Name: 鶏胚における神経誘導のためのアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学ぶ鶏胚における神経誘導アッセイの手法。ヘンセン結節の移植と蛍光標識、in situハイブリダイゼーションを用いて神経運命決定のメカニズムを解明する。発生神経科学の研究に応用可能です。

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DPは、薬物乱用の国民の協会からルースキルシュシュタイン賞1F32 DA021977 - 01A1の受信者です。この作品は、RHFへマーガレットM. Alkek財団によってサポートされていました。

<html> I.の概要図： <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_2/Figure1.png" alt="図1" width="460" height="384" />このビデオでは、ニワトリ胚における神経誘導するためのアッセイの各ステップを示しています。まず、ホスト胚は、新しい文化の中で外植された[NI1]。その後、donnorの胚は、生理食塩水で外植されており、ヘンゼンのノード（ひよこの&quot;主催者&quot;）は蛍光色素DII [NI2]のラベルが付いています。ヘンゼンのノードがdonnorの胚から摘出された[NI3]とホスト胚に移植[NI4、NI5]。ホスト胚はその後donnor組織がホストの領域で異所性の軸を誘導ている期間の後に最大22時間、のために培養されopaca [NI6]。以下の文化、ホスト胚は、DABの存在下で光酸化のために固定され、処理されます：この化学反応により、光酸化する前にFITC蛍光の下に赤く写るdonnor由来の細胞は、[NI7]、DAB [NI8]と茶色の次の反応になる。胚はその後神経マーカー[NI8]とin situハイブリダイゼーションのために処理されます。宿主由来の組織はdonnorの移植片の存在下で神経組織を形成しています。この組織は、青色表示されます。 1：新しい文化のために、ホスト胚の準備<ol><li>この神経誘導アッセイのプロトコルは、ハンバーガー＆ハミルトンステージ3にインキュベートされた卵から始まります+（またはHH3 +）。これらの卵は、13時間湿ったインキュベーターで彼らの側に敷設インキュベートされています。 </li><li>新文化（ステップ3.1 5.5〜9）のホスト胚を準備します。 </li><li> 200μlの生理食塩水でホスト胚の表面を覆う。これは後で転送するとdonnorの移植片の位置決めを容易にするでしょう。 </li><li>最後に、反転ファルコン35mmの培養皿を使用してアセンブリをカバー。 </li></ol> 2：生理食塩水でdonnorの胚をExplanting <ol><li>ピンセットで殻をタップすると、すべてのシェルの周りに、シェルの部分を削除して、卵を開きます。シェルの上部を取り外して廃棄。 </li><li>鉗子と厚いアルブミンを削除して、胚が上向きに向くように粗い鉗子で卵黄嚢を傾けます。 </li><li>細かいハサミを使用して、胚の周りに卵黄嚢の正方形をカット。スプーンで卵黄から胚を取り出し、そしてPBSを含む皿の場所。 </li><li>鉗子を使用して、明域からdonnorの胚を切り離します。 </li><li> PBSを含むSylgard覆われた皿にdonnorの胚を移す。 </li></ol> 3：、ラベリング切除とdonnorグラフトを移植<ol><li>微小電極プラーを使用して、50μlのガラスマイクロキャピラリーピペットを引き出します。顕微鏡下で、微細な鉗子を用いてマイクロピペットの先端をカット。 plastelineのリボンが並んでペトリ皿の場所のマイクロピペット。 </li><li>移植前の移植片にラベルを付けるために使用される染料溶液を調製します：まず、1mlのDIIの株式を準備：色素DII（1,1&#39; - ジオクタデシル- 3、3,3&#39;、3&#39; - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩）をカルボシアニン0.5％無水エタノール。この株は、暗所で- 20Cで保存することができます。 42℃に設定したウォーターバス中で、ミックスは360μl0.3Mショ糖に40μlのDIIの株式を温した。水浴の温度は、DIIと不溶性結晶の形成の析出を防止するために必要です。簡単に言えばミニspectrafuge（5〜10秒間）上でソリューションをスピン。 DIIのソリューションが使用できるようになりました。 </li><li>昆虫ピンを使用して、Sylgard覆われた皿の底にdonnorの胚を固定します。 </li><li> DIIでマイクロピペットを埋戻し。吸引管のアセンブリを使用して穏やかな圧力を適用することによって、ヘンゼンのノードにDIIの小さな塊を適用する。全体ヘンゼンのノードがラベル付けされていることを確認します。 </li><li>マイクロキャピラリーピペットまたはmicrodissectingナイフを使用して、ヘンゼンのノード（&quot;主催者&quot;、donnorの移植）をカット。 </li><li>カルミンと移植片の腹側と後端をマーク。これは、移植片は、ステップ4.3での適切な背腹方向に配置されることを保証します。 </li><li> 200μlのギルソンのピペットを使用して、ホスト胚に移植片を移す。 </li></ol> 4：移植片と宿主の培養の胚の保護<ol><li>移植片は、ホストサイトに近接して配置さ残っていることを確認し、ホスト胚から生理食塩水を削除します。 </li><li>マイクロキャピラリーピペットまたはmicrodissectingナイフを使用して、ホスト胚のヘンゼンのノードのレベルでは、明域/暗域の境界領域に小さな切開（80 -100μmの）を作る。 </li><li>その腹側があなたと後端に向かって直面しているので、マイクロキャピラリーピペットまたはmicrodissectingナイフを使用して、移植片を配置し、ホスト胚に相当する地域に平行である。 </li><li>残りの生理食塩水を削除し、81〜22時間（ステップ6.1から6.6 9）のために新しい文化のためにホストの胚を処理する。 </li><li>ホストの胚は、その後4℃（ステップ7.1から7.7 9）で一晩固定されています。 </li></ol>E&quot;&gt; 5：蛍光下で移植片をPhotooxidise <ol><li>ヒュームフードの下で、トリス緩衝液にDABワーキング溶液を調製：500μg/mlでトリス緩衝液（100mMのトリス- HCl、pH7.4）中でDAB基質（3,3&#39; - ジアミノベンジジン四塩酸塩）を溶かし、氷の上に、暗闇の中で解決策を保つ。 </li><li>トリス緩衝液でそれぞれ一回5分で5分のためにPBSで2回胚を洗浄してください。 </li><li> 1ミリリットルTris緩衝液を含むガラスの空洞のスライドに胚を移す。 </li><li> 1.5ミリリットルDAB溶液とトリス緩衝液を交換してください。 DABを除染するために10％漂白剤溶液の入ったバケツにエッペンドルフ先端処分する。空洞のスライドの上にカバースリップを置き。 </li><li> FITC（フルオレセインイソチオシアネート）蛍光下で、移植片（donnor細胞は蛍光赤を表示されています）上で顕微鏡の目的を集中し、すべての蛍光赤色細胞が茶色（これは、DIIの結果として起こるとなっているまで、FITCの蛍光に公開photoconvertedている蛍光色素DABの存在下でFITC励起波長（488nmの）への暴露によって、不溶性の褐色結晶する。このプロセスは、約20分、2時間かかります。 </li><li>光酸化反応の完了後、微細な鉗子を使用してカバーを取り外します。ガラスPBTwを（または0.1％のTween - 20を含むPBS）を含む20mlのシンチレーションバイアルをするために胚を移す。 </li><li> 10％漂白剤溶液中でインキュベートすることによってカバースリップとガラスの空洞のスライドからDABを非アクティブにします。 </li></ol> 6：in situハイブリダイゼーション、写真撮影のために胚を処理し、セクショニング<ol><li>唯一の標識プローブを掘るための胚をインキュベートし、in situハイブリダイゼーション（ステップ3.7から6.5 9）に進みます。 </li><li>撮影（ステップ8.2 9）と（ステップ8.3および8.4 9）切片を続行します。 </li></ol>代表的な結果神経誘導アッセイの次の例では、donnorの移植片は組織を派生ホストからの尾の神経マーカーの発現を誘導示されている。この特定の例では、我々は通常、&quot;主催者&quot;の能力を持っていない胚の領域の神経誘導能の獲得を評価した：donnorの移植片は、&quot;主催者&quot;領域は外科的段階でdonnorの胚から除去された胚に由来する3 +。アブレーションに続いて、donnorの胚は、穴が治癒したとヘンゼンのノードに似た構造が形成されるまで、新しい文化の発展に許可されています。この構造はその後、DIIで標識donnorの胚から切り出し、ホスト胚の明域/暗域の境界にグラフトされています。新しい文化に続いて、ミニチュアの軸は、ホスト胚に隣接して形成される：このミニチュア軸は赤血球のロッド（donnorが由来）とヘッドのような構造（ホスト派生）で構成されています：（A）において、donnor由来DIIのラベル細胞は、FITC蛍光顕微鏡下に固定前に示されています。これらdonnor由来細胞は、赤血球の棒として表示されるミニチュア脊索を形成し、増殖している。 （B）DIIの次の光変換は、これらのdonnor由来細胞は茶色に表示されます。 donnorの移植片は、ホストからの神経組織の形成を誘発している：この組織は、脳のための前駆体で構成され、のようなin situハイブリダイゼーションマーカー尾のない以下のため、その発現によって明らかにされた[6から転載]。 <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_3/Figure 2.png" alt="図2" width="230" height="154" />注：この手順では、我々は&quot;神経&quot;組織（青）由来のホストからの神経誘導donnor組織（赤/茶色）を区別するために、DII標識細胞を使用している。代わりに派生ひよこを使用する代わり、DIIはdonnorグラフトのラベルが、何人かの著者はまた、代わりにニワトリからウズラ胚に由来するdonnor組織[例6]を使用してください。この代替方法はまた、宿主組織からdonnorを区別することができます。このケースでは、移植片（donnorの組織）が代わりにニワトリの卵のウズラの卵に由来する。ステップ4.5に続いて、ホストが5.7に3.4および5.1に組織（QCP1）と手順3.1をウズラに特異抗体と全体のマウント免疫組織化学のために処理されているプロトコルから省略されます。 B、​​このケースでは、我々は同じ実験手順を使用し、しかし、我々はウズラ由来donnor組織を（QCPN抗体[茶色]の式で示される）を使用：この代替手順の例を以下に示す再生ウズラ胚から派生したノードは、ホストの汎神経マーカーSox2の発現を誘導している[6から再版さ]： <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_4/Figure 3.png" alt="図3" width="154" height="230" />

