藻類培養手法を介して列挙
ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ブラッドリー ・ シュミッツ
藻類は、1 つの共通の特徴、すなわち光合成色素の保有微生物の非常に異種のグループです。環境、水で成長して、藻類によってプールの所有者に問題が発生します。藻類も海面、湖や貯水池、ア…
- フィールドから湿った収集されてのいずれかを持っている土壌の 10 g のサンプルを比較検討または持っていたそれに追加している水は 2 ~ 3 日はしっとり残るようにします。土が湿る飽和していないする必要があることに注意してください。
- 10 倍希釈系列を準備するには、変更されたブリストルのソリューション (図 1) の 95 mL に土の 10 g を追加します。変更されたブリストルのソリューションを作成する溶解水 1,000 mL に次: 0.25 g ナノ3、0.025 g CaCl2、0.075 g-MgSO4 ·7 H2O、0.075 g K2HPO4、0.018 g KH2PO4、0.025 g 塩化ナトリウム 0.5 mg した FeCl3.
- ブリストルのソリューションおよび追加の連続希薄 9 mL に A 懸濁液 1 mL を添加して希釈系列を継続します。
- 5 複製管 1 ml の各希釈 10-2 10-6 (表 1) に変更されたブリストルのソリューションの各含む 9 mL を接種します。
- 日光にさらされる領域に最大 4 週間のキャップのチューブを孵化させなさい。
- 藻類の成長 7 日に一度チューブを観察します。藻類の成長とチューブが緑色表示されます。
図 1。10 倍希釈系列を作る方法。
| チューブ | 希釈 |
| B | 10-2 |
| C | 10-3 |
| D | 10-4 |
| E | 10-5 |
| F | 10-6 |
表 1。管および希薄。
藻類は、さまざまな環境に生息する光合成生物です。土壌に生息する藻類は実験室で培養でき、簡単な計算を使用してその濃度を列挙できます。
藻類は、1つの共通の特性、すなわち光合成色素、一般的にはクロロフィルの所有を持つ生物の非常に不均一なグループです。藻類の大部分は微視的ですが、グループの正確な定義は物議を醸しており、通常は巨視的である海藻も含まれます。
環境では、藻類は湖や貯水池などの地表水で問題を引き起こし、水の栄養素を枯渇させる藻類の異常発生を引き起こし、水面を越える光を遮断し、毒素を放出する可能性があります。サンプル中の藻類を列挙する能力により、科学者は生態系の健康状態と藻類の過剰増殖の潜在的なリスクを評価できます。
土壌中の藻類の個体数は、1グラムあたり約1万個の細胞で頻繁に発生します。これらの数値は、藻類が光合成のために日光を必要とし、土壌表面のはるか下に浸透できないため、通常、細菌、真菌、または放線菌の対応する濃度よりも低くなります。
このビデオでは、実験室で土壌から藻類を培養する方法と、開始土壌サンプル中の藻類の濃度を列挙する方法を示します。
藻類は生態系に有益な効果をもたらします。藍藻類、またはシアノバクテリアは、大気から窒素ガスを固定する能力を持っているため、半乾燥環境で土壌窒素を増加させるのに役立ち、バイオ燃料生産の潜在的なツールとしても役立ちます。
他の藻類は真核生物であり、単細胞生物から海藻のような複雑な多細胞生物までさまざまです。これらには、緑藻類、ユーグレノイド、渦鞭毛藻類と珪藻類、褐藻類、紅藻類が含まれます。
藻類は光合成性であり、光合成からエネルギーを取得し、二酸化炭素からバイオマスの炭素を取得します。その結果、有機炭素基質を添加せずに、完全に無機栄養素からなる培地で成長させることができます。この有機基質の欠如は、成長のために外部有機炭素に依存している従属栄養細菌の増殖を防ぎます。
計数のために藻類を培養するために、土壌サンプルを1mLあたり10〜6gの土壌に10倍に連続希釈し、成長培地で培養します。希釈ごとに数回の繰り返しが行われます。その後、藻類の成長を可能にするために、明るい場所で最大4週間インキュベートします。
希釈中の藻類の存在は、通常、緑色の粘液として現れる培地の成長の肯定的な兆候によって決定されます。最後に、藻類の成長用に設計された経験的に開発されたMPNテーブルを参照し、希釈複製の成長に基づいて元の藻類濃度を決定できるようにします。MPN法は、藻類が消滅するまで希釈されるようなサンプルの段階希釈に依存しており、これは、ある希釈で藻類の成長が起こらないことを意味します。
サンプルから藻類を成長させて列挙する背後の概念を理解したところで、これが実験室でどのように行われているかを見てみましょう。
実験を開始するには、まず、フィールドから湿ったまま収集された、または再水和されて2〜3日間湿ったままの湿った土壌10グラムを計量します。土壌は飽和しているべきではありませんが、飽和していません。
次に、最初に10グラムの土壌を95mLの改変ブリストル溶液(MBS)に加えて、10倍希釈シリーズを調製します。これを懸濁液Aとラベル付けします。
激しく振とうした後、試験管内のMBS9 mLに懸濁液A1 mLを加えて希釈シリーズを続けます。この10倍希釈シリーズをさらに4回続けて、1mLあたり最大10〜6gの希釈を行います。
次に、各9mLのMBSを含む5本の複製チューブに、希釈液10-1〜10-5の各1mLを接種する。これにより、10-2 から 10-6 までの希釈ごとに 5 本の繰り返しチューブが得られます。チューブにゆるくキャップをします。
最後に、日光にさらされた場所でチューブを4週間インキュベートします。7日に1回、藻類の成長のためのチューブを観察します。藻類の成長を示すチューブは緑色に見えます。
最確数(MPN)解析は、濃縮された初期基質の希釈から増殖した微生物を列挙するために一般的に使用される数学的手法です。溶液の希釈係数と、各希釈で成長の肯定的な兆候を示すチューブの数を考慮に入れることにより、元の土壌サンプルのグラムあたりの最も可能性の高い生物の数は、MPNテーブルと簡単な式を使用して計算できます。
MPNを計算するには、ポジティブレプリケートチューブの数が最も多い希釈率が最も高いものにp1のラベルが割り当てられます(この場合は、チューブCのレプリケート)。対照的に、D&Eのチューブの一部は陰性で、藻類の成長の兆候はありません。
次の 2 つの高希釈でプラスの成長を示すチューブの数は、p2 と p3 とラベル付けされます。ここで、p2 = D と p3 = E.
