養子細胞移植:宿主マウスへのドナーマウス脾細胞導入とFACSによる成功評価

1. 準備

1. 始め始めの前に、実験室の手袋と適切な防護服を着用してください。
2. すべての解剖ツールを殺菌し、まず洗剤で、次に70%のエタノールで乾燥させ、その後完全に乾燥させます。
3. 2%の胎児子牛血清(FCS)を含むハンクのバランス塩溶液(HBSS)の50 mLを調調します。

2. 解剖

1. 二酸化炭素送達システムを用いて、低酸素症でマウスを安楽死させる。サパンの位置の解剖プレート上で安楽死マウスを固定し、はさみと鉗子を使用して縦開腹術を行います。
2. 鉗子を使用すると、腹部の右側に腸と胃を動かして胃と脾臓を露出させる。脾臓は胃に付着している。
3. 鉗子を使用して慎重に胃から脾臓を取り外し、HBSS 2%FCSの5 mLを含むペトリ皿の上に置きます。

3. 免疫細胞分離

1. 脾臓を40μmのセルストレーナーの上にペトリ皿の上に置きます。脾臓をプランジャーでつぶして解離します。
2. HBSS 2%FCSの1 mLでプランジャーとストレーナーをすすいで付着した細胞を回収します。
3. 解離した脾臓と流体を15 mL遠心管に移します。
4. 5ミリリットルのHBSS 2%FCSでペトリ皿を洗浄し、15 mLチューブに流体を移します。
5. チューブを10°Cで7分間370 x gで遠心し、ペレットを避けて上清を捨てます。
6. 塩化カリウムピペの2 mLでペレットを再ステーペンし、ペレットを再中断し、赤血球をlysese.
7. 2 分間待ち、HBSS 2% FCS を再懸濁ペレットに追加し、最大 14 mL のボリュームを得ます。
8. 10°Cで7分間370 x gでチューブを再度遠心分離します。上清を捨て、上下にピペッティングしてHBSS 2%FCSの5 mLでペレットを再懸濁します。
9. トリパンブルー染色アッセイを使用して細胞をカウントし、HBSS 2%FCSの適切な体積を使用して、最終的な細胞濃度を10⁷細胞/mLに調整します。

4. 採用移転

1. 5mL回収管で得られた細胞懸濁液の2mLを転送する。
2. チューブを10°Cで7分間370 x gで遠心し、上清を捨てます。
3. PBSの2 mLでペレットを再ステージェントし、10°Cで7分間370 x gでチューブを遠心分離します。
4. PBSの200 μLで上清を廃棄し、ペレットを再懸濁します。
5. 29G針を用いた0.5mL注射器を用いて、200μLの細胞懸濁液を静脈内にレトロ軌道血中洞に注入する。
6. 対照として、200μLのリン酸緩衝生理食生を用いて同じ血液間部に第2のマウスを注入する。

5. 細胞の収穫と染色

1. 養子移植の4日後に、マウスを安楽死させ、脾臓を取り除く。
2. セクション3に記載されているように脾細胞を収穫する。
3. 各マウスから100μLの細胞懸濁液を2つのFACSチューブに転送し、「制御」と「転写」というラベルを付けます。
4. チューブを10°Cで7分間370 x gで遠心し、上清を捨てます。
5. 表1に記載の希釈物に4つの抗体を含む混合物を調出す。

抗体	フルオロクロム	希釈
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	バンブ786	1/1600
CD3	BV421	1/200

表1:抗体混合組成物。濃縮抗体蛍光コンジュゲートおよびHBSSを用いた4つの抗体カクテル調製製剤。

6. 各チューブに100μLのミックスを追加し、暗闇の中で氷の上で20分間インキュベートします。
7. HBSS 2%FCSの1 mLを追加し、10°Cで3分間370 x gでチューブを遠心分離します。
8. 上清を廃棄し、HBSS 2% FCSの200 μLでペレットを再懸濁します。
9. 再懸濁したセルを、ラベル付きの新しい FACS チューブに転送します。
10. フローサイトメトリーを用いて、FACSプロトコルに示すように、CD45.2陽性リンパ球の存在を評価する。

6. データ分析

1. "FlowJo"ソフトウェアを開き、各チューブのファイルを [すべてのサンプル]ウィンドウでドラッグします。
2. 「転送済み」ファイルをダブルクリックすると、そのサンプルから記録されたセルがドット プロットに表示され、Y 軸に前方散布 "SSC-A"が表示され、X 軸上にサイド スキャッタ"FSC-A"が表示されます。
3. 「ポリゴン」をクリックし、リンパ球を選択するゲーティング戦略を作成し、細胞表面マーカー(CD45.1、CD45.2)を使用してドナー細胞と宿主細胞を区別し、CD45.2⁺細胞集団(CD3、CD4)を特徴付けます。
4. "コントロール マウス"ファイルで解析手順を繰り返します。
5. セルの母集団を視覚化するには、[レイアウト エディタ]をクリックします。
6. "転送されたセル"と "転送された CD4 セル"の母集団を "転送"ファイルと "コントロール"ファイルを "レイアウト エディタ] タブにドラッグします。
7. CD45.2⁺細胞およびCD4リンパ球を表すドットプロットが現れる。
8. CD45.2 転送されたセルは、"転送されたマウス"ドット プロットにのみ表示されます。