<ol><li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+development+of+chick+and+duck+embryos%2C+cultivated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro.</a> Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).</li>
<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+by+the+primitive+streak+and+its+derivatives+in+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.</a> J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+et+transplantation+des+diff%26eacute%3Brentes+r%26eacute%3Bgions+de+la+ligne+primitive+chez+le+poulet%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Ass.+Anat%22%5BJournal%5D)">Excision et transplantation des diff&eacute;rentes r&eacute;gions de la ligne primitive chez le poulet.</a> C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+induction+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Morph.+9%22%5BJournal%5D)">Primary induction in birds.</a> Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+neural+crest+cell+migration+in+the+mouse+embryo+as+revealed+by+vital+dye+labeling.+Development+108%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108.</a> , 605-612 (1990).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.+Development+122%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122.</a> , 3263-3273 (1996).</li>
<li>Joubin, K., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+continuously+define+the+organizer+during+the+cell+movements+of+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation.</a> Cell. 98, 559-571 (1999).</li>
<li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. , 406-474 (2000).</li>
<li>Psychoyos, D., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Culture+of+Early+Chick+Embryos+ex+vivo+%28New+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture.</a> JoVE. 20, 10-3791 (2008).</li>
</ol>

このビデオでは、神経誘導のためのアッセイを行うことで、異なる手順を示し、このアッセイは、本質的にニワトリの推定神経誘導の分子の特性評価に使用されるため、発生学的micromanipulationsから1-4まで、幅広いアプリケーションのさまざまな、使用することができます。すべての脳と、残りの神経系の形成における初期段階の理解を目指す解明〜6の新しいシグナル伝達カスケード7,8、。

