Name: 侵害受容性および炎症性メディエーターの組織特異的な測定のためのヒトのin vivoバイオアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶマイクロダイアリシスを用いたヒト炎症皮膚からの間質液採取法。疼痛と炎症に関与する生化学的メディエーターを測定し、神経科学および疼痛研究の理解を深める。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

実験的な炎症の誘導： <ol><li>第一度日焼けはキャリブレーション、紫外線Bのソース（SaalmannマルチテスターSBB LT 499、Saalmann社、ヘレフォード、ドイツ）の助けを借りて、太ももの非日焼けした肌に誘導される。日焼けは、露出した皮膚の完全な発赤、または3回最小限の紅斑量（MED）を引き起こすために必要なUVB光線の3倍を適用することにより、マイクロダイアリシス実験を開始する前に24時間誘導される。 MEDは、研究開始前に各被験者に決定されます。エネルギーの正確な納期は、UV計（RM 12、博士グローベルUV -電子社、Ettlingenの、ドイツ）で保証されています。 </li></ol>カテーテル留置とサンプルの収集： <ol><li>滅菌手袋、23ゲージ（G）針、30Gの針と1cc注射器、1％リドカイン1滅菌ニードルホルダー、1ccルアーチップシリンジを使用してステージング領域を準備し、アルコール綿棒、2x2の滅菌ガーゼパッド、マイクロダイアリシスカテーテルは、一度に添付4センチメートル23G針（皮膚透析、エルランゲン、ドイツ）、そしてドライアイス上に100μlのサンプル当たり4μlプロテアーゼ阻害剤溶液と1.5ミリリットルMicrocentコレクションチューブ（E＆Kサイエンティフィック、サンタクララ、カリフォルニア州）に終了。プロテアーゼ阻害剤溶液は、プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤（Roche Diagnostics社、社、マンハイム、ドイツ）を使用して、製造元の指示ごとに行われます。 </li><li>乳酸リンゲル液の1％ヒトアルブミン溶液を調製し、1ccルアーチップシリンジにそれを描く、注射器に残っているに気泡がないことを確認すること。 </li><li>高精度の注入ポンプ（ポンプ22、ハーバード装置、南ネイティック、マサチューセッツ州に取り付けたクレードル（微小透析マルチシリンジラック、ハーバード装置、南ネイティック、マサチューセッツ州）に1％ヒトアルブミンの濃縮乳酸溶液を注射器をロードする）。注射器を駆動する輸液ポンプのバーは、シリンジのプランジャーと完全に接触していることを確認してください。シリンジの直径が正確にポンプに入力されていることを確認した後にポンプ速度を設定します。一般的に使用される注入速度は2〜4μl/minの範囲です。 </li><li>あなたからのサンプルを収集する予定の領域を定義します。このような日​​焼け上記の、日焼けの端にカテーテルを挿入する上での計画として人工的に作られた炎症部位からサンプリングするとき。 </li><li>あなたがアルコールと、からサンプルを収集する予定の小さな病変の反対側の端の領域、またはサイトをクリーニングします。これらのクリーンなエリアでは、意図した挿入とカテーテルのための出口点になります。ちょうど足りるだけの非常に小さな水疱（2mmの最大）を作成するために、これらのサイトで（注射で皮膚の蒼白によって証明される）内皮下リドカイン注入する。マイクロダイアリシスカテーテルの入口と出口でイントラ皮膚リドカインのような限られた量の注射は、バイオアッセイの結果を変更しないでくださいしかし、研究対象者に対して大幅に少ない痛みカテーテルの挿入を行うことはありません。 </li><li>無菌技術を用いて、探索皮膚領域の長さ以上添付23G針の助けを借りて、微小透析カテーテルを挿入する。挿入の深さは、皮膚と皮下組織の間のインタフェースになります。十分な深さで挿入は光学的に検証することができます。針と接続されたカテーテルを前方に移動されると、針は皮膚の少し上の折りたたみだけでなく、皮膚の一部白化を引き起こす必要があります。出血は発生しないはずです。出血が発生した場合、これは針が深く、意図したよりも置かれていることを示し、挿入の深さは調節する必要があります。針が皮膚の出口ポイントを介してプッシュされた後に、カテーテルの長さに沿って液滴を表示されるまで、1％アルブミンの濃縮乳酸リンゲル液ソリューションでカテーテルをフラッシュする。これは、慎重にマイクロダイアリシスカテーテルの遠位端にシリンジ（23G針）の針の端を挿入し、ゆっくりと溶液を注入することにより行われます。 </li><li>カテーテルをフラッシュした後、皮膚を介して接続されたカテーテルを養うために針を軽く引っ張る。カテーテルが小径、そして結果的に壊れやすいので、丁重な扱いが必要です。それは完全に皮膚を介してスレッド化されるまで、カテーテルを引っ張って、すなわち、カテーテルの遠位端を埋め込む大きなプラスチックチューブのベースには、エントリポイントで肌に触れる。前述のように、手順の最後にない出血の少ない、最適なカテーテルの配置を確認する。 </li><li>輸液ポンプのラックで休んで注射器の23G針の先端にカテーテルの遠位端を取り付けます。ケアは、潜在的な漏れの原因となるカテーテルの壁を通して針を穿刺を回避するために必要です。 </li><li>カテーテルの近位端から針をカット。 </li><li> ¼インチのピンクのテープを使用して、カテーテルの出口部に近い皮膚に準備さ1.5ミリリットルMicrocentコレクションチューブを取り付けます。 microdialysateのコレクションを可能にするためにコレクションチューブにカテーテルの先端を置きます。所定Rにおける灌流ポンプを起動します。食べて、断続的に配信され、収集されたボリュームが一致していることを確認。ケース内のボリュームが一致しない、皮膚の侵入部位からの漏れは（時々皮膚の侵入部位に、より緊密にプラスチックチューブにより埋め込まれているカテーテルの部分を引いて解決することができます）除外する必要があります。配信され、収集されたボリュームが一致しない場合あるいは、カテーテルを交換する必要があります。 </li><li>サンプリングが完了すると、サンプルは-80℃で貯蔵するまでドライアイス上に配置されています</li></ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

