養子細胞移植:宿主マウスへのドナーマウス脾細胞導入とFACSによる成功評価
ソース: ムニエシルヴァン1,2,3, パーチェットティボー1,2,3, ソフィー・ノヴォールト 4, レイチェル・ゴルブ1,2,3
リンパポイシスのための1ユニット、免疫学科、パスツール研究所、パリ、フランス
2 INSERM U1223, パリ, フランス
3ユニバーシテ パリ ディデロ, ソルボンヌ…
1. 準備
- 始め始めの前に、実験室の手袋と適切な防護服を着用してください。
- すべての解剖ツールを殺菌し、まず洗剤で、次に70%のエタノールで乾燥させ、その後完全に乾燥させます。
- 2%の胎児子牛血清(FCS)を含むハンクのバランス塩溶液(HBSS)の50 mLを調調します。
2. 解剖
- 二酸化炭素送達システムを用いて、低酸素症でマウスを安楽死させる。サパンの位置の解剖プレート上で安楽死マウスを固定し、はさみと鉗子を使用して縦開腹術を行います。
- 鉗子を使用すると、腹部の右側に腸と胃を動かして胃と脾臓を露出させる。脾臓は胃に付着している。
- 鉗子を使用して慎重に胃から脾臓を取り外し、HBSS 2%FCSの5 mLを含むペトリ皿の上に置きます。
3. 免疫細胞分離
- 脾臓を40μmのセルストレーナーの上にペトリ皿の上に置きます。脾臓をプランジャーでつぶして解離します。
- HBSS 2%FCSの1 mLでプランジャーとストレーナーをすすいで付着した細胞を回収します。
- 解離した脾臓と流体を15 mL遠心管に移します。
- 5ミリリットルのHBSS 2%FCSでペトリ皿を洗浄し、15 mLチューブに流体を移します。
- チューブを10°Cで7分間370 x gで遠心し、ペレットを避けて上清を捨てます。
- 塩化カリウムピペの2 mLでペレットを再ステーペンし、ペレットを再中断し、赤血球をlysese.
- 2 分間待ち、HBSS 2% FCS を再懸濁ペレットに追加し、最大 14 mL のボリュームを得ます。
- 10°Cで7分間370 x gでチューブを再度遠心分離します。上清を捨て、上下にピペッティングしてHBSS 2%FCSの5 mLでペレットを再懸濁します。
- トリパンブルー染色アッセイを使用して細胞をカウントし、HBSS 2%FCSの適切な体積を使用して、最終的な細胞濃度を107細胞/mLに調整します。
4. 採用移転
- 5mL回収管で得られた細胞懸濁液の2mLを転送する。
- チューブを10°Cで7分間370 x gで遠心し、上清を捨てます。
- PBSの2 mLでペレットを再ステージェントし、10°Cで7分間370 x gでチューブを遠心分離します。
- PBSの200 μLで上清を廃棄し、ペレットを再懸濁します。
- 29G針を用いた0.5mL注射器を用いて、200μLの細胞懸濁液を静脈内にレトロ軌道血中洞に注入する。
- 対照として、200μLのリン酸緩衝生理食生を用いて同じ血液間部に第2のマウスを注入する。
5. 細胞の収穫と染色
- 養子移植の4日後に、マウスを安楽死させ、脾臓を取り除く。
- セクション3に記載されているように脾細胞を収穫する。
- 各マウスから100μLの細胞懸濁液を2つのFACSチューブに転送し、「制御」と「転写」というラベルを付けます。
- チューブを10°Cで7分間370 x gで遠心し、上清を捨てます。
- 表1に記載の希釈物に4つの抗体を含む混合物を調出す。
| 抗体 | フルオロクロム | 希釈 |
| CD45.1 | BV711 | 1/200 |
| CD45.2 | APCCy7 | 1/400 |
| CD4 | バンブ786 | 1/1600 |
| CD3 | BV421 | 1/200 |
表1:抗体混合組成物。濃縮抗体蛍光コンジュゲートおよびHBSSを用いた4つの抗体カクテル調製製剤。
- 各チューブに100μLのミックスを追加し、暗闇の中で氷の上で20分間インキュベートします。
- HBSS 2%FCSの1 mLを追加し、10°Cで3分間370 x gでチューブを遠心分離します。
- 上清を廃棄し、HBSS 2% FCSの200 μLでペレットを再懸濁します。
- 再懸濁したセルを、ラベル付きの新しい FACS チューブに転送します。
- フローサイトメトリーを用いて、FACSプロトコルに示すように、CD45.2陽性リンパ球の存在を評価する。
6. データ分析
- "FlowJo"ソフトウェアを開き、各チューブのファイルを [すべてのサンプル]ウィンドウでドラッグします。
- 「転送済み」ファイルをダブルクリックすると、そのサンプルから記録されたセルがドット プロットに表示され、Y 軸に前方散布 "SSC-A"が表示され、X 軸上にサイド スキャッタ"FSC-A"が表示されます。
- 「ポリゴン」をクリックし、リンパ球を選択するゲーティング戦略を作成し、細胞表面マーカー(CD45.1、CD45.2)を使用してドナー細胞と宿主細胞を区別し、CD45.2+細胞集団(CD3、CD4)を特徴付けます。
- "コントロール マウス"ファイルで解析手順を繰り返します。
- セルの母集団を視覚化するには、[レイアウト エディタ]をクリックします。