<table><tbody><tr><td>卵</td><td>動物</td><td>Charles River Laboratories</td><td>プレミアム・ファータイル</td><td>受精後、HH3+（14時間）</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5または同等のもの</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションインキュベーター</td><td>装置・器具</td><td>Robbins Scientific, SciGene</td><td>M1000</td><td>倒立させたPyrexディッシュおよび500 mlのddH2Oと共に使用する&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ビーカー</td></tr><tr><td>Marsh自動インキュベーター</td><td>装置・器具</td><td>リヨン</td><td>処方（RX）</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex製ディッシュ </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>時計職人&amp;rsquo;50mmガラススライド</td><td>ツール</td><td>VWR international</td><td>66112-060</td><td></td></tr><tr><td>ガラスリング</td><td>ツール</td><td>施設管理部門</td><td></td><td>ガラス管（外径27 mm、内径25 mm）を厚さ4 mmのセクションに切断する。精密切断後の研磨は行わない。</td></tr><tr><td>弯曲鉗子 (1)</td><td>ツール</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット (2)</td><td>ツール</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td>砥石を用いて鈍端化し、100μlのミネラルオイルを使用する。</td></tr><tr><td>精密鋏</td><td>ツール</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製ディッシュ</td><td>ツール</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>ゴムバルブ</td><td>ツール</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>アスピレーターチューブアセンブリ</td><td>ツール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ&amp;#8211;電極引き抜き機</td><td>器具・装置</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Sutter Instruments P-97 火炎・ブラウンマイクロピペット</td><td></td></tr><tr><td>パストゥールキャピラリーピペット</td><td>ツール</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70950-12</td><td>炎で縁を丸める</td></tr><tr><td>培養チャンバー</td><td>ツール</td><td>パイオニア・プラスチックス</td><td>030C</td><td></td></tr><tr><td>マイクロキャピラリーチューブ</td><td>ツール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1049-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>マイクロディセクティングナイフ</td><td>ツール</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>in situ ハイブリダイゼーションの前に、空洞を穿刺するために使用する</td></tr><tr><td>微小ピン（直径0.2mm）</td><td>ツール</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>硬化剤1部とベース9部を混合し、37℃で一晩静置する。</td></tr><tr><td>ジエチルピロカルボネート (depc)</td><td>試薬</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコンエラストマー硬化剤およびベース</td><td></td><td>ダウコーニング</td><td>0001986475</td><td>硬化剤1部とベース9部を混合し、37℃で一晩静置する。</td></tr><tr><td>ジエチルピロカルボネート (depc)</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>10025025</td><td>1LのPBSに1mlのDEPCを加え、振盪した後、オートクレーブで滅菌する。</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td></td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr></tbody></table>

鶏胚における神経誘導のためのアッセイ

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

ニワトリ胚は、初期胚発生の研究に貴重なツールです。その透明性、アクセス性と操作の容易さは、その神経系の形成と初期のパターン形成を研究するための理想的なツールとなっています。このビデオでは、ホストへの移植主催者の組織する、方法これでヘンゼンのノード（ニワトリ胚におけるオーガナイザー）がホスト有能な外胚葉にグラフトされる方法を示しています。主催者の移植は、神経誘導シグナルを介した神経運命を採用する組織をve Naの上に横たわって指示する。このメカニズムは、神経誘導と呼ばれ、羊膜の脳と脊髄の形成の初期段階を構成しています。このメソッドは本質的にニワトリの推定神経誘導の分子の特性評価に使用されます。このビデオでは、神経誘導のためのアッセイの各ステップを示し、まず、donnorの胚を外植し、皿に固定されます。その後、ホストの胚は、新しい文化のために準備されています。移植片を切除し、ホストの明域のマージンに移植される。ホストは、18〜22時間培養されています。アセンブリを固定し、さらにアプリケーション（例えば、in situハイブリダイゼーション）用に処理されます。このメソッドはもともとワディントンによって考案された<sup&gt; 1,2</sup&gt;とGallera<sup&gt; 3,4</sup&gt;。

神経誘導、脳の形成の最初のステップです。それはヘンゼンのノード（主催者）は、神経の運命を採用する隣接する組織に指示するメカニズムである、神経系を生じさせるために、すなわち。このビデオでは、ニワトリ胚における神経誘導のためのアッセイを示しています。

ニワトリ胚は、初期胚発生の研究において非常に有用なツールです。その透明性、アクセスしやすさ、および操作の容易さにより、それは...

