験細菌または化合物によって成長が阻害された細菌の芝生の透明な斑点は、抗生物質活性を示している可能性があります。

エンドウ豆や豆などのマメ科植物は、窒素固定細菌との共生関係に依存しています。これらの細菌は、土壌中または根系の結節内に自由に生息し、植物が利用する窒素化合物を生成します。貧弱な土壌では、マメ科作物に土壌からの培養窒素固定細菌を補給することで、植物の成長と健康を促進する可能性があります。これにより、植物が大きく、丈夫になり、作物の収量が増加します。

JoVEのバクテリア列挙の紹介を見ました。これで、土壌サンプルの希釈方法、コロニーカウントとコロニー分離のためのプレート処理方法、および土壌サンプル中の細菌数の計算方法を理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます!