Name: 生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 学ぶマウスIL-17分泌TH17細胞の検出と分離法。サイトカイン分泌アッセイ技術を用いて、単一細胞レベルで生細胞を高感度に検出・分離する方法です。免疫学研究に有用です。

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試薬の準備<ol><li> BSAを含むPBS（0.5％）、および2mM EDTAを含むバッファーを加えます。気泡は、MACS分離カラムをブロックすることができるため、バッファーは2〜8℃使用前に脱気し、格納する必要があります。 </li><li>我々は、5％のマウス血清を含むRPMI 1640培地を使用してください。培地は、これらの化合物が細胞刺激の特異性を変えてしまうように、BSAまたはFCSを含めてはいけません。 </li><li>マウスIL - 17 Secretion Assayは - ミルテニーバイオテク-から細胞分離キット。 IL - 17キャッチ試薬、IL - 17検出抗体（ビオチン）、抗ビオチン- PE、およびAnti - PE MicroBeadsは：キットには、次のコンポーネントが含まれています。 </li></ol>脾細胞を刺激する<ol><li>このプロトコルは、このような非刺激脾細胞とT細胞のための対比として、陰性と陽性対照の存在下で行われる。このプロトコルは、無菌操作を用いて行われる。 </li><li> gentleMACS™のDissociatorを用いて分離されたマウスの脾細胞の単一の細胞懸濁液を準備します。細胞の濃度は、細胞計数を介して所定の必要があります。室温で10分間、200 × gでペレットは、細胞。 </li><li>遠心分離に続いて、ピペットを用いてペレットから上清を吸引除去する。ペレットの損失を避けるためにチューブをデカントしてください。 </li><li>今、培地中の細胞を再懸濁し、その後ウェルに加える。 mLのごとに10万セルと平方センチメートルあたり5万個の細胞の濃度に対して十分なメディアを追加。 </li><li>私たちの再懸濁した細胞の免疫応答を刺激するために、我々は、サンプルにイオノマイシン（1μg/ mLの）とPMA（10 ng / mL）を加え、穏やかにピペッティングして混合液を。その後、井戸はそれに応じてラベルが付いています。 </li><li>今、我々は37℃で3時間、私たちの細胞をインキュベートする予定° C刺激期間を開始するためにないミキシングを持つ。刺激の開始からのIL - 17の分析3時間に進みますので、それに応じて計画しています。 </li><li>分泌を停止するには、細胞を氷の上に置き、我々は静かに冷緩衝液をピペッティングによって刺激された細胞を収集している。次いで、細胞をウェルからのチューブに移していると二回目を洗浄しています。 </li><li>すべてのセルが収集されることを保証するために、それは顕微鏡下でお皿をチェックすることをお勧めします。細胞がまだ接続されている残っている場合には、冷緩衝液で皿を洗浄することにより、残りの細胞を収集することができます。あなたの細胞懸濁液内の任意のセルの塊は、事前に分離フィルタを使用して削除できます。 </li></ol>キャッチ試薬で細胞をラベリング<ol><li>それは、IL - 17分泌細胞の2％未満が存在する場合、このアッセイは最適に動作することを、注意することは重要です。 </li><li> IL - 17分泌細胞の濃度はそれに応じてボリュームを調整する2％を超えると予想される場合。 <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="図8" width="500" height="162" /></li><li>この手順の1つの潜在的な落とし穴は、それによって偽陽性を生成する、隣接するリンパ球から分泌される。二重特異性抗体は、非分泌性T細胞とトラップに結合するIL - 17を標識する際に発生する可能性がキャッチ試薬のクロスコンタミネーション、です。 </li><li>この問題を回避するためには、それはダウン前の冷緩衝液でラベリングや仕事へのIL - 17の拡散を遅くし、このクロスコンタミネーションを避けるために、細胞を冷却することが重要です。細胞は冷たい保つことに加え、それらは定義されている濃度に保たれている必要があります。 </li><li>ラベリングの手順を開始するには、我々は、15ミリリットル閉鎖可能なチューブに10万セルを使用してください。高い細胞数を使用するがある場合は、単にそれに応じてすべてのボリュームをスケールアップ。最適な細胞濃度が取得された後、冷緩衝液10mlを添加することにより細胞を洗浄。 </li><li>冷却遠心機（2〜8℃）で10分間、300 × gで細胞をスピンダウン。 </li><li>遠心分離に続いて、完全にピペットを用いて上清を吸引除去する。これは、セルの損失や不正確なボリュームにつながるとして、上清をデカントしてください。コー​​ルドバッファ、遠心分離、そして吸引10mlのを追加することで構成され、洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>今我々は、所望の純度のペレットを持っていることを、冷たい培地80μLに細胞を懸濁します。それらにラベルを付けるには、我々は今マウスIL - 17キャッチ試薬20μLを追加します。 </li><li>氷上で5分間細胞をインキュベート。 </li><li>氷上で5分間のインキュベーション期間の後、チューブを取り外し、37℃の暖かい培地10 mlに細胞を希釈する。その後MACSmixチューブローテーター上にチューブを固定し、37チューブをインキュベート° Cを連続的に動きの下で45分間。温度を37増加させると、° Cは、サイトカインの分泌を再起動します。 </li></ol> IL - 17検出抗体（ビオチン）とAnti - Biotin - PEと細胞のラベリング<ol><li> 37℃で45分間の分泌期間の後、氷上ですぐにチューブを置きます。これは、サイトカインの分泌を停止します。ここからその上に氷の上で細胞を維持することが重要です。コー​​ルドバッファを操作するキャッチ試薬のクロスコンタミネーションを避けることができます。 </li><li> 2〜8℃で300xgで冷緩衝液および遠心機でチューブを埋める℃で10分間。完全に上清を吸引除去する。洗浄工程の1つのより多くの時間を繰り返します。 </li><li>細胞ペレットを冷緩衝液80μLに再懸濁され、チューブを氷上に配置されます。 </li><li>抗体の非特異的な結合を避けるために、我々は、5分間氷上で10μlをのFcRブロッキング試薬とインキュベートの追加をお勧めします。その後、我々は、氷上で10分間、ビオチンとインキュベートする共役であるマウスIL - 17検出抗体（ビオチン）の20μLを加える。 </li><li>我々は2〜8℃で300xgでコールドバッファと遠心10mLを加えることによって前に行っているので、再度、細胞を洗浄℃で10分間。 </li><li>今すぐ上清を吸引し、冷バッファー80μlで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>私たちの二次抗体、抗ビオチン- PEの20μLを追加。 </li><li>細胞および二次抗体溶液を混合し、再び氷上で10分間チューブをインキュベートする。 </li><li>この2回目のインキュベーションが完了したら、10 mLの冷緩衝液および遠心で細胞を洗浄する。 </li><li>ペレットは現在、冷緩衝液500μlで再懸することができます。 </li><li>細胞はさらに下流の分析のために分離する必要がある場合、それらは磁気抗PE - MicroBeadsで標識し、MACSカラムとMACSのセパレーターを使用して手動または自動分離することができます。 </li><li>我々は現在、脾細胞のラベリングを完了し、分析のために準備が整いました。 </li></ol> FACS解析<ol><li>我々の分析では、フローサイトメトリーにより刺激と刺激脾細胞を比較します。 </li><li>フローサイトメトリー分析の前に、細胞が死細胞外ゲートに0.5μg/ mlで、ヨウ化プロピジウムで染色されています。 MACSQuant™アナライザーは、サンプルごとに20万セルにロードされており、我々は現在、サンプル中の相対的な抗体の反応性の散布図を見に行くされています。希少細胞の解析のための2つの重要な考慮事項 - IL - 17陽性細胞のような - フローサイトメトリーでは、次のとおりです。 <ul><li>前方散乱対側の散布図でリンパ球にゲートを設定</li><li>と死細胞（ヨウ化プロピジウムで染色）およびB -細胞（非特異的バックグラウンド染色を引き起こす可能性があります）をゲーティングは、さらに検出感度を高めるために</li></ul></li><li>我々はT細胞とB細胞を検出するためにCD45R/B220-PerCP抗体を検出するためにCD4 - APC抗体を使用。我々は、試料の前方および側方散乱の特性を参照してくださいとリンパ球集団にゲートを適用します。 </li><li>秒のゲートは、染色した死細胞と染色したB細胞（Y軸）を参照に適用した。これらの細胞は、T細胞の解析から除外されます。 </li><li>約0.003％（図4） - この例では、基本的に私たちのネガティブコントロールである、我々は非常に少数のIL - 17刺激を受けていない試料の分泌CD4陽性T細胞があることがわかります。 0.367％程度（図5A）分離前とMACS技術（図5B）と磁気分離後の60.76パーセント - 刺激T細胞集団を見ると、我々はその分泌IL - 17 CD4陽性T細胞のかなりの数を見ることができます。 </li></ol>