微小透析技術と多重イムノアッセイ技術の併用は、関心のある組織の生化学的事象についての洞察を提供する人間のバイオアッセイ、in vivoで、リアルタイムの貴重なものです。このような痛みのテストのような行動テストと組み合わせることで、方法は痛みや炎症を介在する生化学物質の複雑な相互作用を研究することができます。方法は、末梢組織病理で炎症と慢性疼痛の条件の病理にメカニズムの洞察を提供し、痛みや炎症、2）を仲介する組織特異的バイオマーカーを同定する）1について有望、及び3）の鎮痛剤/抗痛覚過敏や抗炎症作用を模索している新薬の候​​補とインターベンション治療。

<table><tbody><tr><td>マイクロダイアリシスカテーテル</td><td>ツール</td><td>Dermal Dialysis</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pump 22</td><td>ツール</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Saalmann Multitester SBB LT 400</td><td>ツール</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RM-12 IP-65 ラジオメーター</td><td>ツール</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>完全プロテアーゼ阻害剤</td><td>試薬</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>ツール</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>Albumin 5%</td><td>試薬</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>乳酸リンゲル液</td><td>試薬</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine-MPF</td><td>その他</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ 1mL</td><td>ツール</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

侵害受容性および炎症性メディエーターの組織特異的な測定のためのヒトのin vivoバイオアッセイ

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

この生体内のヒトバイオアッセイは、ヒトのボランティアと患者を研究するために使用することができます。サンプルは、無菌的に挿入した微小透析カテーテル（皮膚透析、エルランゲン、ドイツ）を経由して皮膚などの関連する組織のサイトから収集されます。この例に示すようにヒトのボランティアで実験的に炎症を起こしている皮膚から間質液のコレクションです。サンプルのコレクションは、他の実験的なテストと組み合わせることができます。例えば、局所的に放出さ生化学および実験的に炎症を起こしている皮膚の痛みを伴う刺激に対する主観的な感度の同時評価は、痛みや炎症のバイオマーカーを識別するための重要な生化学的、行動的リンクを提供しています。生きている人間の生体に提示アッセイは、疼痛および/または炎症の基礎となる組織特異的なプロセスへの機械的な洞察が可能になります。このような新薬候補として - - 痛みおよび/または炎症性状態の治療をターゲッティング法もよく、既存または新規の介入の有効性を調べるために適しています。この記事では、人間の被験者の実験的炎症を起こしている皮膚の病変から間質液を収集するためのマイクロダイアリシス技術の使用に関する詳細な説明を提供します。間質液のサンプルは、通常、50マイクロリットルのようなボリュームのような小さなサンプルで100検体までアッセイすることが可能マルチプレックスビーズアレイのイムノアッセイの助けを借りて処理されます。

技術は、痛みや炎症を介在する生化学物質の測定のための適切な組織のサイト（ここで、実験的に炎症を起こしている皮膚）から間質液サンプルの生体内のコレクションのために提示されます。

