鶏胚における神経誘導のためのアッセイ

このビデオでは、ニワトリ胚における神経誘導アッセイのさまざまな手順を実演します。まず、ホスト胚を新しい培養液に摘出します。次に、ドナー胚を生理食塩水中に摘出し、ヘンソン結節を蛍光色素で標識します。ドナー胚からヘンソン結節を切除し、ホスト胚に移植します。

ホスト胚を24時間培養し、固定した後、蛍光下での光酸化処理を行います。DABを用いて、神経マーカーによるin-situハイブリダイゼーション処理を胚に施します。

こんにちは。テキサスA&M大学ヒューストン校、環境・ゲノム医学センターのFennell研究室のDelphineです。本日は、ヒヨコ胚を用いて神経誘導アッセイを行う手順をご紹介します。当研究室ではこの手法を用いて、抗てんかん薬がヘンゼン結節の神経誘導能に及ぼす影響を研究しています。

それでは始めていきましょう。神経誘導アッセイのために、卵を準備する必要があります。これらの卵を、加湿インキュベーター内で横向きに寝かせた状態で13時間培養し、ハンバーガー・アンド・ハミルトンステージ3プラス（HH 3+）まで成長させます。

次に、既報の新しい培養法を用いて、ホスト胚を準備します。JoVEでは、ホスト胚の表面を200 µLの生理食塩水で覆います。これにより、後のドナー移植片の移送と配置が容易になります。

最後に、アセンブリを逆さまにしたFalcon 35ミリメートル培養ディッシュで覆います。ドナー胚を取り出すため、ピンセットで殻を叩いて卵を開けます。殻の上部を取り除き、廃棄します。

ピンセットで厚い白質を取り除き、粗いピンセットで卵黄嚢を傾けて、胚が上を向くようにします。白質を除去した後、微細剪刀を用いて、胚の周囲の卵黄嚢を正方形に切り出します。スプーンで卵黄から胚を取り出し、PBSを含むディッシュに入れます。

次に、ピンセットを使用して、ドナー胚を卵黄およびarea lucidaから切り離します。切り離した後、ドナー胚をラベル付けおよび移植用グラフトの作製のため、PBSが入ったSILガードカバー皿に移します。顕微鏡下でマイクロ電極プラーを用いて、50 µLのガラスマイクロキャピラリーピペットを作製します。

微細ピンセットを使用してマイクロピペットの先端を切断します。モデリングクレイの帯を敷いたペトリ皿にマイクロピペットを配置します。次に、移植前にグラフトを標識するために使用する染料溶液を調製します。

まず、0.5%の絶対エタノール1 mLを用いてダイストックを調製します。このストックは、遮光して-20°Cで保存可能です。次に、45°Cに設定したヒートブロック内で、あらかじめ加温した10 µLのダイストックを90 µLの0.3 M sucroseに混合します。この温度設定は、ダイの沈殿および不溶性結晶の形成を防ぐために必要です。

ミニ遠心機で溶液を5〜10秒間、軽くスピンダウンさせます。これでDAI溶液の使用準備が整いました。虫ピンを使用して、ドナー胚の背面が上になるようにシルガードカバーディッシュの底に固定します。胚を固定したら、穏やかな圧力をかけてマイクロピペットにD eyeをバックフィルします。

アスピレーターチューブアセンブリを使用します。ダイをヘンソン結節に少量塗布します。これを繰り返し、ヘンソン結節全体にラベル付けがなされていることを確認してください。

マイクロキャピラリーピペットまたはマイクロ解剖ナイフを用いてヘンソン結節を切り出します。結節の背面は溝を形成しているため、平坦な腹面と区別できます。必要に応じて、移植片の背面にカーミン粉末で印を付けてください。これにより、移植片を正しい背腹方向に配置することができます。

10 µLのGilsonピペットを使用して、マイクロキャピラリーピペットで移植片をホスト胚に転送します。移植片を、ホスト胚のヘンソン結節のレベルにある不透明な境界領域であるlucita areaに近づけます。次に、マイクロキャピラリーピペットまたはマイクロ解剖ナイフを使用して、その領域に80から100 µmの小さな切開を入れます。

ホスト胚のヘンソン結節レベルにある不透明な境界までルシタ領域を露出させます。マイクロキャピラリーピペットまたはマイクロ解剖ナイフを使用してください。移植片の腹側を自分に向け、後端がホスト胚Oの相当する領域と平行になるように配置します。配置後、移植片がホスト部位に近接したままの状態であることを確認しながら、ホスト胚から生理食塩水を吸引し、前回の報告に従って18から22時間、新しい培養のためにホスト胚を処理します。

24時間の培養後、胚をインキュベーターから取り出し、シガーディッシュの中で固定します。PBSを除去し、4%パラホルムアルデヒドに置換します。その後、胚を24時間固定します。

固定液を適切な有害廃棄物容器に廃棄し、固定用ディッシュにPBSを加えます。ピンが抜けた後、ピンセットで昆虫ピンを取り除きます。鈍端のパステールピペットを使用して、胚をPBSの入ったシンチレーションバイアルに移します。

胚をPBSで5分間ずつ2回洗浄し、その後twist bufferで5分間1回洗浄します。洗浄後、胚を0.1 mLのTris bufferが入ったガラスキャビティスライドに移します。Tris buffer溶液を0.1 mLのDAB溶液に置換します。使用したチップは漂白剤溶液の入ったバケツに廃棄してください。

DABを脱色するため、FEIフルオレセインイソチオシアネート蛍光フォーカス下のキャビティスライドの上にカバーガラスを配置します。移植ドナー細胞上の顕微鏡対物レンズが蛍光赤色に現れます。すべての蛍光赤色細胞が茶色になるまでFEI蛍光に曝露させます。これは、蛍光色素がFEI励起波長に曝露されることで、不溶性の茶色結晶へと光変換される結果として起こります。

DABの存在下で488 nmの光を照射します。この工程には20分から2時間かかります。光酸化反応の完了後、微小ピンセットを用いてカバーガラスを取り出します。

胚を、PBTWまたは0.1% tween 20を含むPBSを入れた20 mLのシンチレーションバイアルに転送します。最後に、カバーガラス、スライドガラス、およびガラスキャビティからDABを除去します。胚を可視化するために、漂白剤溶液でインキュベートして処理します。

in-situ ハイブリダイゼーションを行い、胚をDIGラベルプローブのみでインキュベートします。次に、Jo Video 2に記載されている手順に従って、写真撮影と切片作成を開始します。ここでは、神経誘導アッセイの例を示します。

最初、移植片を宿主胚の area lucita と area alpaca の境界に配置します。ドナー胚と宿主胚はいずれもステージ3+です。培養から9時間後、移植片が分化し始め、ステージ8-の頭部に見える構造を誘導し始めます。

培養から24時間後、固定により神経誘導が完了します。胚を光酸化処理に供します。まず、ドナー由来の色素で標識された細胞が、ここで赤色に示されているように、増殖して小型の神経管（neural tube）を形成していることがわかります。

光酸化後、これらの細胞は褐色に見えます。その後、胚を神経マーカーOtx2に対してホールマウントin situハイブリダイゼーションで処理します。これはBonelli博士の研究室で開発されました。

ドナー移植片が宿主由来組織においてOTX2の発現を誘導することが示されています。以上で、Chick胚を用いた神経誘導アッセイの実施方法について説明しました。この手順を行う際は、移植後にピペットを用いて移植片周囲のすべての液体を除去することが重要である点に注意してください。

これにより、移植片が確実に固定され、培養中にホスト胚から離脱することがなくなります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。