3.2: 社内基準

1. 適切なサンプル処理: ソリューションを作る

1. きれいなビーカーとそれに大量サンプルの適切な量を取る。実際の使用量を記録します。この例では、アデニンのソリューションは、内部標準として次の解析用メスフラスコで行われます。アデニンの質量は 100 mg です。しないでくださいそれは長い首とアデニンを簡単に追加または削除できませんので直接ではなく、メスフラスコに大量します。
2. 溶媒を約 25 mL を追加 (この場合ジメチルスルホキシド (DMSO)) を溶解する攪拌それビーカーを。この例では、最終的な解決策は 50 mL のメスフラスコに、のみ約 25 mL ビーカーを洗うことができるので、最後のボリュームに成っている解決を追加します。
3. 固体が溶解している、一度容積測定フラスコの溶液を注ぐ。
4. ビーカーと溶媒 10 mL 程度の少量の攪拌棒をすすいで、メスフラスコにリンスを注ぐ。2 回以上を繰り返し。これにより、適切な解決策の転送。

2. 内部標準校正曲線の準備

1. ガスクロマト グラフ分析に必要な標準試料を準備します。この例では、アセトニ トリルを使ってコーヒーからカフェインを抽出し、アデニンは測定用内標準として使用されます。
2. カフェインのサンプル、1 mg/mL のサンプルを作るために必要なサンプル量を重量を量る。10 mL のメスフラスコを使用している場合、それは 10 mg です。
3. ビーカーに試料の重量を量る、数 mL の溶媒に溶解し、メスフラスコ 3 リンスを使用して定量的に転送 (ここでメタノール) を追加します。
4. カフェイン 0.2、0.5、2 mg/mL と同様の方法で 3 以上の基準を作る。
5. サンプル瓶に各カフェインの 1 mL の標準を置きます。
6. 各サンプルのバイアルに 2 mg/mL アデニン内部標準の 0.2 mL を追加します。
7. 各カフェイン標準ガス ・ クロマトグラフィーの実験を実行します。各クロマト グラムの標準カフェイン対のピーク面積の比を計算します。
8. 濃度比面積比対のプロットを作る。そのプロットの傾きは、応答の要因です。

3. ガスクロマトグラフィー用内部標準と実試料の準備

1. 目的のサンプルをガスクロマト グラフ分析に備えます。この例で acetrontrile を使ってコーヒーからカフェインが抽出します。
2. コーヒー サンプル、100 mL ビーカーにコーヒーの 2 g を大量。コーヒーの正確な重量を記録します。
3. アセトニ トリル 20 mL をビーカーに加えます。
4. よくかき混ぜながら 20 分間座っていることができます。
5. 漏斗にろ紙を使用してコーヒーかすをフィルター処理します。
6. リンス フィルター紙のアセトニ トリル (5 mL) の少量の 3 倍。
7. 最終的な濾液量を測定します。それは約 35 mL をする必要があります。

4. サンプルを実行し、濃度の計算

1. コーヒー抽出試料 1 mL をとり、バイアル内の標準の 0.2 mL を追加します。オ-トサンプラ ラックにバイアルを配置します。
2. サンプルの GC 分析を実行します。GC 条件がカフェインとアデニン別のものであることを確認します。この例では、等温版は 200 ° C で実行されます。
3. 分析した後、内部標準的なピークと試料ピークのピーク面積を計算します。その比を使用すると、サンプルに含まれるカフェインの量を計算します。

5. 結果: GC 分析の内部標準とカフェイン

1. カフェインの GC 分析を図 1に示します。アデニンは内部標準として使用されます。ピーク面積の比を計測し、対の濃度の比をプロットします。プロットの傾きは、(この場合は 1.8) で応答の要因です。
2. コーヒー サンプル アデニン内部標準物質とのクロマト グラムを図 2に示します。ピーク面積の比は 1.78 です。応答率とアデニン (0.33 mg/mL) の既知の濃度を使用して、未知の試料中のカフェインの濃度は 0.33 mg/ml に計算されます。

図 1。内部標準物質を用いる校正プロット。カフェインの 3 標準試料の面積比対濃度比のプロット (1、0.5、および 0.2 mg/mL) 0.33 mg/mL アデニン内部規格それぞれに追加します。直線の傾きは 1.8、応答の要因となっています。

図 2。アデニン内部標準とコーヒーのクロマト グラム。サンプルに FID 検出器の応答のプロット。アデニン (IS)、カフェイン、パルミチン酸、3 つの主要なピーク。

サンプルを取り扱い、転送するたびにサンプルの損失が発生する可能性があるため、濃度の正確な計算が困難になります。

精度を確保するには、慎重なサンプル調製を使用し、サンプルの取り扱いと移送のステップ数を制限することにより、サンプル損失の影響を最小限に抑える必要があります。ただし、サンプル損失は、不完全なサンプル操作、マトリックス効果、分析手順のばらつきなどの系統誤差によっても発生する可能性があります。

これらの損失源は、類似しているが同一ではない種の既知の濃度を目的の化合物に追加することで説明できます。これを内部標準と呼びます。内部標準試料に発生するサンプル損失は、分析対象物と同程度でなければならず、これにより濃度を正確に計算できます。

このビデオでは、未知化合物の濃度を決定する際にサンプル損失を説明するための内部標準と適切なラボ技術の使用について説明します。

内部標準物質とは、分析中に標準物質、サンプル、ブランクに既知の量で添加される物質です。

クロマトグラフィーおよび分光法では、内部標準物質と分析種のシグナルの比が計算されます。この比率はレスポンスファクターと呼ばれ、分析対象物と標準濃度の比率に比例します。

