Name: アミロイドペプチドに適用される変更されていないタンパク質（PICUP）の光誘起架橋 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶ光誘起架橋法（PICUP）を用いてアミロイドペプチドのオリゴマーサイズ分布を解析する方法。神経変性疾患の病態理解と治療戦略開発に貢献する重要な技術です。

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この作品は、公衆衛生のカリフォルニア部からラリーL. Hillblomアルツハイマー病協会から財団、IIRG - 07から58334まで、および07から65798からNIH / NIA、2005/2Eからの補助金AG027818とAG030709によってサポートされていました。

1。ペプチドの準備<ol><li>秤量〜というラベルの付いた、シリコンでコーティングされた、低吸着剤マイクロチューブに微量天秤および転送を使用して凍結乾燥したペプチド100〜200μgの。ここで、我々は、Aβ40のヒト配列、Aβ42、カルシトニン、およびGRFを使用してください。 </li><li>ここで、我々は均一な、集約フリーの準備を取得するためにペプチド1,1,1,3,3,3 - ヘキサフルオロ-2 - プロパノール（HFIP）で前処理を使用してください。予め形成された凝集体は、実験5の間で再現性の低下につながるアミロイド蛋白質の迅速な集約を、誘発するため、この手順が必要となります。そのようなろ過やSECのような他の方法もPICUP 6の集約-フリーの準備を取得するために使用することができます。 </li><li> HFIPを有するペプチドを治療するために、適切な保護（HFIPは揮発性と毒性がある）を身に着けているヒュームフード内部の氷の上にHFIPコンテナを事前に冷やします。 250mlのボトルの冷却は、通常、10〜15分が必要です。 0.5mMの名目上のペプチドの濃度を得るためにペプチドの凍結乾燥を含むあらかじめ冷却管にHFIPを追加。 </li><li>室温で5分間水浴の超音波処理のペプチドソリューションを超音波処理してください。 </li><li>穏やかに攪拌し、室温で30分間チューブをインキュベートする。 </li><li>氷上でチューブを（1分間）寒さ、および標識された0.6 mlの低吸着チューブ10 - 50 -μLアリコートにソリューションを分ける。 </li><li>窒素の気流下で蒸発させてHFIPを削除する、または一晩換気フードのオープンチューブを残す。一晩蒸発するため、ラック内の開いているチューブを配置し、ほこりや微粒子の汚染を防ぐために、キムワイプの大きなシートでそれらをカバーしています。 </li><li>凍結乾燥機で真空下での残りのHFIP、または30分間、または2時間真空入口に接続されているexsiccatorで遠心濃縮器をカラカラに乾燥させる最終製品は、マイクロチューブの下部にあるペプチドフィルムになります。適切に無水亜硫酸場合、チューブを-20または-80℃で長期間（数ヶ月）のために気密保存することができます。 </li></ol> 2。 HFIP処理ペプチドを可溶化すると写真が架橋<ol><li>架橋反応は、架橋と消光試薬を準備する一つのニーズにHFIP処理ペプチドを可溶化する前に。 </li><li>過硫酸アンモニウム（APS、ミスター228.2グラム/モル）を秤量し、10mMリン酸ナトリウム、20 mM溶液、pH7.4を準備する。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混ぜる。 </li><li> 10 mMリン酸ナトリウム中のトリス（2,2 - ビピリジル）ジクロロ（II）六水和物（RuBpy、氏748.63グラム/モル）、pH7.4の1mMの溶液を調製します。ボルテックスを用いて混合し、完全な溶解を確認してください。アルミ箔を使用して光からチューブを保護します。 </li><li>架橋結合は、次のSDS - PAGE解析のために、便利な消光試薬は、2の5％β-メルカプトエタノール× SDS - PAGEサンプルバッファーです。また、脱イオン水または適当なバッファー中で1 Mジチオスレイトール（DTT、ミスター154.5グラム/モル）を使用することができます。 </li><li> HFIP処理ペプチド膜を希NaOHで最初に溶解され、その後、リン酸ナトリウム緩衝液は、〜30μMのペプチドの濃度を得るために追加されます。追加60mMのNaOHは水酸化ナトリウムと水がそれぞれ10と、最終的な体積の45％を、構成するようなペプチドフィルムを含むチューブに精製水が続きます。先端、ピペッティングにより混合し、水浴の超音波処理で5分間超音波処理を用いてマイクロチューブの内壁からペプチドフィルムをこすり落とす。 </li><li> 45パーセント20 mMリン酸ナトリウム、pH7.4の、ピペッティングにより混和し、10分間16,000 gで遠心分離を追加。ネガティブコントロールの消光試薬と混合交差を解くにリンクされたペプチドのアリコートを脇に置きます。 </li><li> 1秒間にカメラのシャッターの遅延を調整する高い照射時間で、豊富なラジカル反応は、タンパク質分解を引き起こす可能性があります。カメラのシャッターをロードする。照射時間は、新しいタンパク質を持つメソッドを使用するときに最適化する必要があります。 </li><li>典型的なPICUP反応は20μlの反応容量で実行されます。 、薄肉、明確な0.2 mlのPCRチューブにペプチド溶液18μlを。 </li><li>ペプチド溶液に、1μlのAPSが続く1μlのRuBpyを追加し、（反応混合物中のRuBpyとAPSの最終濃度はそれぞれ0.05および1mMの、となる）ピペッティングにより試薬を混合する。 </li><li>すぐに1.8 mLのガラスバイアルの内部に反応チューブを置きます。カメラ本体の前面に取り付けられたベローズ内部にバイアルを置きます。レンズプロテクターを取り付け、試料はベローズ内部の1秒間照射されるように、シャッターを押してください。 </li><li>サンプルの照射後、すぐにバイアルからベローズとPCRの管からバイアルを取り出す。すぐに1μlのDTTまたはPAGEサンプルバッファーを減らす10μlを添加することにより反応をクエンチ。各ペプチドのアリコートに対して反応を繰り返します。 </li><li>反応混合物は、現在7日間より長くのためのストレージのために-20℃で凍結またはSDS - PAGEおよび銀染色によって分析する前に氷上で保存することができます。 </li></ol> 3。 SDS - PAGEとスライバー染色架橋ペプチド製品の<ol><li>ルーチンSDS - PAGEおよび銀染色、架橋ペプチドを可視化するために実行されます。 </li><li>レーンあたりペプチドの約130 pmolのを取得するために車線ごとの反応混合物の5μlをロードします。 </li><li>比較のために交差を解くにリンクされたペプチドの類似の額が含まれております。ペプチドのバンドの分子量を視覚的に近似するための標準的なタンパク質ラダーをも含まれています。 </li><li>標準的なゲル電気泳動装置を用いてゲルを実行します。我々は、InvitrogenからX細胞SureLockミニセルシステムを使用し、Invitrogen社出版IM - 1002、NOVEXプレキャストゲル電気泳動のガイドにしたがって銀染色を行う。 </li></ol>パート4：代表的な結果（図1） <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="図1" /> 図1：交差を解くにリンクを示す銀染色ポリアクリルアミドゲル（ - ）と（+）光架橋GRF、カルシトニン、Aβ40、Aβ42および SDS - PAGEとPICUP生成されたAβ40オリゴマーの銀染色分析は、より高いオリゴマー7の存在量の急激な減少が続く四量体を介して単量体の約類似のバンド強度を、示す。交差を解く連動型Aβ40は、モノマー7のそれと一致して氏に移行されます。 Aβ42は異なるオリゴマーのサイズ分布を示しています。 Aβ42オリゴマーは2-3グループ8を備える。最初のグループ、三量体を介して単量体は、増加するオリゴマーの順で減少する強度を表示します。第二のグループでは、ガウス状の分布は、五量体および六量体で最大で、四量体と量体との間で観察される。ここに示されていない第三のグループは、、氏〜30,000-60,000ダ8のオリゴマーが含まれています。これらの高いMRのオリゴマーは、一般的にSEC -孤立LMWAβ42がろ過またはHFIPの治療6で準備ができていないペプチドを用いて観察される。交差を解くにリンクされたAβ42は、主に二つのバンド、単量体のバンドとSDS 5,9により誘導される人工物である幅広いトリマー/四量体のバンドを、生成する。カルシトニンは強くダイマー、トリマー、テトラマーおよび7のプレ存在を示唆し、四量体を介して地域のモノマーの単調指数関数的に減少から分岐オリゴマーのサイズ分布が得られます。コントロールペプチド、GRFは、二量体からオリゴマーの見かけの相対量が増加して分子量を指数関数的に減少するような六量体までの範囲で単調性オリゴマーの分布を生成します。他の実験では、より高いオリゴマーは、7を視覚化することができます。正確な数とオリゴマーのバンドの相対強度は、実際のタンパク質濃度、ゲル上にロードされたタンパク質の量、および銀染色のプロトコルの開発のステップのために使用される時間に応じて実験の間で多少異なる場合があります。