このビデオでは、ニワトリ胚における神経誘導アッセイのさまざまな手順を実演します。まず、ホスト胚を新しい培養液に摘出します。次に、ドナー胚を生理食塩水中に摘出し、ヘンソン結節を蛍光色素で標識します。ドナー胚からヘンソン結節を切除し、ホスト胚に移植します。ホスト胚を24時間培養し、固定した後、蛍光下での光酸化処理を行います。DABを用いて、神経マーカーによるin-situハイブリダイゼーション処理を胚に施します。こんにちは。テキサスA&amp;M大学ヒューストン校、環境・ゲノム医学センターのFennell研究室のDelphineです。本日は、ヒヨコ胚を用いて神経誘導アッセイを行う手順をご紹介します。当研究室ではこの手法を用いて、抗てんかん薬がヘンゼン結節の神経誘導能に及ぼす影響を研究しています。それでは始めていきましょう。神経誘導アッセイのために、卵を準備する必要があります。これらの卵を、加湿インキュベーター内で横向きに寝かせた状態で13時間培養し、ハンバーガー・アンド・ハミルトンステージ3プラス（HH 3+）まで成長させます。次に、既報の新しい培養法を用いて、ホスト胚を準備します。JoVEでは、ホスト胚の表面を200 µLの生理食塩水で覆います。これにより、後のドナー移植片の移送と配置が容易になります。最後に、アセンブリを逆さまにしたFalcon 35ミリメートル培養ディッシュで覆います。ドナー胚を取り出すため、ピンセットで殻を叩いて卵を開けます。殻の上部を取り除き、廃棄します。ピンセットで厚い白質を取り除き、粗いピンセットで卵黄嚢を傾けて、胚が上を向くようにします。白質を除去した後、微細剪刀を用いて、胚の周囲の卵黄嚢を正方形に切り出します。スプーンで卵黄から胚を取り出し、PBSを含むディッシュに入れます。次に、ピンセットを使用して、ドナー胚を卵黄およびarea lucidaから切り離します。切り離した後、ドナー胚をラベル付けおよび移植用グラフトの作製のため、PBSが入ったSILガードカバー皿に移します。顕微鏡下でマイクロ電極プラーを用いて、50 µLのガラスマイクロキャピラリーピペットを作製します。微細ピンセットを使用してマイクロピペットの先端を切断します。モデリングクレイの帯を敷いたペトリ皿にマイクロピペットを配置します。次に、移植前にグラフトを標識するために使用する染料溶液を調製します。まず、0.5%の絶対エタノール1 mLを用いてダイストックを調製します。このストックは、遮光して-20°Cで保存可能です。次に、45°Cに設定したヒートブロック内で、あらかじめ加温した10 µLのダイストックを90 µLの0.3 M sucroseに混合します。この温度設定は、ダイの沈殿および不溶性結晶の形成を防ぐために必要です。ミニ遠心機で溶液を5〜10秒間、軽くスピンダウンさせます。これでDAI溶液の使用準備が整いました。虫ピンを使用して、ドナー胚の背面が上になるようにシルガードカバーディッシュの底に固定します。胚を固定したら、穏やかな圧力をかけてマイクロピペットにD eyeをバックフィルします。アスピレーターチューブアセンブリを使用します。ダイをヘンソン結節に少量塗布します。これを繰り返し、ヘンソン結節全体にラベル付けがなされていることを確認してください。マイクロキャピラリーピペットまたはマイクロ解剖ナイフを用いてヘンソン結節を切り出します。結節の背面は溝を形成しているため、平坦な腹面と区別できます。必要に応じて、移植片の背面にカーミン粉末で印を付けてください。これにより、移植片を正しい背腹方向に配置することができます。10 µLのGilsonピペットを使用して、マイクロキャピラリーピペットで移植片をホスト胚に転送します。移植片を、ホスト胚のヘンソン結節のレベルにある不透明な境界領域であるlucita areaに近づけます。次に、マイクロキャピラリーピペットまたはマイクロ解剖ナイフを使用して、その領域に80から100 µmの小さな切開を入れます。ホスト胚のヘンソン結節レベルにある不透明な境界までルシタ領域を露出させます。マイクロキャピラリーピペットまたはマイクロ解剖ナイフを使用してください。移植片の腹側を自分に向け、後端がホスト胚Oの相当する領域と平行になるように配置します。配置後、移植片がホスト部位に近接したままの状態であることを確認しながら、ホスト胚から生理食塩水を吸引し、前回の報告に従って18から22時間、新しい培養のためにホスト胚を処理します。24時間の培養後、胚をインキュベーターから取り出し、シガーディッシュの中で固定します。PBSを除去し、4%パラホルムアルデヒドに置換します。その後、胚を24時間固定します。固定液を適切な有害廃棄物容器に廃棄し、固定用ディッシュにPBSを加えます。ピンが抜けた後、ピンセットで昆虫ピンを取り除きます。鈍端のパステールピペットを使用して、胚をPBSの入ったシンチレーションバイアルに移します。胚をPBSで5分間ずつ2回洗浄し、その後twist bufferで5分間1回洗浄します。洗浄後、胚を0.1 mLのTris bufferが入ったガラスキャビティスライドに移します。Tris buffer溶液を0.1 mLのDAB溶液に置換します。使用したチップは漂白剤溶液の入ったバケツに廃棄してください。DABを脱色するため、FEIフルオレセインイソチオシアネート蛍光フォーカス下のキャビティスライドの上にカバーガラスを配置します。移植ドナー細胞上の顕微鏡対物レンズが蛍光赤色に現れます。すべての蛍光赤色細胞が茶色になるまでFEI蛍光に曝露させます。これは、蛍光色素がFEI励起波長に曝露されることで、不溶性の茶色結晶へと光変換される結果として起こります。DABの存在下で488 nmの光を照射します。この工程には20分から2時間かかります。光酸化反応の完了後、微小ピンセットを用いてカバーガラスを取り出します。胚を、PBTWまたは0.1% tween 20を含むPBSを入れた20 mLのシンチレーションバイアルに転送します。最後に、カバーガラス、スライドガラス、およびガラスキャビティからDABを除去します。胚を可視化するために、漂白剤溶液でインキュベートして処理します。in-situ ハイブリダイゼーションを行い、胚をDIGラベルプローブのみでインキュベートします。次に、Jo Video 2に記載されている手順に従って、写真撮影と切片作成を開始します。ここでは、神経誘導アッセイの例を示します。最初、移植片を宿主胚の area lucita と area alpaca の境界に配置します。ドナー胚と宿主胚はいずれもステージ3+です。培養から9時間後、移植片が分化し始め、ステージ8-の頭部に見える構造を誘導し始めます。培養から24時間後、固定により神経誘導が完了します。胚を光酸化処理に供します。まず、ドナー由来の色素で標識された細胞が、ここで赤色に示されているように、増殖して小型の神経管（neural tube）を形成していることがわかります。光酸化後、これらの細胞は褐色に見えます。その後、胚を神経マーカーOtx2に対してホールマウントin situハイブリダイゼーションで処理します。これはBonelli博士の研究室で開発されました。ドナー移植片が宿主由来組織においてOTX2の発現を誘導することが示されています。以上で、Chick胚を用いた神経誘導アッセイの実施方法について説明しました。この手順を行う際は、移植後にピペットを用いて移植片周囲のすべての液体を除去することが重要である点に注意してください。これにより、移植片が確実に固定され、培養中にホスト胚から離脱することがなくなります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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JoVE Journal

