環境微生物やウイルスを使用しての qPCR の定量化

定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)の登場により、環境サンプル中のあらゆる微生物の量を定量的に測定することが可能になりました。

標準的なPCRと同様に、qPCRは、対象生物に特異的なDNA配列の有無を検出することで微生物を同定します。これにより、実験室では培養できない微生物の検出が可能となり、より幅広い環境微生物の分析が可能になります。さらに、qPCRにより、DNAの量を定量的に評価できます。しかし同時に、PCR法では、死んでいる生物も生きている生物もすべてDNAを検出するため、サンプル内で活発に増殖している微生物のみを探す能力が制限されます。

このビデオでは、qPCRと通常のPCRを区別する化学的イノベーションをレビューし、qPCRを使用してDNAを定量的に測定する方法を説明し、qPCRを使用して土壌サンプルからRNAウイルスを検出するためのプロトコルを実演し、最後に、qPCRが今日の環境微生物学にどのように適用されているかを示します。

qPCRの基本原理は通常のPCRと同じで、テンプレートへのプライマーアニーリング、PCR産物の伸長、テンプレートからの産物の変性を繰り返すことで、アンプリコンと呼ばれる目的の標的配列が出発物質のプールから指数関数的に増幅されます。

qPCRの革新は、反応に蛍光化学物質を添加することで、各サイクルでのPCR産物の合成を専門のサーモサイクラーによって「リアルタイム」で直接視覚化できるようになり、元のサンプルのテンプレート配列の量を定量化することが可能になります。量は通常、閾値サイクル(Ct、略称Ct)または蛍光生成物の量がバックグラウンドレベルを超えるPCRサイクルであるCqとも呼ばれます。

定量化は相対的であり得、1つの配列のCt値が別の標準配列または制御配列のCt値と比較されます。あるいは、反応中のサンプルと並行して既知の量の一連のDNAを分析すれば、蛍光値とDNA量を比較する標準曲線を作成することができ、サンプルDNAを絶対的に定量することができます。

qPCRで使用される蛍光分子には、大きく分けて2つのタイプがあります。1つのケースでは、二本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素が反応に含まれます。この色素はDNAに結合した場合にのみ蛍光を発するため、二本鎖DNA産物の量を定量することができます。

もう1つの方法では、プローブと呼ばれる短いDNAのストレッチが、目的の特定の標的配列に対して設計されます。プローブは、蛍光色素と、近接すると色素からの蛍光シグナルを抑制する「クエンチャー」分子に化学的に結合します。DNA産物を合成するポリメラーゼ酵素は、DNA分解活性を持ち、蛍光分子をプローブから「放出」させ、色素をクエンチャーから分離し、蛍光シグナルを検出することができます。

qPCRの原理を理解したところで、この手法を使用して、土壌サンプルから植物に感染するRNAウイルスであるコショウマイルドモトルウイルスを同定するためのプロトコルを見てみましょう。

このデモンストレーションでは、根とそれらの共生微生物の影響を受ける植物の根の周囲約7mmの土壌の領域である根圏からサンプルを採取します。

根圏の土壌を集めるには、まず地面から目的の植物を慎重に抽出し、それを叩いて余分なバルク土壌をできるだけ取り除きます。ラボでさらに処理するためにプラントをパッケージ化します。

サンプルをラボに持ち帰った後、滅菌ヘラを使用して、目的の土壌を収集容器にスクラップします。次に、土壌からウイルスを採取し、RNAを抽出します。

サンプルからRNAが収集されたら、逆転写を介して相補的またはcDNAに変換します。この手順の詳細については、逆転写PCRに関するJoVE SciEdのビデオを参照してください。

qPCRを実行する準備ができたら、凍結試薬を専用の層流フード内で室温で解凍し、解凍したら氷の上に置きます。DNAポリメラーゼ酵素を含む試薬成分は、常に氷上に保管してください。

