X 線回折用結晶を成長
ソース: 博士ジミー フランコ - メリマック大学講座
X 線結晶構造解析、分子または複雑な三次元形状の決定は、結晶性固体中の原子の立体配置を決定するために一般的に使用される方法です。化合物の構造と機能は密接に関連するので特に重要です、化合物の立体構造を決定します。化合物の構造についての情報は、その…
1. クリスタル チューブとフィルターの準備
- 三角フラスコに NMR チューブを配置します。
- ピペット フィルターを準備します。
- ピペットで糸くずワイプ (1 インチ 1 インチ) の部分を配置することによってフィルターを作成し、ピペット (図 1) のボトルネック部分にワイプをしっかりとくさびにロッドを使用します。
- 必要なすべてのクリスタル チューブ 2 ピペット フィルターを確認します。
2. クリスタル チューブにサンプルを追加します。
- (テトラフェニルポルフィリン、10 mg) 化合物を溶媒 (ジクロロ メタン) 0.75 mL に溶かしてください。
- ピペットと優しくフィルターを通すことで、チューブの先頭に混合物を追加します。
- 粒子につながる小さな希望の大きい単結晶ではなく複数の結晶核生成サイトの作成を避けるために除外されます。
- サンプルは、非常にゆっくりと優しくクリスタル チューブに配置されている、一度は、新しいフィルター ピペットからチューブに反溶剤 (メタノールの 1.5 mL) を追加します。以前に追加されたソリューション (図 2) にゆっくりとレイヤーに反溶媒を許可します。ピペットを介した溶媒をプッシュ、溶剤が自体がフィルターを通過できるように電球を使用しないでください。
- 密度が高い溶剤がまずクリスタル チューブに追加されることを確認します。
- 2 つの溶剤がお互い混和性であることを確認します。これは、溶媒を添加する前に実行されます。
- NMR キャップとチューブをシールします。
3. 結晶成長
- 混合する 2 つの溶媒を起こさずどこ彼らは邪魔されないキャビネットにクリスタル ・尿管を配置します。
- 結晶化時間と変わる各化合物 - 通常チューブに委ねられること邪魔されず週クリスタル。
- 週後で、結晶成長用チューブを検査します。
- 結晶成長は通常 2 つの溶媒の界面で発生します。
- 結晶成長の証拠のための管を目視で確認します。化合物結晶形成の付加的な時間を必要とする場合、溶剤の混合を容易にしない注意します。
- 結晶成長が起こった場合、さらに検査を顕微鏡を使用してチューブ。
4. 結晶選択
- X 線回折による結晶はよく顔を定義した必要があります。
- 可能であれば避けるべきである一緒にクラスター化した結晶。
- 回折計の結晶を配置する前にすぐに、結晶を収穫する準備ができるまで、クリスタル管に結晶を残します。
- チューブの結晶を維持する溶媒和を結晶に残るようになります。解消の溶媒和を割るため、結晶が発生し、結晶の回折を妨げます。
図 1。ピペット フィルターのイメージ。-リントフリーの小片がしっかりとピペットのボトルネックでくさびで留められています。ソリューションは、クリスタル管に導入される前にこれらのピペット フィルターも渡されます。
図 2。クリスタル チューブで対象となる化合物を含むソリューションを配置すると、新しいピペット フィルターを通すことでは、反溶媒の上は層ゆっくり。
その構造を決定するには、単結晶が必要です。結晶の品質は、構造決定の品質と精度に大きく影響します。
単結晶とは、分子の配置が3次元すべてで繰り返される固体のことです。結晶性固体内の原子の空間配置は、X線結晶構造解析を使用して決定できます。この手法では、純粋な結晶性サンプルをX線ビームで包みます。結晶は、結晶構造と分子組成に関連する独特のパターンでX線を回折します。結晶の形成が速すぎると、分子が乱れたり、不純物が結晶に取り込まれたり、1つの結晶の代わりに2つ以上の融合結晶が形成されたりする可能性があります。そのため、X線結晶構造解析に十分な品質の結晶を作製するためには、成長の遅さを重視した特殊な方法が必要です。
このビデオでは、X線品質の結晶の望ましい特性を説明し、それらを成長させる手順を示し、化学におけるこの技術のいくつかのアプリケーションを紹介します。
電子が当たると球状のX線波を放出することでX線を散乱します。原子が整然と配置されている場合、波間の建設的な干渉により、X線検出器に特徴的な回折パターンが生成されます。結晶はビーム内で回転し、複数の角度から回折パターンを収集します。十分な回折パターンがあれば、分子構造を導き出すことができます。
X線品質の結晶は、一般に対称的な形状を形成し、滑らかで光を反射する面を持っています。偏光顕微鏡で見ると透明になりますが、90度回転させるとほとんどは暗くなるはずです。これは、高度に順序付けられた構造を示します。これらの結晶を成長させるために、液液拡散がよく使用されます。これは、2つの混和性溶媒を使用します:低密度溶媒、または沈殿剤で、再結晶する化合物が不溶性です。化合物が可溶性である高密度溶媒。通常、沈殿物と溶媒の体積比は2:1です。
低密度沈殿剤は、高密度溶媒中の化合物の濃縮溶液上に層状にされます。時間が経つにつれて、沈殿物が溶液と混合するにつれて、化合物の溶解性が低下します。溶媒界面が小さいほど拡散速度が遅くなり、より大きく、より純度の高い結晶が得られます。X線品質の結晶を成長させる原理を理解したところで、次は液液拡散法で結晶を成長させる手順を見ていきましょう。
