Name: エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶマウス骨髄から一次造血細胞を培養し、Gene Pulser MXCell電気穿孔システムを用いて遺伝子導入する方法。マスト細胞や好塩基球への分化と約30%の転染効率を達成し、免疫学研究に応用可能です。

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大腿骨と脛骨から骨髄を採取<ol><li> 12週齢のマウス（我々はBALB / cマウスを使用しているが、任意のマウス系統では、この手順を行うことができます）に - 手順の最初のステップは、6の大腿骨と脛骨から骨髄を採取することです。開始するには、CO 2吸入（表示されません）でマウスを安楽死させる。それぞれの後ろ足から収穫の大腿骨と脛骨。その後、カミソリの刃で、股関節と膝関節を削除するには、大腿骨の両端をカットして骨髄を公開する。 </li><li>同様の方法では、膝と足首の隣接領域を削除すると骨髄を公開するために脛骨のそれぞれの端をカット。 </li><li> 26ゲージの針3 mLシリンジを取り、10％FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびβ-メル​​カプトエタノール（BME = 100 UM）を添加したRPMIで塗りつぶす。ピンセットを使用して、RPMI培地を含むペトリ皿上の骨を保持する。骨の一端に注射針を挿入し、骨髄をフラッシュするためにプランジャーを押し下げる。注射針が残留骨髄を吐き出すのに骨の内部で上下に移動することができます。 </li><li>文化の確立を続行してすべてのボーンのための手順を繰り返し、と。 </li></ol>文化の確立<ol><li>骨髄培養を確立するために、細胞懸濁液中に組織を分割するには、上下に数回フラッシュされた骨髄をピペット。 </li><li> 50 mLコニカルチューブの上に70ミクロンのフィルターを配置し、フィルターに細胞懸濁液を加える。 </li><li> RPMIでペトリ皿を一度洗い流した後、70ミクロンのフィルターにすすぎ追加。 </li><li> 1 mLのシリンジプランジャのゴムのエンドを使用して、70ミクロンのフィルターの上に残っている骨髄の部分を挽く。 </li><li> RPMIでフィルタを1回洗浄する。 </li><li>フィルターを洗浄した後、5分間1200rpmで細胞懸濁液を遠心してください。 </li><li> PBSに再懸濁することにより細胞ペレットを洗浄します。 </li><li>血球計算板を用いて細胞を数える。我々は通常、1つのマウスの骨（二大腿骨と2つの脛骨）から〜90万個の細胞を得る。細胞をカウントした後、5分間1200rpmで再度遠心する。 </li><li> RPMIと注し、その最終的な濃度がmLの当たり1万個の細胞であることを十分にRPMIを含む組織培養フラスコに少量の細胞を再懸濁します。 </li><li>興味のある細胞のタイプの開発を促進するサイトカインを追加。このケースでは、サイトカインのインターロイキン-3（IL - 3 =は10 ng / mL）を好塩​​基球およびマスト細胞の発達を促進するために追加されます。好塩基球を取得するには、10日間インキュベートする。肥満細胞の場合は、5週間インキュベートする。肥満細胞を生成するときに、メディアおよびIL - 3は、週に1回交換する必要があります。 </li><li>ここだけのメッキの後に表示される方法肥満細胞を見ている。この画像は、10日間のインターロイキン- 3を添加した後、好塩基球とマスト細胞にマスト骨髄細胞の分化を示しています。 </li><li>所望の細胞タイプを取得すると、エレクトロポレーションのステップに進みます。 </li></ol> Electroporatingセル<ol><li>エレクトロポレーションのステップを開始するには、培養フラスコ中の細胞の数を決定します。 </li><li>細胞は通常はmLの1千万人もの密度でエレクトロポレーションされているので、必要な細胞数は、コニカルチューブに移して5分間1200rpmでチューブを遠心する。 </li><li>遠心分離した後、1 × PBSで細胞を洗浄し、5分間1200rpmで再び遠心、培地を吸引除去する。 </li><li> PBSを吸引除去し、mL当たり107細胞の細胞懸濁液を作るためにバイオラッドジーンパルサーのエレクトロポレーションバッファーを追加します。 </li><li>細胞を再懸濁させた後、液あたり10〜20マイクログラムの最終濃度で所望のプラスミドDNAを加える。 </li><li> 96ウェルエレクトロプレート上の任意のウェルに細胞懸濁液のアリコートを150マイクロリットル。 </li><li> MXcellプレートチャンバーのエレクトロポレーションプレートを入れ、蓋を閉じます。 </li><li>肥満細胞のトランスフェクションに先立ち、エレクトロポレーションプロトコルは、プリセットまたは保存されているプロトコルを使用していない限り、MXcellにプログラムする必要があります。最適化実験を通して、私たちは、肥満細胞の最も高いトランスフェクション効率は、方形波パルスのプロトコルを使用して発生することを発見した。我々は、2000uFと1000オームで300V/20ms、350/15ms、350V/20ms、および350V/10ms方形波パルスを提供するプレート上にエレクトロポレーション条件を変化させます。プロトコルが設定されており、デバイスにロードされた後、細胞をエレクトロに&quot;パルス&quot;を押してください。 </li><li>エレクトロポレーションが完了したら、組織培養プレートに細胞を移す。我々は通常、mLのインターロイキン- 3当たり10ナノグラム、300マイクロリットルRPMI（10％FCS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびβ-メル​​カプトエタノールを補充した）を含む48ウェル組織培養プレートにウェルにそれぞれ150マイクロリットルのエレクトロポレーションのサンプルを移す。細胞は37℃で一晩インキュベートする° Cは、その後の発現と抑制のために24時間後にアッセイした。 </li></ol>トランsfection結果プラスミドmLのGFPあたり20マイクログラムを使用して成功したエレクトロポレーション後の細胞の蛍光顕微鏡像をビデオに示されています。約30％のMXcellエレクトロ系のトランスフェクション効率を用いて得ることができる。細胞の生存率を維持しながら、システムは、あなたのトランスフェクション効率を最大化するための条件を変化させることができます。