すべてのプロトコルとデータシートはwww.miltenyibiotec.comでご利用いただけます。 警告 試薬はアジ化ナトリウムが含まれています。酸性条件下でアジ化ナトリウムは極めて毒性がアジ化水素酸を、もたらします。アジド化合物は、廃棄する前に流水で希釈してください。これらの予防措置は、爆発の危険が生じる可能性のある配管内の付着物を避けることをお勧めします。

Th17細胞は適応免疫と炎症反応において重要な役割を果たし、自己免疫炎症を推進する上で重要なコンポーネントです。 細胞分離キット（PE） - 国内でのみ有効のマウスIL - 17 Secretion Assayは使用方法をこのビデオドキュメント。この手順を行うときには、出発細胞調製物におけるIL - 17分泌細胞の頻度の推定をすることが重要です。ラベリングおよびサイトカイン分泌の期間中に適切な細胞濃度は懸濁状態で他の細胞によるクロスコンタミネーションを防ぎ、信頼性の高い結果を保証します。

<table><tbody><tr><td>マウスIL-17分泌アッセイ細胞濃縮および検出キット (PE) </td><td>試薬</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;マウス IL-17 分泌アッセイ 細胞濃縮および検出キット&quot;&gt;マウス IL-17 分泌アッセイ細胞濃縮・検出キット&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>培地</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&quot;&gt;RPMI 1640培地&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>試薬</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;CD4陽性T細胞の分離&quot;&gt;CD4+ T細胞の分離&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>試薬</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;CD8α抗体（クローン 53-6.7）

抗CD8α抗体（クローン 53-6.7）は、マウスおよびヒトのCD8α抗原を特異的に認識する、高度に精製されたモノクローナル抗体です。この抗体は、細胞表面のCD8α分子に結合し、フローサイトメトリーによる解析や、磁気分離法によるCD8陽性細胞の分離・濃縮に最適化されています。

製品概要
CD8αは、T細胞のサブセットであるサイトトキック T細胞（CTL）の主要な表面マーカーであり、T細胞受容体（TCR）複合体と結合して、MHCクラスI分子への結合を安定化させる共受容体として機能します。本製品は、 CD8陽性T細胞の同定、分離、および機能解析において不可欠なツールとなります。

主な特徴
・高い特異性：CD8α分子に対して高い親和性と特異性を持ち、非特異的な結合を最小限に抑えています。
・多用途性：磁気分離（Miltenyi BiotecのMACS®システム）およびフローサイトメトリー解析の両方に適用可能です。
・検証済み：多様な細胞種および組織サンプルにおいて、一貫した性能が実証されています。

用途
・CD8陽性T細胞の分離：血液、脾臓、リンパ節などの単細胞懸濁液から、高純度かつ高回収率でCD8陽性細胞を分離します。
・細胞表面マーカー解析：フローサイトメトリーを用いて、細胞集団におけるCD8αの発現レベルを定量的に解析します。
・機能解析：CD8陽性T細胞の活性化、増殖、およびサイトカイン産生能の評価に利用されます。

仕様
・クローン：53-6.7
・標的：CD8α
・反応性：マウス、ヒト
・形態：抗体コンジュゲート（磁気ビーズまたは蛍光標識）&quot;&gt;CD8 $\alpha$ 抗体（ヒト）&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>プロピジウムヨウ化物溶液</td><td>試薬</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;プロピジウムヨード溶液&quot;&gt;プロピジウムイオダイド溶液&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcRブロッキング試薬、マウス用 </td><td>試薬</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&quot;&gt;FcRブロッキング試薬（マウス）&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>死細胞除去キット </td><td>試薬</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmixチューブローテーター</td><td>装置</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; 解離剤</td><td>装置</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro スターターキット</td><td>装置</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSカラム</td><td>ツール</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSセパレーター</td><td>ツール</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生存マウスil - 17分泌t細胞の検出と分離