まず、テキストプロトコルにある必要な機器を入手します。化合物用の溶媒と密度の低い沈殿物を入手します。
ピペットフィルターを準備するには、ガラスピペットの上部にキムワイプの小片を置き、紙に穴を開けないように注意しながら、ロッドまたは別のピペットのステムを使用して紙をピペット本体の底まで静かに押し下げます。ピペットフィルターを2つ用意します。1本をNMRチューブに入れます。必要に応じて、実験室clでアセンブリを固定しますamp リングスタンド。再結晶する化合物を約10 mgの溶媒0.75 mLに溶解します。
次に、サンプル溶液をピペットフィルターに慎重に追加します。上部に球根を取り付け、ゆっくりと絞って溶液をNMRチューブに通し、固形不純物を取り除きます。電球を取り付けたまま再膨張させないでください、吸引によって濾紙が外れます。
次に、使用済みのピペットフィルターを取り外し、2つ目のフィルターをNMRチューブに入れます。約1.5mLの沈殿物をチューブにピペットで入れます。溶媒が重力によってフィルターを通過するのを待ちます。これからは、操作中にフィルターを乱さないように注意してください。すべての沈殿物がチューブにろ過されたら、フィルターを取り外し、チューブにキャップをします。キャビネットなど、攪拌されない場所に置いてください。
少なくとも1日後、チューブの結晶成長を検査します。結晶が存在しない場合、または結晶が非常に小さい場合は、サンプルチューブを邪魔せずに放置してください。結晶が見える場合は、溶媒層を乱さずに結晶の大きさや形状を確認してください。
結晶が大きく、明確に定義され、クラスター化されていない場合は、顕微鏡で結晶を検査して、X線品質になる可能性を確認します。回折計がスキャンを開始する準備ができるまで、チューブから結晶を取り出さないでください。結晶構造に溶媒分子が組み込まれている場合、結晶を乾燥させると結晶が劣化します。X線結晶構造解析を用いて、この暗赤色紫色の結晶の分子構造がテトラフェニルポルフィリンであることが確認されました。
X線結晶構造解析は、化学および生化学において不可欠な分析ツールです。
再結晶方法には、加熱と冷却、液液拡散、蒸気拡散、およびゆっくりとした蒸発が含まれます。単一溶媒系のゆっくりとした蒸発では、化合物を少量の溶媒に溶解し、キャップに小さな穴が開いた容器に入れます。溶媒が蒸発すると、化合物が結晶化し始めるまで濃度が増加します。
タンパク質の機能性は、多くの場合、その構造に関連しています。しかし、タンパク質は結晶化が非常に難しい場合があります。X線品質のタンパク質結晶を成長させるには、専門的な技術を開発する必要があります。ここでは、一滴のタンパク質溶液を一滴の沈殿物と混合し、この混合物を純粋な沈殿物の入ったチャンバーに密封します。溶媒蒸気が液滴から拡散すると、液滴中のタンパク質の溶解度が低下し、タンパク質はゆっくりと結晶化します。別の技術は、タンパク質溶液と沈殿物を鉱油の下に混合します。これらの技術を用いて、様々なタンパク質を結晶化して分析することができます。
粉末回折では、可能な各空間配向がサンプル内で同時に表されます。粉末回折は、三次元構造データが失われるため、単結晶X線回折ほど構造に関する情報が豊富ではありません。それどころか、粉末回折は、結晶性固体の混合物の分析や、アモルファス構造の結晶化度の評価に優れています。
JoVEのX線結晶構造解析用の成長結晶の紹介をご覧になりました。X線品質の結晶の特性、それらを成長させる手順、および化学におけるこの技術のいくつかの適用について、今では精通しているはずです。
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Q1: What makes a crystal suitable for X-ray diffraction analysis?
X-ray-quality crystals form symmetric shapes with smooth, light-reflecting faces. Under a polarizing microscope, they appear transparent but turn dark when rotated 90 degrees, indicating highly ordered molecular arrangement. This ordered structure is essential because crystal quality directly influences the accuracy of structural determination in X-ray crystallography.
Q2: Why does slow crystal growth produce better results for X-ray analysis?
Rapid crystal formation causes molecular disorder, incorporates impurities, or creates fused crystals instead of single crystals. Slow growth allows molecules to arrange orderly and prevents contamination. A smaller solvent interface during liquid-liquid diffusion reduces the diffusion rate, yielding larger, purer crystals suitable for X-ray crystallography.