より多くのゲノム情報が出てくるとこのようなsiRNAなどの新しいツールが開発されるように、生理学的に関連する細胞の使用は、病気の経路、タンパク質 - タンパク質相互作用、及びシグナル伝達の理解を促進するためにこれまで以上に重要になっています。初代細胞は、組織又は体液から直接取得し、in vitroで栽培されている。これらの細胞は、外因性遺伝物質の導入などを通じて、さまざまな方法で操作することができます。それは一次細胞にプラスミドDNAやsiRNAを導入する最も効果的な方法は、エレクトロポレーションであることがますます明らかになってきている。 エレクトロポレーションは、一時的にそれによって外因性核酸は、細胞を入力できるように、細胞膜の透過性を向上させるために電気パルスにセルを公開します。トランスフェクションのこのメソッドは、異なる細胞タイプ/ラインと、このように、マスト細胞をトランスフェクトするために使用できるだけでなく、他の骨髄由来細胞の違いに対応するために最適化することができます。さらに、ウイルスの媒介トランスフェクションとは異なり、エレクトロポレーションはトランスフェクトしたDNAのサイズに制限があります、また大規模な準備を必要としません。脂質媒介トランスフェクションとは対照的に、エレクトロポレーションは、毒性の低いことができ、トランスフェクトされた核酸のエンドソーム捕捉されることはありません。 バイオラッドは、これらの細胞のために特別にMXcellのエレクトロポレーションシステムを開発しました。 MXcellは、あなたのトランスフェクション効率と細胞生存率を最大化するための条件を変化させることができます。トランスフェクション効率を最適化し、細胞死を最小限にするためには、電圧、キャパシタンス、抵抗、およびパルス長を含むエレクトロポレーションパラメータの多数を調整し、評価することができます。

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser MXcell エレクトロポレーションシステム</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser エレクトロポレーションバッファー</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

それは、エレクトロポレーションは、プライマリ細胞にプラスミドDNAやsiRNAを導入するための最も効果的な方法であることがますます明らかになってきている。ジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムとジーンパルサーのエレクトロポレーションバッファー特に哺乳動物細胞や、プライマリおよび幹cells.Thisビデオなどの困難なトランスフェクション細胞に核酸をトランスフェクトするために開発されたマウス骨髄からプライマリ造血細胞培養を確立する方法を示していますし、MXcellシステムにおけるエレクトロポレーションのためにそれらを準備する。我々は、大腿骨と脛骨を分離することから始めます。大腿骨と脛骨の両方から骨髄を回収され、文化が確立されています。培養骨髄細胞は、トランスフェクションと分析される。

この手順では、マウス骨髄からプライマリ造血細胞培養を確立し、ジーンパルサーMXCellのエレクトロポレーションシステムを用いてトランスフェクションが続いている方法について説明します。

初代細胞にプラスミドDNAまたはsiRNAを導入する方法として、エレクトロポレーションが最も効果的であることがますます明らかになっています。Gene Pulser...