- "転送されたセル"と "転送された CD4 セル"の母集団を "転送"ファイルと "コントロール"ファイルを "レイアウト エディタ] タブにドラッグします。
- CD45.2+細胞およびCD4リンパ球を表すドットプロットが現れる。
- CD45.2 転送されたセルは、"転送されたマウス"ドット プロットにのみ表示されます。
養子細胞移植は、目的の細胞を生物に導入する方法です。これは、特定のクラスの免疫細胞の作用を含む、さまざまな生物学的メカニズムを研究するための強力な手法です。さらに、養子縁組移植は、骨髄移植や、患者自身のT細胞を抽出し、がん細胞を認識して破壊するように改変し、腫瘍と戦うために体内に戻すことができるがん治療など、多くの疾患に対する有望な新規治療法です。
実験室では、養子縁組の移行を研究するために動物モデルがよく使用されます。例えば、CD45.1 Rag gamma-cノックアウトマウスは、造血幹細胞のリンパ球への正常な分化に不可欠な多くのサイトカインに対する基本的な受容体を欠いています。その結果、ノックアウトマウスはリンパ球の発達が損なわれ、ナチュラルキラー細胞、またはNK、細胞、T細胞、またはB細胞を有さない。
養子移植は、まず脾臓などの高濃度の免疫細胞を含むドナーマウス組織を採取することにより、欠落している免疫細胞をこれらの侵害されたマウスに導入するために使用することができます。その後、組織は解離し、免疫細胞を含むさまざまな脾臓細胞が単離されます。次に、不要な赤血球(赤血球)を塩化アンモニウムカリウム溶解バッファーを添加して溶解し、残りの白血球(脾細胞)を遠心分離を使用して細胞残骸から分離します。
最後に、精製した脾臓細胞を免疫不全マウスに注入することで、これらの細胞の機能の詳細な研究が容易になります。数日後、養子免疫細胞移植の成功は、まずドナー組織と同じ方法で宿主脾細胞を単離し、調製することによって確認することができる。次に、これらの細胞をドナー免疫細胞マーカーに対する標識抗体を使用して染色し、FACSを使用して検証および選別できるようにします。
まず、実験用手袋と適切な保護具を着用します。次に、鉗子と解剖はさみを最初に洗剤で洗い、次に70%エタノールで洗い、次に清潔なペーパータオルで乾かします。50ミリリットルのチューブに1ミリリットルのFCSと49ミリリットルのHBSSを組み合わせて、2%子牛胎児血清(FCS)を含む50ミリリットルのハンクスバランスソルトソリューション(HBSS)を準備します。溶液を約10回静かにピペッティングして混合します。
安楽死させたマウスを解剖し、脾臓Bリンパ球の分離のためのJoVEビデオプロトコルFACS技術で示されているように、その脾臓を摘出します。免疫細胞を単離するには、まず脾臓をペトリ皿の中の40μmの細胞ストレーナーに置きます。脾臓をプランジャーでつぶして、皿に解離させます。プランジャーとストレーナーを1ミリリットルのHBSS 2% FCSですすいで、接着した細胞を回収します。次に、解離した脾臓と液体をペトリ皿から50ミリリットルの遠心分離チューブにピペットで移します。ペトリ皿を5ミリリットルのHBSS 2%FCSで洗い、液体を15ミリリットルのチューブに移します。
チューブを370倍gで摂氏10度で7分間遠心分離した後、ペレットを乱さないように慎重にチューブを回収します。次に、ペレットを乱さずに上澄みを取り除き、液体を適切な廃棄物容器に捨てます。次に、2ミリリットルの塩化アンモニウムカリウム溶解バッファーを遠心分離チューブに加え、上下にピペットでペレットを再懸濁し、赤血球を溶解します。2分間待ってから、再懸濁したペレットにHBSS 2%FCSを加えて、合計14ミリリットルの値を取得します。遠心分離を繰り返します。チューブを慎重に取り出し、上清を捨てます。次に、ピペッティングを上下させて、ペレットを5ミリリットルHBSS 2%FCSに再懸濁します。次に、懸濁液中の細胞を数えます。5マイクロリットルのトリパンブルーを5マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、ピペッティングでよく混合します。次に、カバーガラスとマラセスライドの間に希釈した細胞懸濁液の5マイクロリットル滴を静かに沈殿させます。顕微鏡を40倍の倍率に設定して、細胞の数を数えます。HBSS 2% FCSを適量添加することにより、細胞濃度を10〜7細胞/mLに調整します。
養子移しを開始するには、細胞懸濁液の2ミリリットルを5ミリリットルのコレクションチューブに移します。チューブを370倍gで摂氏10度で7分間遠心分離し、上清を捨てます。次に、ペレットを2ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、チューブを370倍gで摂氏10度で7分間遠心分離します。上清を捨てます。次に、ペレットを200マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁します。29ゲージの針が付いた0.5ミリリットルの注射器を使用して、200マイクロリットルの細胞懸濁液を実験マウスに注入し、眼窩後静脈洞に静脈内投与します。
養子縁組の4日後、マウスを安楽死させ、脾臓を摘出します。次に、セクション3で説明したように免疫細胞を採取します。次に、各マウスから100マイクロリットルの細胞懸濁液を、コントロールと標識して移した2本のFACSチューブに移します。チューブを370倍gで摂氏10度で7分間遠心分離し、上清を捨てます。次に、表1に記載されている希釈率で4つの抗体を含むミックスを調製します。各チューブに100マイクロリットルの混合物を加え、次に暗闇の中で氷上で20分間インキュベートします。次に、各チューブにHBSS 2%FCSを1ミリリットル加え、チューブを370倍gで10°Cで3分間遠心分離します。上清を捨ててから、ペレットを200マイクロリットルのHBSS 2%FCSに再懸濁します。再懸濁した細胞を新しい標識FACSチューブに移します。次に、FACSプロトコルに示されているようにフローサイトメトリーを使用して、CD45の存在を評価します。2つの陽性リンパ球。
次に、CD45から単離されたCD45.2リンパ球の存在を確認します。1つの宿主脾臓。開始するには、FlowJoアイコンをダブルクリックし、すべてのサンプルウィンドウで各チューブのファイルをドラッグします。次に、転送されたファイルをダブルクリックすると、そのサンプルから記録されたセルが、x軸に前方散乱FSCA、y軸に側方散乱SSCAを表示するドットプロットに表示されます。ポリゴンをクリックして、リンパ球集団を丸で囲みます。新しいサブポピュレーションの識別ウィンドウが表示されます。[OK]をクリックします。次に、y軸をFSC-Wに、x軸をFSC-Aに設定します。前に示したように、ポリゴン ツールを使用して単一セル母集団を選択します。
次に、丸で囲まれた母集団をダブルクリックして、選択したセルの新しいウィンドウを作成します。新しいウィンドウで、YのCD45.2とXのCD45.1を選択し、Tアイコンをクリックし、軸をカスタマイズしてプロットを拡大します。次に、多角形をクリックしてCD45.2の正のセルを丸で囲みます。部分集団の同定ウィンドウで、細胞集団に転送された細胞に名前を付け、[OK]をクリックします。同じウィンドウで、長方形をクリックしてCD45.2のネガティブセルを選択します。部分集団の識別ウィンドウで、細胞集団にホスト細胞と名前を付け、[OK]をクリックします。次に、CD45.2の丸で囲まれた母集団、転送された母集団をダブルクリックして、選択した細胞の新しいウィンドウを作成します。新しいウィンドウで、YのCD3とXのCD4を選択します。
次に、多角形をクリックしてCD4 CD3陽性セルを丸で囲みます。この亜集団同定ウィンドウで、転写されたCD4細胞の細胞集団に名前を付けます。次に、コントロールマウスファイルを使用して前の解析手順を繰り返します。最後に、細胞集団を視覚化するには、Layout Editorをクリックします。転送された細胞と転送されたCD4細胞集団を、転送されたファイルと制御ファイルから[レイアウトエディター]タブにドラッグします。CD45.2陽性細胞とCD4リンパ球を表すドットプロットが表示されます。CD45です。転送された 2 つのセルは、転送されたマウスのドット プロットにのみ表示されます。
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Q1: What is adoptive cell transfer and why is it used in research?
Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.
Q2: Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?
CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.
Q3: How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?
The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.
Q4: What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?
Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.
Q5: How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?
The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.
Q6: What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?
FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.
Q7: What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?
Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.