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

MACSサイトカイン分泌アッセイ技術は、単一細胞レベルと実行可能なサイトカイン分泌細胞の高感度分離に分泌されたサイトカインを検出することができます。 IL - 17分泌細胞を標識するためには、マウス脾細胞の単一細胞の懸濁液を37に調製し、刺激°回転PMA /イオノマイシンとCは、サイトカイン分泌を誘導する。停止するには分泌細胞は、氷の上に配置され、IL - 17キャッチ試薬には、細胞表面の近くに分泌され、捕捉されたとして、白血球の細胞表面上のCD45に特異的に結合し、IL - 17に二重特異性抗体を公開されています。分泌は、その後、温度を37増加させることによって再起動され° CとIL - 17がキャッチ試薬によってトラップされる。分泌は、その後、氷上で細胞を配置することにより、再び停止されます。トラップされたIL - 17を検出するために、細胞はビオチンに結合した第二のIL - 17特異的抗体とAnti - Biotin - PE抗体とインキュベートされています。セルが、直接、フローサイトメトリーによって分析またはAnti - PEコンジュゲートマイクロビーズと、その後の標識によって分離と濃縮のために調製することができる。

この手順では、刺激により活発に分泌するIL - 17マウスTh17細胞の白血球の検出と分離を説明します。

生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離

MACSサイトカイン分泌アッセイ技術により、単一細胞レベルでの分泌サイトカインの検出と、生存可能な細胞の高感度な分離が可能になります。

max Cytokine分泌アッセイ技術を用いることで、単一細胞レベルでの分泌サイトカインの検出および、IL 17分泌細胞を標識するための生存サイトカイン分泌細胞の高感度な単離が可能になります。マウス白血球の単一細胞懸濁液を調製し、37 °CでPMAおよびイオノマイシンにより刺激してサイトカイン分泌を誘導し、その後分泌を停止させます。次に、細胞を氷上に置き、IL 17キャッチ試薬に曝露させます。温度を37°Cに上げて分泌を再開させると、IL 17はキャッチ試薬によって捕捉されます。白血球の細胞表面のCD 45と、分泌されて細胞表面付近で捕捉されたIL 17の両方に結合する二重特異性抗体を用い、その後、細胞を氷上に置いて再度分泌を停止させることで、捕捉されたIL 17を検出します。細胞を、ビオチン標識された2つ目のIL 17特異的抗体および抗ビオチンPE抗体とともにインキュベートします。これにより、フローサイトメトリーで直接解析するか、あるいはその後に抗PE結合マイクロビーズで標識して単離および濃縮を行う準備が整います。こんにちは、Miltenyi Biotechのサイエンティストのエリー・ランキンです。本日は、刺激によってIL 17を分泌するTH 17白血球を分離し、検出する手順をご紹介します。IL 17は獲得免疫と炎症反応において重要な役割を果たしており、自己免疫性炎症を促進させる上でも重要です。それでは、アッセイの方法を説明します。本日のプロトコールでは、まずBSAと2mM EDTAを含むPBSバッファーを調製する必要があります。気泡が入るとMax Separationカラムが詰まる可能性があるため、バッファーは脱気し、使用前に2～8°Cで保存してください。次に、5% mouse serumを含むRPMI 1640培地を使用します。これらの化合物は細胞刺激の特異性を変化させるため、培養培地にBSAやFCSを含ませないでください。最後に、MIL 10 E Biotech社のmouse IL 17 secretion assay cell enrichment and detection kitが必要になります。このキットには、IL 17キャッチ試薬、IL 17検出抗体、ビオチン、抗ビオチンPE、および抗PEマイクロビーズが含まれています。論理的には、非刺激のPLE細胞などの陰性および陽性コントロール、ならびにT細胞用のカウンターステインを用いてこのプロトコールを行うことになるでしょう。今回のデモンストレーションでは、刺激された細胞のみに焦点を当てて説明します。本プロトコールは無菌操作を用いて実施します。