Name: 細胞生物学のためのタンパク質のマイクロコンタクトプリンティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学ぶマイクロコンタクトプリンティングを用いた細胞接着タンパク質パターニング法。フィブロネクチンをガラス表面に転写し、細胞外環境を再現して細胞生物学研究に応用する基盤技術を習得できます。

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1。ソリューションと材料の準備これらの手順は、事前に数日間行ってください。 <ol><li>ガラス製カバースリップ。透明になるまで、攪拌しながら、3比及び加熱：水1で混合：カバーグラスはLinbro 7Xの洗剤の溶液中に10分間浸漬することにより洗浄した。カバースリップを脱イオン水で広範に洗浄し、その後6時間450℃で焼成した。セラミック染色ラックにカバースリップをロードすると（試薬を参照）、このプロセスを簡素化。 </li><li>スタンピングのためのタンパク質溶液。 1 mg / mLの濃度のストック溶液にメーカーの指示に従って再構成のフィブロネクチン。 </li></ol> 2。トポロジカルマスターからスタンプをキャストこれらの手順は、事前に数日間実施することができます。組織培養皿のようなカバー料理の店のスタンプパターンアップ、。 <ol><li>圧縮、フィルタリングされた空気または不活性ガスの流れを使用してマスターから緩んでほこりを取り除きます。 </li><li>マスターよりちょうど大きいプラスチック皿の底に、マスター、パターン化された面を上に置きます。 60 - または100 - mm組織培養皿は、この目的に適しています。 </li><li> 10重量：1のエラストマーベース：ポリスチレン50 ml遠心チューブに、硬化剤の割合でSylgardコンポーネントを組み合わせる。使い捨てピペットのようなプラスチック製のデバイスを、使用して充分に混合する。皿の面積の平方センチメートル当たりエラストマーの少なくとも0.2 mlを調製。 </li><li>気泡を除去するために5分間300gで50 mlチューブを遠心します。 </li><li>マスター以上のエラストマーを注ぎ、その後30分間、真空下で、デシケーターに入れてください。 </li><li> 65℃以上で2時間オーブンでエラストマーを治す。より高い温度でと硬めのエラストマーで長い時間の結果を得るために硬化。室温に冷ます。 </li><li>マスターからの切手のシートを区切ります。 </li></ol> 3。ガラス上にフィブロネクチンのマイクロコンタクトプリンティング<ol><li>単一のタイムスタンプを切り取ります。 X 1エリア内のCMと1 cmに4ミリメートルX 4 mmの切手 - 厚さ2mmから始めるのが最も簡単である。スライドガラスまたはプラスチック製の小さな皿の上に置いてパターンのある面を上に。 </li><li> 30秒間、真空下で、プラズマクリーナー、およびプロセスにスタンプを置きます。その最高出力の設定のままHarrick科学プラズマクリーナーは（装置を参照）、PDMS表面を親水性にレンダリングされます。エラストマーのクラッキングに長い時間の結果。 </li><li>脱イオン水で50μg/ mlののプレス濃度にフィブロネクチン希薄溶液。 </li><li>スタンプのソリューションをスタンプの - 小さな滴（50μlの10）を置きます。それは、親水性の表面全体に行き渡ります。ドロップは、スタンプをカバーするが、エッジ上で実行されないことだけ十分な解決策を追加。 5分間スタンプするタンパク質の吸着をしてみましょう。 </li><li>キムワイプ®またはその他のクリーンペーパーのティッシュを使用して、パターン化された領域を触れることなく、タイムスタンプからタンパク質溶液のほとんどをオフに放出する。 </li><li>窒素のようなきれいな、乾燥した、不活性ガスの気流下でスタンプから残りの溶液を乾燥させる。 </li><li>ピンセットを使用して、ガラススライド、反転、および洗浄したガラスのカバースリップ（表面をパターン化する）と接触している場所からスタンプを削除します。良好な接触を促進する上に重量を配置。 5gの重さで始まり、プレス加工の間の調整、最適なパターニングを提供する特定の重量は、スタンプのサイズとパターンに依存しています。 1分のための表面に接触してスタンプにしておきます。 </li><li>慎重にスタックを分解し、カバースリップとは別のタイムスタンプ。 </li><li>精力的に表面に吸着されていないタンパク質を除去するために、脱イオン水に続いてPBSでパターン化されたカバースリップを、すすいでください。窒素気流下で乾燥したカバースリップ。 </li></ol>代表的な結果マイクロコンタクトプリンティングは、表面のパターニングの分子のための強力なプロセスです。図で、このプロセスは数十μmから数百ナノメートルに至るまでの寸法を持つフィーチャを作成する機能を持っています。緑色の斑点が図に示されている間、1A、左のロゴは、高さ各200μmです。図1Bは、直径1μmですと4μmの間隔で、測定中心から中心までの間隔で。図。図1Bは、また、添加剤のプロセスであるとすること、すなわち、マイクロコンタクトプリンティングの強力なプロパティを示しています。マイクロコンタクトプリンティングの複数のラウンドは、多成分系3を作成するための単一の表面に適用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/Figure_a.jpg" alt="図" /><img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" alt="図B" />

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

マイクロコンタクトプリンティングのプロセスは、パターニング基板のさまざまな分子の広い範囲をに適用されたこと、概念的に単純で非常に堅牢です。しかし、このプロセスはアートのようなもののまま。特定の作成されるパターンの形状、パターン化される蛋白質、適用される重量、およびコーティング/プレス条件は、すべてのスタンプ品質に影響を与えます。たとえば、しばしば大規模な機能を、図の右上ロゴに見られるようにパターンのギャップの結果に適用さすぎて少し体重、。 1A。逆に、あまり体重はプラズマ処理のステップが省略されている場合は、2番目の例で、特定のタンパク質（抗体など）より忠実にパターンをfeatures.Asパターニング間の領域におけるタンパク質の意図しない堆積の結果として、タイムスタンプのたるみと崩壊の原因となります、親水性PDMSを残して。ガラス上にフィブロネクチンのスタンプは、このプロセスの基本的なテクニックを示す、このような修正や最適化の出発点としてここに提示されます。