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<li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li>
</ol>

PICUPは、安定したタンパク質複合体2を研究するためにもともと開発されました。メソッドは、Aβ10、プリオンと疾患関連PrP Scが11、およびα-シヌクレイン12を含む準安定アミロイドタンパク質の集合体の定量的研究、に後から適用されました。 PICUPの実験を設計する際に考慮しなければならない最も重要な要因は、試薬の化学量論、照射時間、及び試料調製の手順です。後者の問題は主に実験データの解釈に影響するのに対し、前者二つの問題は、経験的な最適化が必要な場合があります。特にアミロイド生成性タンパク質については、準安定オリゴマーのサイズ分布の決定は、集約フリー出発の準備を使用する必要があります。背景、メカニズム、計測機器、プロトコル、最適化、適用範囲、変更、アプリケーション、およびPICUPの制限は、以前の出版物1,2,13で覆われていた。 PICUPは、以下の分画と精製、構造解析のために使用される可能性、細胞毒性アッセイ、オリゴマー化阻害の研究、および分子認識ツールの開発のターゲットとして、その安定した、可溶性タンパク質のオリゴマーを生成するため...

<table><tbody><tr><td>Dolan-Jenner 200W白熱電球</td><td>その他</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>モデル 170-D</td><td>ランプによって発生する熱は&amp;#8211;短時間のインキュベーション期間であれば、サンプルに影響しません。</td></tr><tr><td>35mm一眼レフカメラボディ</td><td>ツール</td><td>Pentax</td><td>SP500モデル</td><td>本装置では、光源から10 cm離れた位置に配置した試料に効率的に照射するためのチャンバーとして、カメラ本体にベローズを取り付けています。</td></tr><tr><td>透明・薄壁PCRチューブ</td><td>その他</td><td>Eppendorf</td><td>Fisherより供給された951010006 L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル（1.8 mL）</td><td>その他</td><td>キンブル・チェイス</td><td>60940A 2（Fisher社製 03-340-60）</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>試薬</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサフルオロイソプロパノール</td><td>試薬</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>ドラフトチャンバー内で使用すること。</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40およびA&amp;#946;42</td><td>試薬</td><td>UCLAバイオポリマー研究室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルシトニン</td><td>試薬</td><td>アメリカンペプチド</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>トリス(2,2'-ビピリジル)ジクロロルテニウム(II)六水和物</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>溶液が透明になるまでボルテックスします。周囲の光から試薬を保護するため、RuBpyチューブをアルミホイルで覆います。RuBpyは毎回調製し、48時間以内に使用してください。</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>溶液が透明になるまでボルテックスミキサーで撹拌する。APSは毎回調製し、48時間以内に使用すること。 </td></tr><tr><td>&amp;#946;-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>SDS-PAGE分析を行う際に使用できます。</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS サンプルバッファー (2x)</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt; ミニセル</td><td>ツール</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine ゲル (10-20%)</td><td>その他</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS泳動バッファー (10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>シルバー・エクスプレス染色キット</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