p1 の値は、MPN テーブルの最初の列を調べることで確認できます。p2 列についても同じことを行う必要があります。最後に、上部を横切るp3の値は、p1とp2で定義される2つを交差させるために使用されます。これにより、mLあたりの生物数が最も可能性の高い値が得られます。
次に、元の土壌サンプルのグラムあたりの生物の濃度を計算するために、この値をp2が割り当てられた希釈中の土壌の濃度で割ります。次の式は、土壌のグラムあたりの生物の実際の数を定義するために使用されます。
藻類の列挙とMPN分析には幅広い用途があり、ここではその一部について説明します。
この藻類の培養方法は、さまざまな設定で使用できます。川や湖に適用して、藻類のレベルを決定し、有害な藻類の異常発生のリスクを評価できます。あるいは、スイミングプール、噴水、その他の飲料水源など、人間がより直接的に使用する水の清浄度と安全性を評価するためにも使用できます。理想的には、飲料水のサンプルやプールには、藻類は存在しません。
計数のためのMPN分析は、他の非藻類微生物にも適用できます。例えば、水質は、大腸菌群や大腸菌などの指標生物を用いて評価することができます。ここでは、インジケーター生物の存在下で色または蛍光を生成するように変更された化学物質を含む培地でサンプルを培養できます。この実験を個々の細胞で複数回少量繰り返し、サンプルを既知の濃度に希釈することにより、陽性細胞の比率を特定の指標生物のMPNテーブルを参照し、サンプルの開始濃度を決定できます。
藻類は、商業用途のために培養することもできます。例えば、バイオ肥料の種類によっては、藍藻類を利用しており、植物と共生し、植物の定着や窒素の取り込みを助け、土壌が乏しい地域での作物の成長を助けるのに特に役立っています。同様に、藻類はバイオ燃料として、または家畜の栄養豊富な食物の供給源として育てることができます。
JoVEの藻類の培養と列挙の紹介を見ました。これで、藻類の成長のために土壌サンプルを希釈する方法、実験室で藻類を培養する方法、および開始サンプルの藻類濃度を列挙する方法を理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます!
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Q1: What are algae and what makes them unique among microorganisms?
Algae are a heterogeneous group of photosynthetic organisms unified by possession of photosynthetic pigments, commonly chlorophyll. Most algae are microscopic, though the group includes macroscopic seaweeds. Unlike heterotrophic bacteria, algae are phototrophic, obtaining energy from photosynthesis and carbon from carbon dioxide, allowing growth in inorganic media without organic substrates.
Q2: Why are algal populations in soil typically lower than bacterial populations?
Algal populations in soils average around ten thousand cells per gram, lower than bacteria, fungi, or actinomycetes because algae require sunlight for photosynthesis. Sunlight cannot penetrate far below the soil surface, limiting algal growth to shallow depths where light is available for photosynthetic activity.
Q3: How does the serial dilution process work in algal enumeration?
Soil samples are serially diluted tenfold to 10-6 g soil per mL and cultured in growth media with multiple replicates at each dilution. Tubes are incubated in well-lit areas for up to four weeks. The serial dilution dilutes algae to extinction, meaning at some dilution, no algal growth occurs, enabling accurate enumeration using MPN analysis.
Q4: What does a positive result look like when culturing algae in the laboratory?
Algal growth appears as a green slime in the culture medium, resulting from photosynthetic activity. This visible green coloration indicates the presence of algae in that particular dilution and serves as the primary indicator for determining which tubes show positive growth during MPN analysis.
Q5: How is the Most Probable Number calculated from dilution results?
The highest dilution with the most positive replicate tubes is labeled p1, followed by p2 and p3 from higher dilutions. Values are located in an MPN table using p1 and p2 columns, then intersected with p3 across the top to obtain organisms per mL. This value is divided by soil concentration in the p2 dilution to calculate organisms per gram of original soil.
Q6: What are the practical applications of algal enumeration in environmental monitoring?
Algal enumeration assesses algal levels in rivers and lakes to evaluate risks of harmful algal blooms. It also monitors cleanliness and safety of human-use waters including swimming pools and drinking water sources, where ideally no algae should be present. The MPN method can similarly assess water quality using indicator organisms like coliforms or E. coli.
Q7: What beneficial roles do algae play in soil and agriculture?
Blue-green algae, or cyanobacteria, fix nitrogen gas from the atmosphere, increasing soil nitrogen in semi-arid environments. Some algae serve as biofertilizers, acting as symbionts with plants to enhance nitrogen uptake, particularly useful in areas with poor soil. Algae are also cultivated for biofuels and as nutrient-rich livestock feed.