2.6: 細菌のコロニーからコミュニティの DNA の抽出

1. 細菌群集の DNA の抽出

1. 手順を開始するには、ふるわれた土壌の 100 グラムを重量を量る。ポリプロピレン容器にこれを追加し、100 mL の Tris バッファーは土壌マトリックスからの細菌の放出を促進し、手で振る EDTA と改正から成る抽出バッファーを追加します。
2. 次に、ガラス玉の 100 g の重量を量るし、混合容器にこれらを追加します。デバイスや、混合物を 15 分追加 10 mL 20% ドデシル硫酸ナトリウム、または SDS のメカアクション手首シェーカーを破ってビーズを使用して 5 分間サンプルを扇動し、追加分のために振といます。60 分の 60 から 65 ° C の高温で孵化させなさい。
3. 同様に別の 50 mL チューブの中でサンプルを配布し、6,000 x g. で 10 分間遠心は単一の滅菌コンテナーにチューブから上澄みを転送します。次に、抽出バッファーの新鮮なボリュームを使用して、上記のとおり土壌ペレットに抽出を繰り返します。
4. 次に、ボリュームも半分に満ちている 30% ポリエチレング リコールと 1.6 M 塩化ナトリウムの解決策クリーン 50 mL チューブに処理された上澄み、約 200 mL の容量を追加します。ミックスするボトルの数回を手で反転し、DNA をペレットに 20 分間、10,000 × g で遠心分離機サンプル 2 のため室温で孵化させなさい。
5. 部分精製核酸の餌を残して、遠心分離機管から上澄みを慎重に削除します。20 mL TE バッファーの渦、ペレットを再懸濁しますに 7.5 M カリウム酢酸溶液 1.5 mL を追加します。タンパク質と多糖類の沈殿物に 4 ° C で 30 分間 16,000 x g で 5 分遠心分離機氷の懸濁液を場所します。
6. 次に、RNAse とプロテイナーゼ K をサンプルに追加する、手でやさしく混ぜて、しばらく放置します。抽出してミックスする懸濁液にフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1 の比率の混合物) の相当量を追加そっと手で。遠心分離機 13,000 x g に 10 分のための準備は、遠心分離機、注 2 つのレイヤーから船を慎重に取り外します。
7. 下、重い層フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールで構成されています、破片を抽出し、最上位のレイヤーは水性 DNA が含まれています。滅菌容器に水相を配置、イソプロパノールの相当量を追加して、DNA の沈殿物を開始する優しく反転します。30 分は上澄みを慎重に取り外しますと小球形にされた DNA 可能性がありますまたは可能性がありますいない容器の下部に表示される 1 mL の TE バッファーで、再懸濁しますの 16,000 × g で遠心分離によって常温 2 h. ペレット精製 DNA の懸濁液を孵化させなさい。
8. 分光光度計または DNA ・ RNA 定量蛍光を使用して、サンプルから抽出した DNA のレベルを測定します。DNA の量は 260 nm 読書から推定されます。1.0 の吸読書、DNA 溶液の mL あたり 50 μ g に相当します。濃度が正確な測定値の高すぎる場合希釈懸濁液 10 を 1 または 100 に 1 分子レベルの水を使用します。
9. 260 で読書の割合から推定される DNA の純度を 280 nm nm。値 > 1.7 比較的純粋な DNA を示します。最大理論値は 2.0 です。

細菌群集DNA抽出は、単一の抽出手順で群集内の複数の細菌種からDNAを取得するプロセスです。

土壌中の微生物群集の従来の分析には、通常、さまざまな選択培地に対する希釈およびプレーティング方法を利用した培養アッセイが含まれていました。しかし、多くの細菌は、実験室の条件下では、または選択した特定の増殖培地条件下では増殖しにくいため、見逃されたり、著しく過小評価されたりする可能性があります。

最近では、土壌細菌サンプルからコミュニティDNAを抽出することで、細菌コミュニティのより包括的なサンプリングが可能になりました。この非文化ベースのアプローチは、伝統的な文化に基づく方法よりも、存在する実際のコミュニティをより代表していると考えられています。

このビデオでは、細菌群集DNA抽出の非培養方法、抽出されたDNAの品質と量を確認する方法、およびこのDNAを細菌の多様性を研究するためにこのDNAをどのように利用できるかを探ります。

土壌からのDNA抽出は、2つの方法のいずれかで行うことができます。分画法では、遺伝物質を抽出する前に、まず細胞を土壌マトリックスから分離します。次に、サンプルをブレンドと低速遠心分離の連続サイクルにかけ、ペレット内の無傷の細胞を収集します。

次に、リゾチームを細胞に添加し、懸濁液をインキュベートします。リゾチームは、細菌の細胞壁を破壊する酵素です。細胞壁の構造が損なわれると、DNAは精製のために解放される可能性があります。しかし、コミュニティDNA抽出の2番目の方法であるin situ法は、より高いDNA濃度をもたらすことが示されています。

ここでは、大量の土壌を同量のTris-EDTA抽出バッファーおよびガラスビーズと組み合わせ、積極的に混合して、土壌粒子からの細胞の分離を促進します。次に、界面活性剤、通常はドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を添加し、サンプルをさらにブレンドして、細胞の溶解とDNAを含む内容物の放出を促進します。