まず、GentleMax Associatorを用いて単離したマウス脾細胞の単一細胞懸濁液を準備します。細胞濃度は、細胞計数によりあらかじめ決定しておく必要があります。室温で200 Gs、10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。遠心分離後、ピペットを用いてペレット上の上清を吸引します。ペレットの流出を防ぐため、チューブを傾けて捨てる（デカントする）ことは避けてください。次に、細胞を培養液で再懸濁し、ウェルに添加します。その際、1 mLあたり10 million cells、1 cm²あたり5 million cellsの濃度になるように十分な量の培地を加えてください。再懸濁した細胞に免疫応答を誘導するため、サンプルにイオノマイシンとPMAを添加し、ピペッティングで穏やかに混合します。次に、各ウェルに適切にラベルを貼ります。ここで、刺激期間を開始させるため、混合せずに37°Cで3時間インキュベートします。刺激開始から3時間後にIL 17解析に進みます。したがって、それに応じて計画を立ててください。ここでは、刺激したマウス脾細胞を示しています。刺激された細胞の形態および細胞塊形成が、対照群とは明確に異なることに注意してください。分かりやすくするため、ここでは刺激された細胞のみを追跡します。ここから分泌を停止させるため、ピペッティングで穏やかに吸い上げ、刺激された細胞を回収します。冷やしたバッファーを用いて、細胞をウェルからチューブへ移し、2回目の洗浄を行います。すべての細胞が回収されているか確認するため、顕微鏡でディッシュをチェックすることをお勧めします。細胞がまだ付着している場合は、ディッシュをすすぐことで残りの細胞を回収できます。冷やしたバッファーを用いれば、プレパルティシパションフィルターを使用して細胞懸濁液中の細胞凝集を除去できます。この手順における潜在的なピットフォールの一つは、ラベル化中に起こり得る捕捉試薬のクロスコンタミネーションです。二特異性抗体が非分泌T細胞に結合し、隣接するリンパ球から分泌されたIL 17をトラップすると、偽陽性が生成されます。この問題を回避するためには、ラベル化前に細胞を冷却し、冷やしたバッファーを使用して作業することで、分泌を制限しIL 17の拡散を遅らせ、このクロスコンタミネーションを防ぐことが極めて重要です。IL 17分泌細胞が2%を超えて存在する場合、クロスコンタミネーションが発生する可能性があることに十分注意してください。IL 17分泌細胞の濃度が2%を超えると予想される場合は、適宜容量を調整してください。したがって、細胞を低温に保つだけでなく、規定の濃度に維持する必要があります。ラベル化の手順を開始するために、15 mLの密閉チューブに10 million個の細胞を用います。より多くの細胞数を使用する必要がある場合は、すべての容量を適宜スケールアップしてください。最適な細胞濃度が得られたら、10 mLの冷緩衝液を加えて細胞を洗浄します。次に、冷却遠心機を用いて細胞を300 Gsで10分間遠心分離します。遠心後、ピペットを使用して上清を完全に吸引してください。上清をデカンテーション（傾けて捨てること）すると、細胞の損失や液量の不正確さにつながるため、避けてください。10 mLの冷緩衝液の添加、遠心分離、および吸引からなる洗浄ステップを繰り返します。目的の純度のペレットが得られたら、細胞を少量の冷した培地で再懸濁してラベル付けを行います。次に、20 µLのマウスIL 17キャッチ試薬を添加します。細胞を氷上で5分間インキュベートしてください。氷上で5分間のインキュベーション後、チューブを取り出し、37 °Cに加温した培地10 mLで細胞を希釈します。次に、チューブをMaxMixチューブローテーターに固定し、37 °Cで45分間インキュベートします。絶えず撹拌しながら、温度を37 °Cまで上げるとサイトカインの分泌が再開します。37 °Cで45分間分泌させた後、直ちにチューブを氷上に置いてください。これによりサイトカインの分泌が停止します。ここから先は、細胞を氷上で保持することが極めて重要です。冷えたバッファーを使用することで、キャッチ試薬のクロスコンタミネーションを防ぐことができます。チューブに冷えたバッファーを満たし、2〜8°Cで300 Gsにて10分間遠心分離します。上清を完全に吸引します。洗浄ステップをもう一度繰り返します。細胞ペレットを80 µLの冷緩衝液で再懸濁し、チューブを氷上に置きます。