Q3: How does liquid-liquid diffusion work in crystal growth?
Liquid-liquid diffusion uses two miscible solvents: a low-density precipitant where the compound is insoluble, and a high-density solvent where it dissolves. The precipitant is layered onto the concentrated compound solution. As the precipitant gradually mixes with the solution, the compound becomes less soluble, causing slow, controlled crystallization that produces high-quality crystals.
Q4: What is the role of the pipette filter in the crystal growth procedure?
The pipette filter removes solid impurities from the compound solution before crystallization begins. A small piece of Kimwipe is placed in the glass pipette and pressed to the bottom. The sample solution passes through the filter by gentle bulb pressure, ensuring only pure dissolved compound enters the NMR tube for clean crystal formation.
Q5: How does X-ray crystallography determine molecular structure?
When X-rays hit a crystal with ordered atoms, electrons scatter the rays, producing constructive interference and a characteristic diffraction pattern. The crystal is rotated to collect patterns from multiple angles. With sufficient diffraction data, the three-dimensional spatial arrangement of atoms can be derived, revealing the molecule's complete structure and composition.
Q6: What alternative methods can be used to grow X-ray-quality crystals?
Besides liquid-liquid diffusion, recrystallization methods include vapor diffusion, slow evaporation, and heating-cooling cycles. In slow evaporation, the compound dissolves in solvent in a container with a small hole; as solvent evaporates, concentration increases until crystallization occurs. Protein crystallization often requires specialized techniques like purifying compounds by recrystallization under mineral oil.
Q7: Why is single-crystal X-ray diffraction preferred over powder diffraction?
Single-crystal X-ray diffraction preserves three-dimensional structural information because each crystal orientation is distinct. Powder diffraction loses this spatial data since all possible orientations exist simultaneously in the sample. While powder diffraction excels at analyzing crystalline mixtures and assessing amorphous structure crystallinity, single-crystal methods provide superior structural detail for determining molecular shape.