このヒト体内バイオアッセイは、健康なボランティアおよび患者を対象とした研究に使用できます。サンプルは、皮膚などの関連組織部位から、...を介して採取されます。

このビデオは、校正済みのUV光源を用いて患者の大腿部に実験的な日焼けを誘発してから24時間後に始まります。局所麻酔を適用した後、マイクロダイアリシスカテーテルを切開部と皮下組織の間に挿入し、皮膚を通して引き出します。カテーテルの近位端に灌流用シリンジを取り付け、灌流ポンプを作動させることで、マイクロライセートの流れを誘導し、回収します。採取後、検体は侵害受容および炎症性メディエーターの分析準備が整うまで-80 °Cで保存可能です。こんにちは、スタンフォード大学麻酔科のマーティン・アングストです。そしてこんにちは、1995年にここスタンフォード大学でアングスト博士によって設立されたヒューマン・ペイン・ラボラトリーのシニアリサーチナース兼マネージャーのマーサ・ティングルです。本日は、間質液を採取するために、ヒト被験者の実験的な炎症皮膚にマイクロダイアリシスカテーテルを留置する手順について解説します。当研究室ではこの手法を用い、痛みや炎症の媒介に不可欠な生化学物質の組織特異的な放出について研究しています。それでは始めましょう。実験的な皮膚炎症のモデルの一つに、人工的な日焼けがあります。校正済みの紫外線B（UVB）光源を用いて、一次日焼けを誘発します。UVメーターを使用することで、エネルギーの正確な照射を担保します。日焼けは通常、紅斑を誘発するために必要なUVB照射量の2〜3倍を照射させることで誘導されます。検体を採取する前に、滅菌手袋、滅菌ニードルホルダー、および23ゲージと30ゲージの針を装着した1 CCルアーチップシリンジを備えた準備エリアを設えます。また、一方の端に4 cmの23ゲージ針が装着されたマイクロダイアリシスカテーテルも必要です。サンプルは、サンプル100 µLあたり4 µLのプロテアーゼ阻害剤溶液を含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに回収します。プロテアーゼ阻害剤溶液は、製造元の指示に従い、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤を用いて調製します。乳酸リンゲル液で1%ヒトアルブミン溶液を調製し、それを1 ccルアーチップシリンジに吸い込み、シリンジ内に気泡が残っていないことを確認します。1%ヒトアルブミン濃縮乳酸リンゲル液を入れたシリンジを、高精度輸液ポンプに搭載されたクレードにセットします。複数のシリンジをロードすることで、さまざまな部位から間質液サンプルを同時に採取することが可能です。シリンジを駆動させる注入ポンプのバーが、シリンジのプランジャーに完全に接触していることを確認してください。シリンジの直径がポンプに正しく入力されていることを確認した後、ポンプの流量を設定します。一般的に使用される注入速度は、2～4 µL/minの範囲です。これで、カテーテルを留置する準備が整いました。実験的に誘発した日焼けなどの人工的に作成された炎症部位からサンプリングを行う場合は、サンプルを採取する領域を定義する必要があります。カテーテルは日焼け部位の端に挿入するように計画してください。サンプルを採取する予定の病変部またはCサイトの両端の狭い領域を、アルコール綿で清浄にします。これらの清浄化した領域が、カテーテルの挿入点および脱出口となります。30ゲージの針を装着した1 ccシリンジを用いて、1% Lidocaineを注入します。注入時に皮膚が白くなることで確認し、これらの部位に最大2 mmというごく小さな水疱（bleb）が生じる程度の量だけLidocaineを注入してください。