抗体の非特異的結合を避けるため、10 µLのFCRブロッキング試薬を添加し、氷上で5分間インキュベートすることを推奨します。次に、ビオチン標識した20 µLのマウスIL 17検出抗体を添加し、氷上で10分間インキュベートします。その後、前述と同様に、10 mLの冷緩衝液を加えて細胞を洗浄し、2～8 °Cで300 Gs、10分間遠心分離します。次に、細胞ペレットを吸引し、80 µLの冷緩衝液で再懸濁させ、20 µLの二次抗体（Anti biotin pe）を添加します。細胞と二次抗体溶液を混合し、チューブを氷上でさらに10分間インキュベートします。2回目のインキュベーションが完了したら、10 millilitersの冷バッファーで細胞を洗浄し、遠心分離します。次に、ペレットを500 microlitersの冷バッファーで再懸濁します。以降のダウンストリーム解析のために細胞を分離させる必要がある場合は、anti PEマイクロビーズで磁気標識し、maxコラムとmaxセパレーターを用いて手動または自動で分離させることができます。SPLU細胞の標識が完了し、解析の準備が整いました。フローサイトメトリーを用いて、刺激したSP細胞と刺激していないSP細胞を比較します。死細胞を除去するため、細胞を0.5 µg/mLのプロピジウムイオダイドで染色します。フローサイトメーターに各サンプルにつき200,000個の細胞をロードし、サンプル中の抗体反応性の相対的な散布図を確認します。フローサイトメトリーによるIL 17陽性細胞のような希少細胞の解析において重要な2つの考慮事項は、前方散乱光（forward scatter）対側方散乱光（side scatter）プロットでリンパ球にゲートを設定することと、非特異的な背景染色を引き起こす可能性のあるプロピジウムヨードで染色された死細胞およびB細胞をゲートアウトすることです。検出感度をさらに向上させるために、ここでは、CD45RB20 PC抗体を用いてT細胞を検出するためにCD4 APC抗体を使用します。B細胞を検出するために、サンプルの前方散乱光および側方散乱光の特性を確認し、リンパ球集団の領域にゲートを設定します。次に、Y軸上で染色された死細胞と染色されたB細胞を確認するための2つ目のゲートを適用しました。これらの細胞はT細胞解析から除外されます。本例は実質的に陰性対照であり、非刺激サンプルにおいてIL 17を分泌するCD4陽性T細胞は極めて少なく、約0.003%であることがわかります。刺激したT細胞集団を見ると、IL 17を分泌するCD4陽性T細胞が相当数存在し、分離前で約0.367%、MACS技術による磁気分離後では60.76%となっています。以上、ビデオドキュメンテーションを通じて、Miltbio社製マウスIL 17分泌細胞濃縮・検出キット（PE標記）の使用方法を説明しました。この手順で最も重要なのは、開始集団に含まれるIL 17分泌細胞の頻度を把握しておくことです。適切な細胞濃度にすることで、標識およびサイトカイン分泌期間における相互汚染を抑え、信頼性の高い結果を得ることができます。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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生物学

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急性LCMV感染マウスにおけるウイルス特異的濾胞性ヘルパーCD4+ T細胞の早期分化へのアクセス

私たちは、磁気ビーズベースのT細胞濃縮およびペプチド:主要組織適合遺伝子複合体(MHC)四量体を通じて、マウス肺の希少抗原特異的T細胞集団を単離および同定するための詳細なプロトコールを提供します。...

ペプチド:主要組織適合遺伝子複合体四量体を用いたマウス肺由来の希少抗原特異的T細胞の同定

学ぶマウスIL-17分泌TH17細胞の検出と分離法。サイトカイン分泌アッセイ技術を用いて、単一細胞レベルで生細胞を高感度に検出・分離する方法です。免疫学研究に有用です。

生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離

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