アミロイドペプチドに適用される変更されていないタンパク質（picup）の光誘起架橋

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

毒性オリゴマーへのアミロイド蛋白質のアセンブリは、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病、遺伝性の筋萎縮性側索硬化症、および2型糖尿病を含むタンパク質のミスフォールディング病の病因に重要な出来事です。これらのタンパク質のアセンブリの準安定な性質のおかげで、それはそのような電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、または動的光散乱などの古典的な方法を用いて定量的にそのオリゴマーのサイズ分布を評価するのは困難である。アミロイド蛋白質のオリゴマーはオリゴマーがモノマーに解離すると同時に、大きなアセンブリに関連付けるれる準安定混合物として存在している。 PICUPは共有結合架橋やドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS - PAGE）やサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）などの分画法と組み合わせた場合、PICUPがクロスする前に存在したオリゴマーのサイズ分布のスナップショットを提供することによりオリゴマーの個体数を安定化 - リンク。したがって、PICUPは準安定タンパク質集団の可視化と定量分析を可能にし、シーケンスの変更とオリゴマー化の間に組み立てと解読の関係を監視するために使用することができます。<sup&gt; 1</sup&gt;。機構的に、PICUPは、Ruの光酸化を含む<sup&gt; 2 +</sup&gt;トリス（ビピリジル）ルテニウム（II）錯体（RuBpy）のRuに<sup&gt; 3 +</sup電子受容体の存在下で可視光照射による&gt;。 RU<sup&gt; 3 +</sup&gt;ラジカルタンパク質を生成し、隣接するタンパク質の分子から電子を抽象化することのできる強力な一電子酸化剤です。<sup&gt; 1,2</sup&gt;。ラジカルは不安定な、非常に反応性種であり、したがって、内と分子間反応のさまざまな急速に消える。ラジカルは、その後、水素原子を失い、安定した、共有結合している二量体を形成する二量体のラジカルを形成する別のタンパク質の単量体と反応する不対電子の高エネルギーを利用することができる。二量体は、次に高次のオリゴマーを形成する単量体または他の二量体と同様の機構を介してさらに反応する可能性があります。その他の写真または化学的方法で架橋相対PICUPの利点<sup&gt; 3,4</sup&gt;短い（≤1秒）の非破壊可視光への曝露、不要に含まれています<i&gt;事前に事実上の</i&gt;ネイティブ配列​​の改変、および長さゼロの共有結合架橋。さらに、PICUPは生理的パラメータを含む、広いpHおよび温度範囲内のタンパク質の架橋を可能にします。ここで、我々は3つのアミロイド蛋白質40の架橋にPICUPのアプリケーションを示す - と42残基のアミロイドβ-タンパク質変異体（Aβ40およびAβ42）、及びカルシトニン、および制御のタンパク質、成長ホルモン放出因子（GRF）。

変更されていないタンパク質（PICUP）の光誘起架橋は、準安定タンパク質混合物のオリゴマーのサイズ分布の特性評価が可能になります。とアミロイドβ-蛋白質、およびカルシトニンの42残基のフォーム、およびコントロールペプチド成長ホルモン放出因子 - 私たちは、3つの代表的なアミロイドペプチド40にPICUPのアプリケーションを示しています。