無菌操作を用いて、マイクロダイアリシスカテーテルの挿入点と脱出口に少量のLidocaineを注入することで、被験者の挿入時の痛みを軽減できますが、バイオアッセイの結果に影響を与えることはありません。付属の23ゲージ針を用いて、調査対象となる皮膚領域の長さに沿ってマイクロダイアリシスカテーテルを挿入します。挿入深さは、切開部と皮下の境界界面とします。針とそれに接続されたカテーテルを前方に進めながら、適切に貫通していることを視覚的に確認してください。針を刺した際、皮膚がわずかに盛り上がり、一部が白くなるはずです。出血してはいけません。もし出血した場合は、針が想定よりも深く刺さっているため、挿入深度を調整する必要があります。針を皮膚の出口から押し出した後、針をゆっくりと引き、装着されているカテーテルを皮膚に通します。カテーテルは外径が小さく非常に脆弱であるため、慎重に取り扱うことが不可欠です。カテーテルを、太いプラスチックチューブの基部まで完全に皮膚に通るまで引いてください。カテーテルの遠位端が挿入点の皮膚に接するように埋設します。ここでも、出血がほとんどまたは全くないことが、カテーテルが正しく留置されたことを示します。サンプル回収を開始するには、まず1% albumin添加リンゲル乳酸液でカテーテルをフラッシュします。これは、23ゲージの針を装着したシリンジをマイクロダイアリシスカテーテルの遠位端に慎重に挿入し、溶液をゆっくりと注入することで行います。カテーテルの先端だけでなく、カテーテル全長にわたって液滴が見えるまでフラッシングしてください。カテーテルのフラッシング後、カテーテルの遠位端を、輸液ポンプのラックにセットされているシリンジの23ゲージ針の先端に接続します。1/4インチのピンクテープを使用し、カテーテルの壁を針で突き刺さないように注意してください。壁を突き刺すと液漏れの原因となります。準備した1.5 mLマイクロ遠心収集チューブを、カテーテルの出口に近い皮膚部位に固定します。マイクロライセートを回収するため、カテーテルの先端を収集チューブ内に挿入します。あらかじめ設定した速度で灌流ポンプを開始し、送液量と回収量が一致しているか断続的に確認してください。万が一、容量が一致しない場合は、皮膚挿入部からの漏れがないかを確認します。挿入部の漏れは、プラスチックチューブに固定されているカテーテル部分を皮膚挿入部位に向けてよりきつく引き寄せることで解決できる場合があります。あるいは、カテーテルを挿入し回収した場合、交換が必要になることがあります。サンプリング完了後、液量が一致しないことがあります。サンプルは、-80°Cで保存されるまでドライアイス上に置かれます。マイクロダイアリシスカテーテルを用いて、実験的に炎症を起こさせた皮膚から間質液を回収する方法を説明しました。次に、得られたサンプルをイムノアッセイで分析し、疼痛および炎症の生化学的マーカーを測定します。この操作を行う際は、カテーテルを非常に慎重に扱い、チューブに張力がかからないようにゆっくりと挿入することが重要です。また、挿入前に、研究の注入フェーズ用に準備した滅菌溶液を少量塗布してカテーテルを潤滑させると有用な場合があります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

human-vivo-bioassay-for-tissue-specific-measurement-nociceptive

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

特定の時点で手術創生化学的メディエーターを収集し、測定する技法。...

