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ソース: 博士ジミー フランコ - メリマック大学講座
X 線結晶構造解析、分子または複雑な三次元形状の決定は、結晶性固体中の原子の立体配置を決定するために一般的に使用される方法です。化合物の構造と機能は密接に関連するので特に重要です、化合物の立体構造を決定します。化合物の構造についての情報は、その動作や反応を説明するためによく使用されます。これは、化合物の立体構造を解決するための最も有用な技術の 1 つまたは複雑で、場合によっては構造の決定の唯一の現実的な方法があります。X 線質の結晶成長は、x 線結晶構造解析の重要なコンポーネントです。サイズと結晶の品質は、x 線結晶構造解析で検討されている化合物の組成に依存されます。通常より重い原子を含む化合物は大きい回折パターンを作り出す、従ってより小さい結晶が必要があります。一般的には、明確に定義された面を持つ単結晶が最適と通常有機化合物の結晶は重原子が含まれているものよりも大きくなければなりません。実行可能な結晶は、なし、x 線結晶構造解析は不可能です。いくつかの分子が他の人よりも本質的により結晶、従って x 線品質の結晶を得ることの難しさは、化合物によって異なります。X 線結晶の成長は、高品質の結晶を製造に重点を置いたが、化合物を浄化するために使用される再結晶過程に似ています。多くの場合、高品質結晶は結晶化のプロセス遅く、日または数か月にわたって発生することがありますを許可することで取得できます。
1. クリスタル チューブとフィルターの準備
2. クリスタル チューブにサンプルを追加します。
3. 結晶成長
4. 結晶選択
図 1。ピペット フィルターのイメージ。-リントフリーの小片がしっかりとピペットのボトルネックでくさびで留められています。ソリューションは、クリスタル管に導入される前にこれらのピペット フィルターも渡されます。
図 2。クリスタル チューブで対象となる化合物を含むソリューションを配置すると、新しいピペット フィルターを通すことでは、反溶媒の上は層ゆっくり。
単結晶は、その構造の決定のため必要です。結晶の品質は大きく品質と構造決定の精度に影響します。
単結晶は、固体の分子配列がすべての 3 つの次元で繰り返されます。結晶性の固体内の原子の空間的な整理は、x 線結晶構造解析を使用して決定できます。この手法では、純粋な結晶のサンプルは、x 線のビームで包まれています。結晶は、結晶構造と分子の組成に関連する特徴的なパターンで x 線を引き起こします。結晶が余りにすぐに形成される場合分子が乱れること、不純物は結晶に組み込むことができるまたは 2 つ以上の溶融結晶の単結晶ではなくフォームがあります。したがって、x 線結晶構造解析のための十分な品質の結晶を生成する低成長に重点を置いた特殊なメソッドが必要です。
このビデオが x 線質結晶の所望の特性を示すため、成長する、それらのための手順を示すし、化学でこの技術のいくつかのアプリケーションをご紹介します。
電子散乱 x 線球面 x 線を生成することによって波のときにヒットします。原子が整然とした配置で、建設的な干渉波は x 線検出器の特徴的な回折パターンを生成します。結晶は、複数の角度からの回折パターンを収集するビーム内で回転します。十分な回折パターンを持つ分子構造が得られます。
X 線質の結晶は一般に対称図形を形成し、滑らかで、光反射面を持ちます。偏光顕微鏡下で見ると、彼らは透明になりますが、ほとんど暗いとき回転 90 ° になる必要があります。これは高度秩序構造を示します。これらの結晶を成長し、液相の拡散がよく使用されます。これは 2 つの混和性溶剤を採用しています: 低密度の溶媒または再結晶する化合物は溶ける; ない鉛塩法高密度溶媒化合物が水溶性であります。通常、溶剤に沈殿の体積の比は 2:1 です。
低密度鉛塩法は、高密度の溶媒の化合物の集中された解決に組み込まれます。時間をかけて化合物になりますソリューションを沈殿ミックスとして難溶。小さい溶剤インターフェイス拡散、従ってより大きいより純粋な結晶を降伏の遅い速度で起因します。今では成長している x 線質結晶の原理を理解しては、液相拡散によるそれらの成長のプロシージャを行ってみましょう。
まず、テキスト プロトコルは、必要な機器を取得します。化合物と共沈剤密度の低い溶媒を取得します。
ピペット フィルターを準備するには、ガラス ピペットの上部にキムワイプの小片を置き、軽くロッドまたは紙を穿刺しないように注意して、別のピペットの茎を使用してピペット本体の底に紙を押します。2 つのピペット フィルターを準備します。NMR チューブに 1 つを配置します。必要に応じて、研究室クランプ ・ リング スタンド付きアセンブリを固定します。0.75 ml の溶媒再結晶する化合物の約 10 mg を溶解します。
今、ピペット フィルターにサンプル ソリューションを慎重に追加します。一番上に電球を貼るし、固体不純物を除去する NMR チューブにソリューションを渡すゆっくりと絞る。電球吸引フィルター紙が取り除かれます、それが接続されているを再展開することはできません。
次に、使用されるピペット フィルターを削除し、NMR チューブに 2 番目のフィルターを配置します。管に鉛塩法の約 1.5 mL のピペットします。溶剤が重力によってフィルターを通過を許可します。さあ今から任意の操作中にフィルターを邪魔しないように注意してください。一度、鉛塩法のすべては管にフィルタ リングは、フィルターを削除し、チューブのキャップします。キャビネットまたは他の簡単にチェック場所それがない興奮する場所にそれを配置します。
少なくとも 1 日後結晶成長用チューブを検査します。結晶が存在しない、水晶が非常に小さい場合は、サンプル チューブを平静のままにします。結晶が表示されている場合は、溶媒層を乱すことがなく、サイズや形状を確認します。
結晶は、大規模な明確に定義された、一緒にクラスター化されていない場合は、線質になる自分の可能性を確認するには顕微鏡下で結晶を調べます。回折計のスキャンを開始する準備が整うまで、チューブから結晶を削除しないでください。溶媒分子は、結晶構造に組み込まれている、乾燥して結晶を許可すると、結晶が低下します。X 線結晶構造解析を使用して、これらの暗い赤紫色の結晶の分子構造はテトラフェニルポルフィリンを検証しました。
X 線結晶構造解析は化学および生物化学の重要な分析ツールです。
加熱と冷却、液体液体拡散、水蒸気拡散および遅い蒸発再結晶の方法があります。単一溶媒系の遅い蒸発で化合物は少量の溶媒に溶解し、キャップに小さな穴が開いて、コンテナー内に配置します。溶媒が蒸発する化合物が結晶化を開始するまでの濃度が増加します。
蛋白質の機能多くの場合、構造に関連します。ただし、タンパク質は結晶化する非常に困難することができます。専門技術は、蛋白質の X 線質結晶を成長する開発する必要があります。ここでは、タンパク質溶液の一滴は鉛塩法の滴と混合され、この混合物は純粋な鉛塩法とチャンバーのシールします。溶剤の蒸気は、ドロップのうち拡散、ドロップでタンパク質の溶解度を減少させるとタンパク質がゆっくり結晶します。別の手法は、タンパク質溶液、鉱物油の下で鉛塩法をミックスします。これらのテクニックを使用して、様々 なたんぱく質が分析のため結晶することができます。
粉末回折法、各可能な空間的なオリエンテーションは同時にサンプルで表されます。粉末回折は、立体構造データの損失のため、単結晶 x 線回折と構造についての情報です。代わりに、粉末回折は、結晶性固体の混合物を分析し、非晶質構造の結晶性の評価に優れています。
X 線結晶構造解析のための結晶成長にゼウスの導入を見てきただけ。成長し、化学でこの技術のいくつかのアプリケーションのためのプロシージャ、x 線質結晶の特性に精通している必要がありますできます。
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その構造を決定するには、単結晶が必要です。結晶の品質は、構造決定の品質と精度に大きく影響します。
単結晶とは、分子の配置が3次元すべてで繰り返される固体のことです。結晶性固体内の原子の空間配置は、X線結晶構造解析を使用して決定できます。この手法では、純粋な結晶性サンプルをX線ビームで包みます。結晶は、結晶構造と分子組成に関連する独特のパターンでX線を回折します。結晶の形成が速すぎると、分子が乱れたり、不純物が結晶に取り込まれたり、1つの結晶の代わりに2つ以上の融合結晶が形成されたりする可能性があります。そのため、X線結晶構造解析に十分な品質の結晶を作製するためには、成長の遅さを重視した特殊な方法が必要です。
このビデオでは、X線品質の結晶の望ましい特性を説明し、それらを成長させる手順を示し、化学におけるこの技術のいくつかのアプリケーションを紹介します。
電子が当たると球状のX線波を放出することでX線を散乱します。原子が整然と配置されている場合、波間の建設的な干渉により、X線検出器に特徴的な回折パターンが生成されます。結晶はビーム内で回転し、複数の角度から回折パターンを収集します。十分な回折パターンがあれば、分子構造を導き出すことができます。
X線品質の結晶は、一般に対称的な形状を形成し、滑らかで光を反射する面を持っています。偏光顕微鏡で見ると透明になりますが、90度回転させるとほとんどは暗くなるはずです。これは、高度に順序付けられた構造を示します。これらの結晶を成長させるために、液液拡散がよく使用されます。これは、2つの混和性溶媒を使用します:低密度溶媒、または沈殿剤で、再結晶する化合物が不溶性です。化合物が可溶性である高密度溶媒。通常、沈殿物と溶媒の体積比は2:1です。
低密度沈殿剤は、高密度溶媒中の化合物の濃縮溶液上に層状にされます。時間が経つにつれて、沈殿物が溶液と混合するにつれて、化合物の溶解性が低下します。溶媒界面が小さいほど拡散速度が遅くなり、より大きく、より純度の高い結晶が得られます。X線品質の結晶を成長させる原理を理解したところで、次は液液拡散法で結晶を成長させる手順を見ていきましょう。
まず、テキストプロトコルにある必要な機器を入手します。化合物用の溶媒と密度の低い沈殿物を入手します。
ピペットフィルターを準備するには、ガラスピペットの上部にキムワイプの小片を置き、紙に穴を開けないように注意しながら、ロッドまたは別のピペットのステムを使用して紙をピペット本体の底まで静かに押し下げます。ピペットフィルターを2つ用意します。1本をNMRチューブに入れます。必要に応じて、実験室clでアセンブリを固定しますamp リングスタンド。再結晶する化合物を約10 mgの溶媒0.75 mLに溶解します。
次に、サンプル溶液をピペットフィルターに慎重に追加します。上部に球根を取り付け、ゆっくりと絞って溶液をNMRチューブに通し、固形不純物を取り除きます。電球を取り付けたまま再膨張させないでください、吸引によって濾紙が外れます。
次に、使用済みのピペットフィルターを取り外し、2つ目のフィルターをNMRチューブに入れます。約1.5mLの沈殿物をチューブにピペットで入れます。溶媒が重力によってフィルターを通過するのを待ちます。これからは、操作中にフィルターを乱さないように注意してください。すべての沈殿物がチューブにろ過されたら、フィルターを取り外し、チューブにキャップをします。キャビネットなど、攪拌されない場所に置いてください。
少なくとも1日後、チューブの結晶成長を検査します。結晶が存在しない場合、または結晶が非常に小さい場合は、サンプルチューブを邪魔せずに放置してください。結晶が見える場合は、溶媒層を乱さずに結晶の大きさや形状を確認してください。
結晶が大きく、明確に定義され、クラスター化されていない場合は、顕微鏡で結晶を検査して、X線品質になる可能性を確認します。回折計がスキャンを開始する準備ができるまで、チューブから結晶を取り出さないでください。結晶構造に溶媒分子が組み込まれている場合、結晶を乾燥させると結晶が劣化します。X線結晶構造解析を用いて、この暗赤色紫色の結晶の分子構造がテトラフェニルポルフィリンであることが確認されました。
X線結晶構造解析は、化学および生化学において不可欠な分析ツールです。
再結晶方法には、加熱と冷却、液液拡散、蒸気拡散、およびゆっくりとした蒸発が含まれます。単一溶媒系のゆっくりとした蒸発では、化合物を少量の溶媒に溶解し、キャップに小さな穴が開いた容器に入れます。溶媒が蒸発すると、化合物が結晶化し始めるまで濃度が増加します。
タンパク質の機能性は、多くの場合、その構造に関連しています。しかし、タンパク質は結晶化が非常に難しい場合があります。X線品質のタンパク質結晶を成長させるには、専門的な技術を開発する必要があります。ここでは、一滴のタンパク質溶液を一滴の沈殿物と混合し、この混合物を純粋な沈殿物の入ったチャンバーに密封します。溶媒蒸気が液滴から拡散すると、液滴中のタンパク質の溶解度が低下し、タンパク質はゆっくりと結晶化します。別の技術は、タンパク質溶液と沈殿物を鉱油の下に混合します。これらの技術を用いて、様々なタンパク質を結晶化して分析することができます。
粉末回折では、可能な各空間配向がサンプル内で同時に表されます。粉末回折は、三次元構造データが失われるため、単結晶X線回折ほど構造に関する情報が豊富ではありません。それどころか、粉末回折は、結晶性固体の混合物の分析や、アモルファス構造の結晶化度の評価に優れています。
JoVEのX線結晶構造解析用の成長結晶の紹介をご覧になりました。X線品質の結晶の特性、それらを成長させる手順、および化学におけるこの技術のいくつかの適用について、今では精通しているはずです。
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