細菌のコロニーからコミュニティの DNA の抽出

1. 細菌群集の DNA の抽出

1. 手順を開始するには、ふるわれた土壌の 100 グラムを重量を量る。ポリプロピレン容器にこれを追加し、100 mL の Tris バッファーは土壌マトリックスからの細菌の放出を促進し、手で振る EDTA と改正から成る抽出バッファーを追加します。
2. 次に、ガラス玉の 100 g の重量を量るし、混合容器にこれらを追加します。デバイスや、混合物を 15 分追加 10 mL 20% ドデシル硫酸ナトリウム、または SDS のメカアクション手首シェーカーを破ってビーズを使用して 5 分間サンプルを扇動し、追加分のために振といます。60 分の 60 から 65 ° C の高温で孵化させなさい。
3. 同様に別の 50 mL チューブの中でサンプルを配布し、6,000 x g. で 10 分間遠心は単一の滅菌コンテナーにチューブから上澄みを転送します。次に、抽出バッファーの新鮮なボリュームを使用して、上記のとおり土壌ペレットに抽出を繰り返します。
4. 次に、ボリュームも半分に満ちている 30% ポリエチレング リコールと 1.6 M 塩化ナトリウムの解決策クリーン 50 mL チューブに処理された上澄み、約 200 mL の容量を追加します。ミックスするボトルの数回を手で反転し、DNA をペレットに 20 分間、10,000 × g で遠心分離機サンプル 2 のため室温で孵化させなさい。
5. 部分精製核酸の餌を残して、遠心分離機管から上澄みを慎重に削除します。20 mL TE バッファーの渦、ペレットを再懸濁しますに 7.5 M カリウム酢酸溶液 1.5 mL を追加します。タンパク質と多糖類の沈殿物に 4 ° C で 30 分間 16,000 x g で 5 分遠心分離機氷の懸濁液を場所します。
6. 次に、RNAse とプロテイナーゼ K をサンプルに追加する、手でやさしく混ぜて、しばらく放置します。抽出してミックスする懸濁液にフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1 の比率の混合物) の相当量を追加そっと手で。遠心分離機 13,000 x g に 10 分のための準備は、遠心分離機、注 2 つのレイヤーから船を慎重に取り外します。
7. 下、重い層フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールで構成されています、破片を抽出し、最上位のレイヤーは水性 DNA が含まれています。滅菌容器に水相を配置、イソプロパノールの相当量を追加して、DNA の沈殿物を開始する優しく反転します。30 分は上澄みを慎重に取り外しますと小球形にされた DNA 可能性がありますまたは可能性がありますいない容器の下部に表示される 1 mL の TE バッファーで、再懸濁しますの 16,000 × g で遠心分離によって常温 2 h. ペレット精製 DNA の懸濁液を孵化させなさい。
8. 分光光度計または DNA ・ RNA 定量蛍光を使用して、サンプルから抽出した DNA のレベルを測定します。DNA の量は 260 nm 読書から推定されます。1.0 の吸読書、DNA 溶液の mL あたり 50 μ g に相当します。濃度が正確な測定値の高すぎる場合希釈懸濁液 10 を 1 または 100 に 1 分子レベルの水を使用します。
9. 260 で読書の割合から推定される DNA の純度を 280 nm nm。値 > 1.7 比較的純粋な DNA を示します。最大理論値は 2.0 です。