手術創における侵害受容性および炎症性メディエーターを収集し、測定

人間の被験者の実験的炎症を起こしている皮膚に熱や機械的な痛みのしきい値を評価するアルゴリズムが示されています。...

熱とヒトの炎症を起こしている皮膚における機械的痛覚閾値の決定

このビデオは、ヒトの肺組織由来免疫細胞をインフルエンザ菌とインキュベートすることにより、感染中の炎症メディエーターの定量化を示しています。フローサイトメトリーは、標識リンパ球のサイトカイン蛍光を測定するために使用され、細菌感染に応答した炎症誘発性サイトカインの産生と相関します。...

感染したヒト組織由来細胞における炎症性メディエーターの定量化

痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。...

人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

我々は、炎症ステージを区別するための非侵襲的な画像化方法を記載している。ルミノールの全身送達は、好中球MPO活性に依存して急性炎症の領域を明らかにする。これとは対照的に、ルシゲニンの注入はマクロファージにおけるphoxの活動に依存して慢性炎症の可視化を可能にします。...

急性及び慢性炎症を区別するために生体内イメージング法における

私たちは、オピオイド誘発性痛覚過敏およびマウスにおける耐性の発生を調べるためのプロトコルを記述します。ナイーブおよびモルヒネで処置した動物の熱的および機械的な侵害刺激反応の測定に基づいて、疼痛感受性（痛覚過敏）の増加を定量化および慢性アヘン剤投与に関連した痛覚脱失（許容範囲）が減少することを可能にする。...

熱的·機械的侵害受容性モダリティを用いて、マウスにおけるモルヒネ誘発痛覚過敏および鎮痛耐性の評価

この論文は、炎症の二つの異なる実験モデルにおいて、キーマトリックスメタロプロテアーゼのインビボ活性を視覚化するために活性化光イメージングプローブを用いた蛍光イメージングの応用について説明します。...

非侵襲的<em&gt;インビボ</em&gt;活性化可能な蛍光イメージング剤を用いた炎症性MMP活性の蛍光イメージング

形態学的変化は、活性化後の免疫応答性線維芽細胞で起こり、細胞募集の変化を促進する。遺伝子組み換え線維芽細胞特異的タンパク質1(FSP1)-creと組み合わせて2光子イメージングを利用する。tdTomatoフロキセドストップフロキシング(TB/TB)マウスラインと緑色蛍光タグ付きリポ多糖-FITCは、真皮線維芽細胞におけるリポ多糖類の非常に特異的な取り込みおよび生体内の形態変化を示すことができる。...

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

HNSCCの同系マウスモデルにおけるIL-1αの抗腫瘍活性および関連する毒性を研究するための標準プロトコルが記載されている。...

ポリ無水物IL-1αナノ粒子の 生体内 抗腫瘍活性の評価

ここでは、鎮痛効果を評価するために、両後足のカラギーナン注射による修正された炎症性疼痛モデルを紹介します。...

マウスの鎮痛効果を研究するための修正炎症性疼痛モデル

このプロトコルでは、マウスの膝の痛覚過敏を測定する方法が説明されています。急性膝痛のマウスモデルと変形性関節症(OA)のモデルで例を示しています。...

Pressure Application Measurementを用いたマウスの膝痛覚過敏の評価

学ぶマイクロダイアリシスを用いたヒト炎症皮膚からの間質液採取法。疼痛と炎症に関与する生化学的メディエーターを測定し、神経科学および疼痛研究の理解を深める。

侵害受容性および炎症性メディエーターの組織特異的な測定のためのヒトのin vivoバイオアッセイ

さらに動画を探す