サンプルのcDNAと、目的のアンプリコンがクローニングされたプラスミドと呼ばれる環状DNA片などのポジティブコントロールDNAを解凍します。

96ウェルqPCRプレートで反応を組み立てる前に、紙に96セルテーブルテンプレートを準備し、プレートにロードされる反応で各細胞をラベル付けします。各サンプルと標準試料の反応を三重に組み入れるとともに、ポジティブコントロールとネガティブコントロール(DNAなし反応など)についても含めます。

反応間で一定のすべての試薬を含む反応「マスターミックス」に必要な試薬量を計算します。すべてのサンプルとコントロールについて、三重反応に十分なマスターミックスを調製し、ピペッティングエラーを考慮してさらに10%を調製します。

試薬が解凍されたら、マスターミックスを1.5 mLの低吸着マイクロチューブに組み立てます。これを行うには、各試薬を短時間ボルテックスして十分に混合し、ミニ遠心分離機を使用してチューブの側面に液体を回収し、試薬をマイクロチューブにピペットで移します。反応成分ごとに新しいピペットチップを必ず使用してください。すべての試薬を添加した後、ボルテックスで混合し、遠心分離します。次に、適切な量のマスターミックスをPCRプレート上の指定されたウェルに分注します。

次に、サンプルとコントロールDNAを含む各チューブをボルテックスおよび遠心分離し、PCRプレート上の各ウェルに適切な量をピペットで移します。サンプルを追加したら、プレートをシーリングホイルでシールし、シーリングツールを使用してシールを完全に平らにし、気泡を押し出します。シールの端から非粘着タブを慎重にはがします。

反応混合物をウェルの底に完全に集めるには、反応プレートをプレートホルダー付きの遠心分離機に入れ、ローターとカウンターウェイトプレートのバランスを適切に取ります。プレートを1,000rpmまでパルス遠心分離し、その後、遠心分離機をブレーキなしでゆっくりと停止させます。

反応プレートをqPCRマシンに入れます。メーカーの仕様に従ってPCRプログラムを設定し、使用するプライマーペアに従って融解温度を設定します。実行する反応プログラムを設定します。

qPCRプログラムが完了すると、ソフトウェアはポジティブコントロールの既知の濃度を使用して、各反応のcDNAの量を計算できるようになります。その後、元のサンプル中のウイルスの量を計算できます。

qPCRプログラムが完了すると、ソフトウェアはポジティブコントロールの既知の濃度を使用して、各反応のcDNAの量を計算できるようになります。

qPCRの結果、ウェルに移送された量、土壌からの抽出、および逆転写からの因子により、初期土壌サンプル中のウイルスの数を計算できます。

qPCRがどのように行われるかがわかったところで、次はqPCRを使用してさまざまな環境サンプルを分析する方法を見てみましょう。

qPCRは、さまざまな種類のサンプルから回収されたウイルスの量を定量化するために使用できます。このアプリケーションでは、2種類のアデノウイルスを水サンプルからいくつかの異なる方法で濃縮しました。次に、ウイルスからDNAを抽出し、qPCRにかけ、濃縮法の相対的な効率を評価しました。

qPCRベースの微生物計数法のもう一つの用途は、食品や農業サンプル(この例では養鶏場からの糞便やトイレ砂のサンプル)中の細菌含有量を定量化することです。科学者たちは、個々の種を標的とするのではなく、すべての細菌に見られる高度に保存された遺伝子に対してプライマーを使用してqPCRを実施し、サンプルに見られる全細菌群集を定量しました。

最後に、前述のように、従来のqPCR法の欠点の1つは、生きた微生物と死んだ微生物を区別できないことです。しかし、モノアジドプロピジウム(PMA)として知られる化学物質を追加することで、DNAに結合してその後のPCRなどの酵素反応を阻害する死細胞にのみ侵入できるため、研究者は、汚染された食品や水に見られる一般的な病原株である大腸菌O157:H7の生培養物と死んだ培養物を区別することができました。

JoVEのqPCRを使用した環境微生物やウイルスの定量化の紹介をご覧になりました。これで、qPCRの仕組み、qPCRを使用して環境サンプル中の微生物の量を測定する方法、およびこの手法のいくつかのアプリケーションについて理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます!