細胞死に対するアッセイ:細胞毒性能のクロム放出アッセイ

手順の概要

細胞死を測定するための典型的^な51Cr放出アッセイには、次の手順が含まれます。

1. まず、標的細胞_にNa2^[51Cr]O₄で標識される。これは、アッセイ中のエフェクター細胞と区別する。
2. 標的細胞が標識している間に、エフェクター細胞が集められ、シリアル希釈技術を用いて、エフェクター細胞の減少滴定が丸底96ウェルアッセイプレートに生成される。
3. 標的細胞標識の終わりに、細胞が最初に洗浄され、次に一連のエフェクター細胞希釈を既に含むアッセイプレートに一定数の細胞が追加されます。
4. 次に、標的エフェクター細胞ミックスを一定期間インキュベートし、標的細胞との十分な細胞相互作用を可能にし、細胞リシスを媒介する。
5. 最後に、培養上清を採取し、チューブに集化する。⁵¹Cr量は、ガンマカウンタを用いて定量される。
6. 最後に、データが収集され、ターゲット細胞の「パーセンテージ特定細胞リシス」を計算するために使用されます。

1. ⁵¹Crでターゲットセルを標識する

1. 開始するには、標的細胞を、(ここでヒト黒色腫細胞株WM793)を、単一細胞懸濁液に調製する。
2. これを行うには、まず組織培養フラスコから培中を取り除きます。
3. 次いで、1X PBSの5mLで細胞を洗浄する。
4. プレートに1mLのトリプシンを2分間添加して細胞をトリプシン化する。
5. フラスコを軽くタップして、フラスコ表面からセルを緩めます。
6. フラスコに 5 mL の RPMI メディアを追加し、メディアを上下にピプテしてセルを取り外します。
7. セル懸濁液を15mLの円錐管に集め、1200rpmで5分間セル懸濁液を遠心分離します。上清をデカント。
8. ペレットに10mLのメディアを追加し、メディアを上下に優しくピプテリングして細胞を懸濁液に入します。
9. 血球計を用いて細胞濃度を決定する。
10. 1x10⁶セルを新しい15 mL円錐管に移します。
11. 1200 rpmで5分間セル懸濁液を遠心分離し、上清をデカントする。
12. 簡単に残された媒体の小容量で細胞ペレットを再中断するためにチューブを渦。
13. ^{51 Crの100}μCiをWM793ターゲット細胞懸濁液に直接追加します。
    注:特定の放射能に専用のラボスペースを設置する必要があります。さらに、すべてのステップの間^に51Crの安全な貯蔵および使用のための十分な鉛の保護^および51Crが付いているサンプルが保管されている場所を示す適切な看板がある必要があります。パンケーキプローブを装備したガイガーカウンターも必要です。
14. チューブに小さな放射性テープを追加して、チューブが放射性であることを示します。
15. リードシールドを使用してチューブを37°Cのインキュベーターに入れ、1時間インキュベートして15~20分ごとにチューブをフリックし、クロムの標的細胞取り込み量を増やします。
16. インキュベーション期間の後、5mLのFBSで標的細胞を洗浄し、余分^な51Crを除去する。
17. 1200rpmで細胞を5分間遠心分離し、放射性FBSを適切な廃棄物容器に洗浄します。
18. ペレットを再度中断し、FBSでもう一度洗います。ガイガーカウンターを使用して、組み込まれた放射能のペレットを確認してください。
19. ペレットを10mL完全培地で再ステージングし、10⁵セル/mLの細胞濃度を達成した。
    注:⁵¹Cr標識後の細胞計数ステップは、安全上の理由からここで大きく省略されている。WM793細胞濃度^は、51Cr標識以前と同じであると仮定することができる。

2. エフェクターセルの準備

1. 様々なエフェクター細胞を用いることができるのは、ヒトまたはマウスT細胞およびNK細胞などである。この例では、PBMCは、標準密度勾配遠心分離(5x10⁶の濃度)によって全血から単離され、使用された。
2. まず、96ウェルの丸底プレートの行の1つのウェル(ここでは行A、表1を参照)に100 μLの組織培養培地を追加します。ここでは、エフェクター細胞は追加されなく、標的細胞からの「最小/^自発的51Cr放出」を決定するための「ブランク」として機能します。

^表1:51Cr放出アッセイレイアウト:行A-標的細胞(10⁴細胞/100μL)を媒体のみでインキュベートした(「最小/^{自発的51Cr}放出」を決定するための「ブランク」を生成する)。異なるエフェクタを含む行B から C ウェル:ターゲット セル (E:T) 比(50:1 ~ 1.5:1) 。行H-標的細胞(10⁴細胞/100μL)を1%NP-40でインキュベート(NP-40は標的細胞をlyss)し、「最大または^合計51Cr放出」を生成する。すべてのE:T比は、すべての実験条件に対して三重で試験される。列1-3-非刺激 PBMC およびカラム4-6- CpG 刺激 PBMC。

3. 次に、PBMCの2Xシリアル細胞希釈(各実験条件に対して三重に)を生成し、5x10 5〜15,625細胞/100μLの培ブレン(ここではB~G行)のエフェクター細胞濃度を得る。
   注:この例では、開始エフェクタ:ターゲットセル(E:T)比は50:1です。ただし、この比率は実験の詳細に応じて調整できます。
4. これらのウェルにエフェクターセルを追加しないことで、最後の行を空のままにしておきます(ここでは行H)。(この行は、「合計カウント/分、または (c. p. m)」または「最大⁵¹Cr リリース」を生成するために使用されます。
5. ターゲットセルを追加する準備ができるまで、プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。

3. アッセイ^に51Cr標識WM793ターゲットセルを追加する

1. インキュベーション期間の後、インキュベーターから標的細胞を除去し、5mLのFBSで洗浄し、余分^な51Crを除去する。
2. 指定された遠心分離機を使用して、1200 rpmで5分間細胞を遠心分離する。
3. FBS洗浄(放射性上清)を適切な廃棄物容器に取り出します。
4. FBSの新鮮な5 mLでペレットを再中断することによって洗浄工程を繰り返します。
5. 細胞を1200 rpmで5分間遠心分離します。
6. 最後に、ペレットを10mLの完全培地で再中断する。
7. ⁵¹CrラベルWM793細胞懸濁液(10⁵セル/mL)を使い捨て試薬貯蔵所に注ぎます。
8. 次いで、これらの標識標的細胞の100μLを、96ウェルエフェクター細胞板の各ウェルに、マルチチャネルピペットを用いて加える。
9. 次に、エフェクター細胞を欠いている井戸の列に1%NP-40(水中)の100 μLを加えます(ここでは行H)。1% NP-40は標的細胞をlyseし、したがって、これらのウェルは、「合計カウント/分、または(c.p.m)」または^最大51Cr放出を決定するためのコントロールとして機能します。
10. プレートの両側にガス透過性テープの小片を追加してプレートに蓋を固定^し、51Crが含まれていることを示すために蓋に放射性テープの一部を置きます。
11. 簡単に言えば、1200 rpmでプレートを遠心分離します。実験プレートが 1 つだけ使用されている場合は、遠心分離機にバランス プレートを追加します。
    注:放射性サンプルを取り扱うには、遠心分離機を使用することが重要です。
12. 遠心分離機からプレートを取り出します。
13. プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、プレートの上に小さな鉛シールドを施し、安全性を高めます。16時間インキュベートして、標的細胞リシスを可能にする。
    注:インキュベーション期間は、使用されるエフェクター細胞および使用される殺戮の潜在的なメカニズムに応じて4〜18時間に変化しうる。

4. 上清の収穫

1. インキュベーション期間の終わりには、プレートの端の周りのテープを慎重に取り外し、蓋を取り外します。
2. 次に、収穫フレームをプレート上に置き、綿栓ごとに小さなフィルターディスクが設置されていることを確認します。これにより、無細胞の上清のコレクションが保証されます。
3. 今、ゆっくりと穏やかに井戸に綿のプラグを押します。
4. 約10秒後、綿栓の圧力を解放し、綿のプラグをチューブストリップに移します。
5. これらのチューブをそれぞれ二次 FACS チューブに入れます。
6. 最後に、FACSチューブをガンマカウンターにロードし、各条件で放出^される51Crの量を定量するためにサンプルを実行します。サンプルは通常1分間測定され、「カウント/分」を容易に決定することができます。
7. 慎重に、チューブがカウンターにロードされた順序を記録します。

5. データ分析

1. ここでは、最初の3列に非刺激PBMCを追加し、CpG刺激型PBMC(CpG ODN、24時間(1μg/mL))をカラム4-6に添加した。表 2 を参照してください。

	1	2	3	4	5	6	7	8
A	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
私	A1,A2,A3の平均		1164.67	自発的な午後		1058.33
J	平均 B1,B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	C1,C2,C3の平均		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	D1,D2,D3の平均		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	E1,E2,E3の平均		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	F1,F2,F3の平均		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	G1,G2,G3の平均		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	H1,H2,H3の平均		8884.67	最大 c.p.m		8885.67
				アンスティム PBMC			CpG-スティム PBMC	E:T比

表 2: ⁵¹Cr リリースアッセイ データ:'1 分あたりのカウント' / 'c. p. m' データ値、平均 c. p. m 値、および計算されたパーセント特定の lysis 値。

2. 収集されたデータ(1分あたりのカウント、すなわちc.p.m)は、サンプルが元のプレートにレイアウトされたのと同じ方法でスプレッドシートのセルに入力されました。
3. まず、三位一体の平均を算出した。表2-細胞I3〜P3、非刺激PBMCおよび細胞I6~P6について、CpG刺激PBMCについて。
4. 平均が決定されると、各条件に対する特定のリシスの割合は、以下の式を使用して計算された。
   
   
5. 特定のリシスの割合は、各条件について計算した(表2 -細胞J4からO4、未刺激PBMCおよびJ7からO7、非刺激PBMCについて)。