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生物学

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発達神経生物学の根本的な問題はどのように神経細胞のネットワークが胚の脳の中で確立されています。ここでは、そのようなのCre /...

ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

ここでは、血管内DiI注射と組み合わせたひよこGFP 神経管の種内移植を用いた神経堤細胞および血管の二重標識を報告する。この実験技術により、臓器形成中にNCC由来の(腸管)神経系と血管系の発達を同時に可視化し、研究することができます。...

鶏の胚内の神経堤細胞と血管の二重標識は、ひよこGFP 神経管移植とカルボシアニンDyI注射を用いた

この汎用性の高いプロトコルは、ニワトリ胚からの脳神経襞の切除による遊走性神経堤細胞(NCC)の単離について説明しています。プレーティングとインキュベーションを行うと、遊走性NCCが神経襞の外植片から出現し、単純化された2D環境での細胞形態と遊走の評価を可能にします。...

ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の作製と形態解析

このプロトコルは、ニワトリ胚の神経形成中の神経板組織の機械的特性を縦断的に監視するために開発されました。これは、ブリルアン顕微鏡とステージ上のインキュベーションシステムの統合に基づいており、 卵子...

ニワトリ胚の神経管閉鎖中の組織の機械的進化のモニタリング

学ぶ鶏胚における神経誘導アッセイの手法。ヘンセン結節の移植と蛍光標識、in situハイブリダイゼーションを用いて神経運命決定のメカニズムを解明する。発生神経科学の研究に応用可能です。

鶏胚における神経誘導のためのアッセイ

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