アミロイドペプチドに適用される変更されていないタンパク質（PICUP）の光誘起架橋

アミロイド形成タンパク質が毒性オリゴマーへと凝集することは、アルツハイマー病を含むタンパク質折り畳み異常疾患の病態生理における極めて重要なイベントである。

アミロイド形成タンパク質の可溶性オリゴマーは、その細胞毒性により、神経変性疾患の病態生理の根底にあると考えられています。これらのオリゴマーは、溶液中で絶えず形成と解離を繰り返しています。この事実は、この問題に対処するための阻害分子の開発に不可欠な構造研究を困難にする要因となっています。未修飾タンパク質またはピックアップの光誘起架橋が用いられます。この手法では、凝集が解消され可溶化されたアミロイド原性ペプチドを架橋試薬に曝露させ、その後1秒間の強力な光パルスを照射することで、ダイマーおよびオリゴマーを共有結合させます。その後、標準的な生化学的手法を用いて、オリゴマーのサイズ分布を解析することが可能です。こんにちは。私はカリフォルニア大学ロサンゼルス校神経学部のBatan研究室のFar Rahimiです。私はBean研究室のAl Maiです。本日は、未修飾タンパク質の光誘導架橋の手順について解説します。当研究室では、安定化したアミロイドβタンパク質オリゴマーを生成し、オリゴマー分布における構造変化を研究するためにこの手順を用いています。この手法は、安定したタンパク質複合体を研究するためにFancyとCoateによって最初に発表されました。その後、Battanらによって、アミロイドβやαシヌクレインを含む、準安定なアミロイドタンパク質会合体の定量的な研究に応用されました。それでは始めていきましょう。プロトコルの開始にあたり、氷上で予冷したヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）を、1～200 µgの凍結乾燥ペプチドを含むシリコンコーティング低吸着チューブに、最終濃度が約0.5となるように添加します。ミリモル濃度のHFIPはアミロイド原性ペプチドの凝集を防ぎ、結果の再現性を向上させます。次に、ペプチドが入ったチューブを室温で5分間ソニケーションします。超音波処理が完了したら、チューブを軽くボルテックスし、室温で30分間インキュベートします。30分後、ペプチドを氷上で1分間冷却します。冷却したペプチドを、0.6 milの低吸着チューブを用いて10から50 µLずつ分注します。次に、キャップを外した状態でチューブをフード内に配置します。HFIPを一晩かけて蒸発させるため、チューブラックをキムワイプで包み、チューブ内に埃が入らないようにします。HFIPの大部分が蒸発した後、チューブを真空デシケーターに入れ、2時間真空状態にして残りの微量のHFIPを除去します。最終産物は、チューブ内に形成されたペプチドフィルムの薄層です。これらのチューブは、−20°Cまたは−80°Cで数ヶ月間保存することが可能です。可溶化および光架橋ステップを開始するには、まず希釈した水酸化ナトリウム溶液でペプチドフィルムを溶解させます。水酸化ナトリウムを添加した後、脱イオン水、次にリン酸バッファーを添加し、最終溶液が45%のリン酸バッファー、45%の水、および10%の水酸化ナトリウム溶液となるようにします。チューブの壁面にタンパク質の膜が残っている場合は、それを溶液中に掻き出してください。ピペットチップを用いて懸濁したペプチドをピペッティングし、その後、ウォーターバス型超音波発生装置（Sonica）で1〜2分間ソニケーションを行います。超音波処理後、リン酸溶液を加え、ピペッティングで混合します。次に、チューブを16, 000 Gで10分間遠心分離します。遠心分離が行われている間に、フォトクロスリンキングの手順に向けてカメラの準備をしてください。カメラのシャッターディレイを1秒に設定し、シャッターをロードします。遠心分離が完了したら、透明な0.2 mL PCRチューブにペプチド溶液を18 µLずつ分注します。これらの分注サンプルを光架橋に使用します。架橋直前に、ネガティブコントロールとして使用するためのペプチド溶液を少量取り分けておいてください。1 µLの硫酸アンモニウムと1 µLのルテニウムを添加します。次に、速やかにチューブを1.8 Mのガラスバイアルに入れ、そのバイアルをカメラボディ前面に取り付けられたベローズの中に配置します。レンズプロテクターでカメラを閉じ、シャッターを押します。これにより、サンプルに1秒間の照射が行われます。照射時間が長すぎると、広範なラジカル反応によってタンパク質が分解されます。照射後、速やかに0.2 mil PCRチューブを回収し、β-メルカプトエタノールを含む調製済みのページサンプルバッファーを10 µL加えます。架橋ペプチドは-20 °Cで最大7日間保存可能です。その後、SDSページ、分画および銀染色を行います。架橋ペプチドを調べるには、通常のSDS-PAGEと銀染色を用いることができます。負荷量の推定についてですが、反応混合物を5 µLロードすると、約130 pmolのペプチドが得られます。ゲル電気泳動および銀染色の実施には、Invitrogen社のXcel Sherlock mini cell systemの使用を推奨します。Invitrogen社の出版物IM 1 0 0 2「no NOx precast gel electrophoresis guide」に従ってください。銀染色後、SDS-PAGEゲルを解析すると、非架橋のコントロールポリペプチドであるGRFは主にモノマーとして泳動されます。架橋されたGRFは、ダイマーからヘキサマーにわたる連続的なオリゴマー分布を示し、オリゴマーの見かけの相対的なバンド強度は分子量の増加に伴い指数関数的に減少します。非架橋のカルシトニンは、主にモノマーとして、一部がダイマーとして泳動されます。一方、架橋されたカルシトニンが示すオリゴマーサイズ分布は、当該領域において単調な指数関数的減少から大きく逸脱しています。モノマーからテトラマーまで検出されており、架橋されていないダイマー、トリマー、テトラマーが事前に存在していたことが示唆されます。Aβ40はモノマーとしてのみ泳動され、Aβ40を生成しました。すべてのリガンドにおいて、モノマーからテトラマーまでほぼ同様のバンド強度を示し、その後、より高次のすべてのリガンドの存在量が減少しています。架橋されていないAβ42は、主にモノマーバンドとトリマー・テトラマーバンドの2つのバンドを生成します。トリマー・テトラマーバンドは、SDSによる架橋によって生じるアーティファクトです。A Beta 42は、2つのグループからなる明確なオリゴマーサイズ分布を示します。第1グループのモノマーから三量体にかけては、オリゴマーの次数が増加するにつれて強度が低下します。第2グループでは、四量体から七量体にかけてガウス分布のような分布が観察され、五量体と六量体で最大値となります。以上の手順を用いて、PICUPによるタンパク質の架橋方法を説明しました。アミロイド形成性タンパク質を使用する場合、再現性のある結果を得るためには、調製物が凝集していないことを確認することが重要です。本動画で示した条件および実験内容は、対象となる解析物に応じて実験的に変更することが可能です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。ピックアップ実験がお役に立つことを願っております。

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生物学

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