次に、高温でのインキュベーションを行い、残っている細菌細胞を溶解します。サンプルを遠心分離し、上清に対してポリエチレングリコールの抽出とインキュベーションを行い、DNAを沈殿させた後、DNAを遠心分離してペレットにします。

DNAをTEバッファーと酢酸カリウムに再懸濁して、タンパク質と多糖類のDNAをさらに洗浄し、遠心分離を行ってこれらの望ましくない成分をペレット化します。DNAを含む水性上清を除去し、フェノール-クロロホルム抽出とイソプロパノール沈殿を行い、DNAをさらに洗浄および濃縮します。室温で 2 時間のインキュベーションを行った後、DNA を遠心分離し、TE Buffer に再懸濁して分析まで保存します。

細菌群集のDNA抽出の背後にある概念とプロセスを理解したところで、研究室でそれがどのように行われているかを見てみましょう。

手順を開始するには、ふるいにかけた土壌100 gを量ります。これをポリプロピレン容器に加え、土壌マトリックスからの細菌の放出を促進するためにEDTAで修正したTrisバッファーからなる抽出バッファー100mLを加え、手で振とうします。

次に、ガラスビーズ100gを秤量し、これらを混合容器に加えます。ビーズビート装置または機械式手首アクションシェーカーを使用して、サンプルを5分間撹拌します。混合物に10 mLの20%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加え、さらに1分間撹拌します。.

サンプルを別々の50 mLチューブに均等に分配し、6,000 x gで10分間遠心分離します。上清をチューブから単一の滅菌容器に移します。次に、前述したように、新鮮な量の抽出バッファーを使用して、土壌ペレット上で抽出を繰り返します。

次に、処理した上清の全量を、30% ポリエチレングリコールと 1.6 M 塩化ナトリウムの溶液で半分の容量まで充填したきれいな 50 mL チューブに加えます。ボトルを手で数回反転させて混合し、室温で2時間インキュベートします。サンプルを10,000 x gで20分間遠心分離し、DNAをペレット化します。

遠心分離チューブから上清を慎重に取り除き、部分的に精製された核酸ペレットを残します。20 mLのTEバッファーと1.5 mLの7.5 M酢酸カリウム溶液を加えてペレットを再懸濁し、次にボルテックスします。サスペンションを氷の上に5分間置きます。16,000 x gで30分間、4 ?Cはタンパク質と多糖類を沈殿させます。

次に、RNAseとプロテイナーゼKをサンプルに加え、手で穏やかに混合し、しばらく放置します。抽出する懸濁液に等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを加え、手で穏やかに混合します。調製物を13,000 x gで10分間遠心分離します。容器を遠心分離機から慎重に取り外し、2つの層に注意してください。

下の重い層はフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールと抽出された破片で構成され、最上層は水性でDNAを含んでいます。水相を滅菌容器に入れ、等量のイソプロパノールを加え、穏やかに反転させてDNA沈殿を開始します。懸濁液を室温で2時間インキュベートします。精製したDNAを16,000 x gで30分間遠心分離してペレット化します。ペレット化されたDNAが容器の底に見える場合と見えない場合があるため、上清を慎重に取り除き、1 mLのTEバッファーに再懸濁します。

分光光度計またはDNA/RNA定量蛍光計を使用して、サンプルから抽出したDNAのレベルを測定します。DNA/RNA蛍光計は、ナノグラム/ミリリットル単位でDNAレベルを出力します。濃度が高すぎて正確に読み取ることができない場合は、分子グレードの水を使用して懸濁液を1〜10、または1〜100に希釈します。

細菌群集からDNAを取得すると、これはさまざまな方法で利用できます。ここでは、これらのアプリケーションの一部について説明します。

コミュニティDNAから抽出されたDNAの分光写真分析は、特定の土壌サンプルに存在する細菌細胞の数についての洞察を提供することができます。溶液1mLあたりのDNAの推定量(ng)は、溶液中で抽出されたDNAの総量に関連付けることができ、土壌1gあたりのDNAの総量を求めることができます。細胞あたりのDNAの理論値を知ることで、土壌1gあたりの細胞の総数を計算できます。

よりターゲットを絞ったアプリケーションでは、細菌群集から抽出したDNAをPCRにかけ、特定の種が群集内に存在するかどうかを判断できます。たとえば、科学者は、土壌サンプルにClostridium perfringensやBacillus anthracisなどの特定の病原体が含まれているかどうかを特定したい場合があります。

最後に、コミュニティに存在する細菌をより包括的に理解するために、DNAサンプルを「オミック」およびバイオインフォマティクス特性評価にかけ、サンプル内の元の細菌をより深く分析することができます。?オミクス?では、生物やコミュニティにおける分子の役割、関係、および作用を調査するさまざまなテクノロジについて説明します。これには、遺伝子とその機能の研究が含まれますか?ゲノミクス?、そして?プロテオミクス、タンパク質とその役割の研究。たとえば、16Sのシーケンシング?サンプルから採取したRNAは、コミュニティ内の特定の種のメタゲノム測定を可能にし、多様性をより詳細に推定することができます。このアプローチにより、科学者はコミュニティの種構成と、彼らがどのような役割を担っているかをよりよく理解できます。

JoVEの細菌群集DNA抽出の紹介をご覧になりました。これで、細菌群集からDNAを抽出する方法、このDNAの品質を確認する方法、およびこのDNAを細菌群集の構成の調査にどのように使用できるかを理解できたはずです。ご覧いただきありがとうございます!