<table><tbody><tr><td>プラズマクリーナー</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質標識キット</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>染色ラック</td><td>試薬</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>試薬</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>回折格子</td><td>試薬</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞生物学のためのタンパク質のマイクロコンタクトプリンティング

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

基板上へのパターンのタンパク質やその他の生体分子への能力は、細胞外環境の空間的な複雑さを捕捉するために重要です。ホワイトサイズグループによるマイクロコンタクトプリンティングの開発（<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/"&gt; http://gmwgroup.harvard.edu/</a&gt;）は、1990年代半ばにマイクロエレクト​​ロニクス/ライフサイエンスに焦点を当てた研究室へのアクセス可能な微細加工技術を加えることによって、このフィールドをrevolutionalized。ポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプは、材料表面上の官能化学物質のパターンを作成するために使用されるこのメソッドの初期実装<sup&gt; 1</sup&gt;。それ以来、革新的なアプローチの範囲は、タンパク質を含む、パターンの他の分子に開発されている<sup&gt; 2</sup&gt;。このビデオでは、PDMSスタンプを作成するための基本的なプロセスを示しており、これらの手順が正確に言葉で表現するのは困難であるため、パターンの蛋白質にそれらを使用しています。我々は、パターン形成、パターニングの具体例として、ガラス製カバースリップ上に細胞外マトリックスタンパク質のフィブロネクチンに焦点を当てる。マイクロコンタクトプリンティングのプロセスの重要な構成要素は、スタンプがキャストされ、そこから位相的なマスター、です;マスターの昇降領域は、タイムスタンプにミラーリングして、最終的なパターンを定義している。一般的に、マスターはここで行われているように、フォトリソグラフィによってパターニングしてフォトレジストでコーティングし、シリコンウェハから構成されています。特定のパターンを含むマスターの作成には特殊な装置を必要とし、最高の製造センターや施設との協議に近づいている。しかし、トポロジーを持つほぼすべての基板は、プラスチック製の回折格子のようなマスター、（一例のための試薬を参照）として使用し、そしてそのような偶然のマスターは容易に利用できる、単純なパターンを提供することができます。このプロトコルは、手でマスターを持つことのポイントから開始されます。

マイクロコンタクトプリンティングは、材料の表面にパターンの蛋白質と他の分子に広く使用されています。我々は、ガラス上にフィブロネクチンのパターンをスタンプする、このプロセスの基本的な手順を示します。

基板上にタンパク質やその他のバイオ分子をパターニングできる能力は、細胞外環境の空間的な複雑さを再現するために重要である。...

マイクロコンタクトプリンティングは、細胞外環境の複雑さを再現するために、材料表面にタンパク質やその他の分子をパターニングするために使用されます。マイクロコンタクトプリンティングを開始するには、まずトポロジカルマスターを作成し、次にソフトリソグラフィーを用いてSylgardからマスターに基づいたスタンプを鋳造します。このスタンプにタンパク質をコーティングし、細胞が付着可能な新しい表面にタンパク質をスタンプします。こんにちは、チェンです。コロンビア大学生物医学工学のLance Camp博士の研究室に所属しています。こんにちは、機械工学科のGTです。こんにちは。コロンビア大学生物医学工学科のランス・ケムです。私たちの研究室では、細胞が細胞外環境におけるタンパク質の複雑な配列にどのように反応するかを研究するために、この手順を用いています。本手法は1990年代半ばにジョージ・ホワイトサイズ研究室によって開発され、広く利用される価値のあるツールとなっています。この手法には多くのバリエーションがありますが、本日はG and Co Uが基本的なマイクロコンタクトプリンティングプロセスについて実演します。それでは始めていきましょう。マイクロコンタクトプリンティングでは、スタンプに使用するカバーガラスとタンパク質溶液を数日前に準備しておく必要があります。まず、カバーガラスをリンボ溶液に浸し、溶液が透明になるまで10分間加熱・攪拌します。この工程および以降の洗浄・保存ステップは、カバーガラスをセラミック染色ラックにセットすることで簡略化できます。次に、カバーガラスを脱イオン水で十分にすすぎ、すすいだカバーガラスを45 °Cで6時間焼成します。タンパク質溶液を調製するため、製造元の指示に従ってフィブロネクチンを再構成し、濃度1 mg/mLのストック溶液を作成します。これらのストック溶液は-20 °Cで冷凍保存します。また、使用分のアリコートは4 °Cで一時保存します。スタンプの作製は、実験の数日前に済ませておくことができます。作製したスタンプは、組織培養皿のような蓋付きの容器にパターン面を上にして保存してください。まず、圧縮ろ過空気または不活性ガスのストリームを用いて、マスターから付着した埃を取り除きます。次に、マスターパターンを上向きにして、マスターよりもわずかに大きく、アルミホイルで覆ったプラスチック製ディッシュの底に配置します。この目的には、60 mmまたは100 mmの組織培養ディッシュが適しています。ポリスチレン製の50 mL遠心管内で、硬化剤とエラストマーベースを重量比1:10の割合で混合し、cyl guardコンポーネントを調製します。ピペットチップなどの使い捨てプラスチック器具を用いて十分に混合します。ディッシュの面積1平方センチメートルあたり少なくとも0.2 mi

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