レスポンスファクターRは、Aがサンプルと内部標準の分析信号を表し、Cがサンプルと内部標準の濃度を表す次の式で表すことができます。

内部標準は、系統誤差とランダム誤差の両方を補正できます。例えば、サンプル測定時の不整合などのランダム誤差は、内部標準試料と分析種の両方で同じになります。したがって、それらの信号の比率は変わりません。

溶液中のマトリックス効果などの系統誤差については、マトリックス効果が標準試料と分析種の両方で等しい限り、比率は影響を受けません。

内部標準には大きなメリットがありますが、適切なものを選択するのは難しい場合があります。内部標準物質は、分析種と類似しているが、同一ではないシグナルを持っている必要があります。また、分析物の測定に一切影響を与えることはありません。

最後に、濃度をよく知っておく必要があります。これは、内部標準がサンプルにネイティブに存在しないことを確認することで達成されます。したがって、溶液中のその唯一の供給源は、添加された既知の濃度です。

次の実験では、未知のサンプル中のカフェインの濃度をガスクロマトグラフィーによって決定します。

これは、アデニンを内部標準として、既知のカフェイン溶液を使用して検量線を作成することによって達成されます。検量線の傾きは応答係数と等しくなります。

レスポンスファクターが判明すると、測定されたクロマトグラム面積比から未知物質の濃度を計算できます。

内部基準の基本を理解したところで、手順を見ていきましょう。

手順を開始するには、100 mgの内部標準物質であるアデニンを正確に計量して、清潔なビーカーに入れます。

次に、約20mLのジメチルスルホキシドに溶解し、溶液を混合します。

アデニンが溶解したら、溶液を50 mLメスフラスコに注ぎます。

ビーカーと攪拌バーを10mLのDMSOですすぎ、フラスコにすすぎを注ぎます。このすすぎを2回繰り返して、適切な溶液の移送を確保します。キャリブレーションマークまで充填すると、濃度が 2 mg/mL の内部標準が得られます。

次に、ビーカーにカフェイン100mgを量り、原液を調製します。カフェインを少量のメタノールで溶かします。次に、3回のすすぎを使用して、この溶液を新しい25 mLメスフラスコに移します。これが4 mg/mLの原液です。これを使用して、3つのカフェイン基準を作成します。

次に、各フラスコに0.2 mLの内部標準物質であるアデニンを加えます。それぞれを最終容量までメタノールで満たします。各溶液をサンプルバイアルに移します。

各カフェイン標準物質をガスクロマトグラフで分析します。カフェインとアデニン標準のピーク面積の比率を計算します。

まず、100mLのビーカーにコーヒー2gを量り、その重さを記録します。

次に、20mLのメタノールを加えて、コーヒーからカフェインを抽出します。溶液を20分間攪拌します.

B?chner漏斗を使用して、コーヒーかすをろ過します。ビーカーを少量のメタノールですすぎ、このすすぎを漏斗に注ぎます。すすぎを2回繰り返します。

濾液の最終量を測定します。約35mLである必要があります。.

分析用のサンプルを調製するには、1 mLのコーヒー抽出物をサンプルバイアルに加えます。次に、0.2 mLのアデニン内部標準液を添加し、バイアルを装置のオートサンプラーラックに入れます。

サンプルのガスクロマトグラフィー分析を実行し、カフェインとアデニンが分離しているような条件であることを確認します。

分析が完了したら、内部標準と分析種の両方のピーク面積を計算します。

すべてのサンプルを分析したら、カフェイン/アデニン溶液の標準検量線を、ピーク面積と濃度の比の比をプロットすることで決定できます。応答因子を表すこの線の傾きは1.8でした。

次に、抽出したコーヒーサンプルのGCデータを解析します。ピーク面積の比率は 1.78 と計算されました。レスポンスファクターと内部標準物質であるアデニンの既知の濃度を使用して、未知のサンプル中のカフェイン濃度は 0.33 mg/mL と計算されました。

さまざまな科学研究者にわたる多くの異なるタイプの反応は、エラーやサンプル損失の影響を最小限に抑えるために内部標準を利用しています。

サンプル調製中に発生するサンプル損失の影響は、内部標準を使用して最小限に抑え、濃度比をほぼ一定に保つことができます。

この例では、液液抽出プロセスを使用して溶解した細胞から生理活性脂質を抽出しました。安定同位体の内部標準を抽出の開始時に添加し、サンプル調製中のエラーを考慮しました。

内部標準物質は、生理活性脂質の調製だけでなく、分析にも重要でした。脂質を高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、質量分析法で分析しました。

分光法では、内部標準は、光源強度の変化によるランダム誤差の補正に役立ちます。ランプやその他の光源の電力が変動すると、サンプルの吸収、ひいては放出に影響を与えます。ただし、内部標準と分析物の比率は、光源がそうでなくても一定に保たれます。

クロマトグラフィーでは、最大の誤差源の 1 つが注入です。オートサンプラーはこれを最小限に抑えるのに役立ちますが、誤差は依然として1〜2%の相対標準偏差になる可能性があります。

この例では、内部標準物質を含む蒸気標準物質をガスクロマトグラフィーを使用して分析し、検量線を算出しました。これが完了すると、未知のサンプルを測定し、サンプルのボラティリティによる損失を説明することができました。

JoVEの内部標準の紹介をご覧になりました。これで、サンプル損失、内部標準物質、およびレスポンスファクターを最小限に抑えるためのベストプラクティスを理解できました。

ご覧いただきありがとうございます!