5.10: 細胞周期分析:CFSE染色と流れサイトメトリーを用いた刺激後のCD4およびCD8 T細胞増殖の評価

1. 準備

1. 始め始めの前に、実験室の手袋と適切な防護服を着用してください。
2. すべての解剖ツールを殺菌し、まず洗剤で、次に70%のエタノールで乾燥させ、完全に拭き取ります。
3. 2%の胎児子牛血清(FCS)を含むハンクのバランス塩溶液(HBSS)の50 mLを調調します。

2. 解剖

1. 二酸化炭素送達システムを用いて、低酸素症でマウスを安楽死させる。サパンの位置の解剖プレート上で安楽死マウスを固定し、はさみと鉗子を使用して縦開腹術を行います。
2. 鉗子を使用して、腹部の右側に腸と胃を動かして胃と脾臓を露出させる。脾臓は胃に付着している。

ほとんどの免疫学研究では、免疫細胞の増殖を測定することが重要なステップであり、CFSE蛍光色素ベースの方法が一般的に使用されています。適切な細胞分裂は、免疫応答のレベルと特異性の両方を調節するため、免疫細胞にとって重要です。例えば、T細胞は増殖してがん細胞を同定して殺傷し、B細胞は細胞分裂を起こして特異的な抗体を産生します。CSFEアッセイの全体的な前提は、緑色蛍光色素CFSEで細胞を染色することを含み、CFSEは生細胞に入り、内部のタンパク質に安定して結合し、恒久的な標識をもたらします。その結果、色素を含む親細胞が分裂すると、各娘細胞は親細胞から蛍光の半分を得る。

このプロセスは、その後の分裂でも継続し、染料強度は分裂ごとに徐々に減少します。所望のエンドポイントで、各細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定します。次に、このデータを使用して、細胞が通過した分裂の数とパターンを定量化します。ここに示すように、蛍光が最も高い細胞集団は親世代の細胞集団です。2番目に高いものは2代目に属します。ピークの数は、細胞分裂の数を決定します。

さらに、初代免疫細胞を使用する場合、特定の細胞集団、例えばT細胞をCFSEとともに異なる色の蛍光色素で標識し、同時にマルチカラーフローサイトメトリーを使用して同定することができます。新しいデータを同じグラフにプロットし、異なるCFSE染色強度のT細胞亜集団を示すことで、T細胞の増殖速度を特異的に分析することができます。このビデオでは、抗CD3抗体で刺激するマウス脾細胞のCFSE染色のプロトコールを実演しています。その後、T細胞を標識するための染色と、その細胞増殖を追跡するためのフローサイトメトリーを行います。

まず、適切な防護服と実験用手袋を着用してください。次に、鉗子と解剖はさみを最初に洗剤で洗い、次に70%エタノールで洗い、次に清潔なペーパータオルで拭いて乾かします。50ミリリットルのチューブに1ミリリットルのFCSと49ミリリットルのHBSSを組み合わせることにより、2%の濃度の子牛胎児血清(FCS)を含む50ミリリットルのハンクスバランスソルトソリューション(HBSS)を準備します。溶液を約10回静かにピペッティングして混合します。次いで、脾臓Bリンパ球のFACS単離のためのビデオプロトコルで示されているように、マウス脾臓細胞を単離する。

15ミリリットルのチューブ4本を1〜4本に標識し、7番目の単離された脾臓細胞に10回1回加えます。次に、各チューブに3ミリリットルのHBSS 2%FCSを追加します。次に、5マイクロモルのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)を1マイクロリットル各チューブにピペットで入れます。チューブを摂氏37度で5%二酸化炭素インキュベーターで10分間インキュベートします。チューブ1とチューブ2の細胞は刺激されません。これらは、脾臓CD4およびCD8 T細胞の増殖の基礎レベルを明らかにするために使用されます。

これらのチューブにHBSS 2%FCSの10ミリリットルをピペットで移します。チューブ3と4は、細胞周期への影響を観察するために、抗CD3抗体によって刺激されます。10ミリリットルのHBSS 2%FCSおよび抗CD3抗体を最終濃度2.5マイクログラム/ミリリットルでチューブ3および4に添加します。次に、すべてのチューブを370 x gで摂氏10度で7分間遠心分離します。上清を捨てます。ペレットを2ミリリットルのHBSS 2% FCSに再懸濁し、得られた溶液を6ウェルプレート上の別々のウェルにピペットで移します。プレートに1から4までのラベルを慎重に付けて、サンプルの識別を追跡します。細胞を摂氏37度、CO25%で3日間インキュベートします。

3日目に、2ミリリットルのHBSS 2%FCSをウェル1と3に追加し、チューブ1と3の細胞を含める必要があります。ピペットで激しく上下させ、サンプルをラベル付きの5ミリリットルのFACSチューブに移します。6ウェルプレートをインキュベーターに戻します。ウェル 2 と 4 の残りの細胞は、5 日目に分析され、細胞周期に対する刺激の長期的な影響を調査します。チューブを370 x gで摂氏10度で7分間遠心分離し、上清を捨てます。次に、各チューブに100マイクロリットルの抗体ミックスを追加します。チューブを暗闇の中で氷の上で20分間インキュベートします。次に、各チューブにHBSS 2% FCSを1ミリリットル加え、チューブを370 x gで摂氏10度で7分間遠心分離します。上清を捨てます。ペレットを200ミリリットルのHBSS 2%FCSに再懸濁し、よく混合します。再懸濁したペレットを新しい標識されたFACSチューブに移します。

次に、FACSプロトコルに示されているように、フローサイトメトリーを使用してT細胞増殖を評価します。リンパ系CD3陽性細胞を選択し、CD4陽性細胞とCD8陽性細胞を区別するために細胞をゲートし、チューブ1と3のデータを記録します。5日目に、6ウェルプレートの残りの2つのウェルの細胞で細胞染色プロセスを繰り返します。

CD3刺激がCD4細胞とCD8陽性細胞の細胞周期に及ぼす影響を、刺激後3日と5日で解析します。まず、FlowJo アイコンをクリックし、ファイルを [All Sample] ウィンドウにドラッグします。3日目に採取した非刺激細胞のファイルをダブルクリックして、y軸に前方散乱光、x軸に側方散乱光のドットプロットを表示します。ポリゴンをクリックして、リンパ球集団の形態に基づいて丸で囲みます。サブポピュレーション同定ウィンドウで、ポピュレーションリンパ球に名前を付けて OK をクリックします。次に、丸で囲まれた母集団をダブルクリックし、新しいウィンドウで、y軸にThy1.2を、x軸にCD3を選択します。次に、多角形をクリックして、CD3とThy1.2のダブルポジティブセルを丸で囲みます。新しい亜集団の識別ウィンドウで、母集団に「T-Cells」という名前を付けて [OK] をクリックします。次に、丸で囲まれた母集団をダブルクリックします。新しいウィンドウで、Y 軸で CD4 を選択し、X 軸で CD8 を選択します。次に、多角形をクリックして、CD4陽性の母集団を丸で囲みます。新しい亜集団の同定ウィンドウで、集団にCD4 T-Cellsという名前を付け、[OK]をクリックします。次に、多角形をクリックして、CD8陽性の母集団を丸で囲みます。新しい亜集団の識別ウィンドウで、母集団にCD8 T-Cellsという名前を付け、「OK」をクリックします。他のファイルについても、これらの手順を繰り返します。

分裂細胞と非分裂細胞の頻度を決定するには、まず、レイアウトエディタをクリックして細胞集団を視覚化します。次に、CD4 T細胞とCD8 T細胞を4つのチューブのそれぞれからAll Sampleウィンドウにドラッグします。あなたの人口を表すグラフが表示されます。各チューブについて、CD8 T細胞のドットプロットをダブルクリックし、Graph Definitionの下のHistogramを選択して結果を視覚化します。パラメータとしてCFSEを選択すると、各時点で刺激を受けた細胞集団と刺激されなかった細胞集団が比較されます。非分裂細胞はより高いレベルのCFSEを維持しますが、増殖する細胞はCFSEの含有量を分裂細胞に分割します。

次に、Shiftキーを押しながら、ヒストグラムをダブルクリックします。新しいウィンドウで、範囲をクリックし、最も高いピークに対応するCFSEの範囲を選択します。サブポピュレーション同定ウィンドウで、ポピュレーションにNon-Dividing CD8 T-Cellsと名前を付け、ポピュレーションにDividing CD8 Cellsとラベルを付けます。次に、繰り返して、各チューブ内の分裂性CD4 T細胞と非分裂性CD4 T細胞を選択します。CD3陽性細胞の分裂頻度を調べるには、Table Editorをクリックします。次に、目的の集団である CD8 T-Cells の Dividing CD8 T-Cells と Dividing CD4 T-Cells を表にドラッグします。[統計量] メニューで、[T セルの度数] を選択します。次に、[Create Table]をクリックして、新しいテーブルの周波数を表示します。