本手順は、マウスの大腿骨および脛骨の採取から始まります。股関節、膝関節、および足関節を除去した後、骨の開口部からRPMI培地を注入して骨髄を分離します。単一細胞懸濁液を得た後、骨髄細胞をマスト細胞へと分化させ、96ウェル電極法プレートにロードし、その後、トランスフェクションを行います。Gene PulseまたはMX Cell電極導入システムを使用します。矩形波パルスプロトコルを用いることで、約30%の導入効率が得られます。本手順の最初のステップは、6〜12週齢のマウスの大腿骨および脛骨から骨髄を採取することです。まず、CO2吸入によりマウスを安楽死させ、各マウスの後肢から大腿骨と脛骨を採取します。次に、カミソリを用いて大腿骨の両端を切り、股関節と膝関節を除去して同様に骨髄を露出させます。同様に、脛骨の両端を切り、膝関節と足首に隣接する領域を除去して骨髄を露出させます。次に、26.5ゲージの針を装着したシリンジを用意し、10% FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、β-メルカプトエタノール、およびL-グルタミンの添加RPMIを充填します。ピンセットを用いて、RPMI培地を入れたペトリ皿の上で骨を保持します。シリンジの針を骨の一端に挿入し、プランジャーを押し下げて骨髄を洗い流します。シリンジの針を骨の内部で上下に動かし、残存する骨髄を洗い出します。すべての骨に対してこの手順を繰り返し、その後、骨髄培養の調製に進みます。骨髄培養を調製するため、洗い出した骨髄をピペッティングして数回上下に混ぜ、組織を細胞懸濁液に分解します。次に、50 mLコニカルチューブの上に70 µmフィルターを設置し、細胞懸濁液をフィルターに加えます。続いて、シャーレをRPMIで1回洗浄します。その後、その洗浄液を70 µmフィルターに加え、1 mLシリンジプランジャーのゴム端を用いて、70 µmフィルターの上に残っている骨髄片を押し潰します。フィルターを洗浄した後、RPMIで1回洗浄します。細胞懸濁液を1200 RPMで5分間遠心分離します。PBSで再懸濁し、細胞ペレットを洗浄します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。通常、マウス1匹の骨（大腿骨2本および脛骨2本）から約90 million cellsが得られます。細胞数を計測後、再び1200 RPMで5分間遠心分離します。少量のRPMIで細胞を再懸濁し、最終濃度が100万 cells/mLになるように十分な量のRPMIを含む組織培養フラスコに分注します。次に、目的の細胞型の分化を促進するためにサイトカインを添加します。本手順では、好塩基性球およびマスト細胞の分化を促進するためにサイトカインのinterleukin threeを添加します。好塩基性球を得る場合は10日間、マスト細胞を生成する場合は5週間インキュベートしてください。培地およびIL-3は週に一度交換してください。ここでは、播種直後の骨髄細胞の外観を示します。この画像は、インターロイキン-3の添加から10日後に、骨髄細胞が好塩基球およびマスト細胞へと分化した様子を示しています。目的の細胞種が得られたら、エレクトロポレーションのステップに進みます。エレクトロポレーションを開始する前に、培養細胞数を決定してください。フラスコで培養した細胞は、通常1 mLあたり10 million個の密度でエレクトロポレーションを行います。必要数の細胞をコニカルチューブに移し、1200 RPMで5分間遠心分離します。遠心後、培地を吸引し、1回分のXPBSで細胞を洗浄し、再度1200 RPMで5分間遠心分離します。その後、PBSを吸引し、BioRad gene pulsar electroporation bufferを加え、細胞濃度が1 mLあたり10 million cellsの細胞懸濁液を作成します。細胞を再懸濁した後、最終濃度が10〜20 µg/mLとなるように目的のプラスミドDNAを添加します。細胞溶液を穏やかに混ぜ、96ウェル電極導入プレートの任意のウェルに細胞懸濁液を150 µLずつ分注します。次に、骨髄細胞のトランスフェクションおよびエレクトロポレーションを行う前に、電極導入プレートをMXLプレートチャンバーに設置し、蓋を閉じます。MXLにプロトコルをプログラムする必要があります。ただし、最適化実験を通じてあらかじめ設定または保存されたプロトコルを使用する場合を除きます。骨髄細胞の transfection 効率が最も高くなるのは、矩形波パルスプロトコルを使用した場合であることが判明しています。プレート上のエレクトロポレーション条件を変更し、1000 ohms で 2000 micro phs の矩形波パルスを印加します。プロトコルの設定およびデバイスへのロードが完了したら、pulse を押して細胞にパルスを印加します。エレクトロポレーション完了後、細胞を組織培養プレートに移します。通常、150 µLずつのエレクトロポレーションサンプルを、10 ng/mLのインターロイキン3を含む300 µLのRPMIが入った48ウェル組織培養プレートの各ウェルに転移させます。細胞を37 °Cで一晩インキュベートし、24時間後に発現および抑制をアッセイします。これは細胞の蛍光顕微鏡画像です。MX cell電極導入システムを用い、20 µg/mLのGFPプラスミドでエレクトロポレーションを成功させると、約30%の導入効率が得られます。このシステムでは、細胞生存率を維持しながら導入効率を最大化するために、条件を変更することが可能です。MX cellシステムは、本研究で使用したマウス造血細胞のような一次哺乳類細胞に特に有用です。マウスからの骨髄細胞の分離、およびMXセルエレクトロポレーションシステムを用いた分化マスト細胞へのトランスフェクション方法について解説しました。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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