Name: ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部解剖法。ピン固定、ハサミとピンセットを用いた標準化された手技で、免疫組織化学とイメージングのための神経生物学研究の基礎を習得する。

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あなたが始める前に<ol><li>すべての培養物は25℃で増殖させることが必要</li><li> HL3.1解剖バッファは事前に準備されることがあります。 HL3.1の50mlのアリコートを取り、それ氷上で保管してください。 </li><li> HL3.1で新鮮な3.5％のホルムアルデヒド15mlを準備する。それは氷上に置きます。 </li></ol>幼虫の解剖<ol><li>解剖のプレート上に冷たいHL3.1のドロップを置く。これは簡単に操作できるので、動物を乾燥し、スタンから動物を保持します。 </li><li> 長い鉗子を使用して 、放浪三齢幼虫を選択し、HL3.1のドロップに配置します。 </li><li>最初に、minutienピンを把握するために短いピンセットを使用してください。後部気門の間にピンを置きます。動物は通常、自分自身を伸ばしており、口のフックの近くに幼虫の頭の中で真正面からピンを配置することが容易にピンから離れてクロールしようとします。縦動物を差し伸べる。これは、あなたがカットの間に達成することができる公開された体壁の量を最大限に高めることができます。注：最初にヘッドを固定することを選択した場合、動物がピンの周りにその身体を包んだり、それが難しいピンになっ前後にその身体を鞭打つことができる。通常は、HL3.1を除去し、再び見事な新鮮な冷たい一滴動物を置くことによってこれに対抗することができます。両手利きの科学者はまた、単に動物をつかんで、所定の位置に保持することができます。 </li><li>春のはさみを使用すると、幼虫の背側後部のピンにちょうど前方水平方向の切開を行います。片足切開にハサミの刃と幼虫の吻側端に向かって背側正中線に沿って垂直に切断してください。動物の演壇で、ピンの左と右に水平方向の切開を行います。注：終了したら、結果はrostrocaudal軸に沿って幼虫の背側にある私のようになります。 </li><li>臓器を削除します。幼虫にHL3.1のいくつかの追加の滴を置くことによって始めます。これは、臓器は、はるかに容易にそれらを削除できるように身体の中から浮かび上がるようになります。最初に、気管系を削除します。第二に、臓器の残りの部分をつかむためにピンセットを使用してそれらを削除。 </li><li>ステップ3で使用するには、体壁の左フラップと右のフラップを作った。水平方向と垂直方向の両方で体壁を伸縮することを確認して時計回りの順序でフラップを固定する。 </li></ol>固定 25分間HL3.1の3.5％ホルムアルデヒドで各動物を修正。 5分間の二度HL3.1で動物を洗う。 ストレージピンを取り外し、1X PBSを含む1.5 mlチューブに幼虫を移す。あなたがイメージを融合させた蛍光タグを使用してNMJをする予定がある場合には、2日以内に画像動物をすべき。あなたは4℃で1週間にするための解剖幼虫を保存することができます代表的な結果適切に解剖ショウジョウバエの幼虫にいくつかの主要コンポーネントがあります。最初に、人は特に筋肉、筋肉4,6、および7を傷つけないように特に注意を払わなければならない。これらは、勉強する最も人気のある筋肉で、それらが損傷している場合はフィレットprepを破棄し、別の動物を解剖。第二に、人は動物が最大限に各筋肉とNMJを区別することができるように引き伸ばされていることを確認する必要があります。

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

このビデオで示さ解剖手法は、実験技術の様々なショウジョウバエの幼虫を準備するために使用することができます。蛍光タンパク質タグが存在する場合、幼虫をマウントし、すぐにイメージングすることができます。そうでなければ、免疫染色は、特定のシナプスコンパートメントをマークするために行うことができます。さらに、電気生理学は簡単に神経伝達の機能を評価するために解剖幼虫で行うことができます。 ショウジョウバエのNMJは、その基本構造と機能を点灯初期の研究以来、絶大な人気を集めています。1-4 ショウジョウバエ NMJの開発の研究で確認されている分子の多くは脊椎動物で保存されている。4そのため、数多くのショウジョウバエ NMJの研究を通して学んだ洞察力は、すべての生き物におけるシナプス生物学に適用可能です。いくつかの可能なアプリケーションでは、軸索ガイダンスに関与する分子の研究、運動ニューロン疾患、学習、及びメモリなどがあります。

HL3解剖バッファー：（mMで）70のNaCl、5のKCl、0.2塩化カルシウム、20 MgCl2を、10 NaHCO3水溶液、5トレハロース、115スクロース、および5 HEPES、pHは7.3。<br /<br /&gt; Sylgard解剖プレート：軽くミックス（泡を避けるために）ビーカー10:1。ペトリ皿（任意のサイズ）に混合物を注ぐ。 SylGardは37Cインキュベーターで一晩硬化させることができます。

ショウジョウバエ幼虫nmjの解剖

Drosophila Larval NMJ Dissection

市販<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;神経筋接合部（NMJ）は、シナプスの発達と可塑性の研究のために使用される確立されたモデルシステムです。の普及<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;モーターシステムはその高いアクセシビリティによるものです。それは、単一セルの分解能で解析することができます。その配置末梢体壁内に知られているhemisegmentあたり30の筋肉があります。 35運動ニューロンの総数は、高い忠実度を持つパターンにこれらの筋肉に付着する。分子生物学と遺伝学を使用して、一つはトランスジェニック動物または変異体を作成することができます。その後、一つはNMJの形態と機能に関する発達影響を調べることができます。研究のためのNMJにアクセスするためには、それは慎重にそれぞれの幼虫を解剖することが必要である。この記事では、適切に分析する方法を示しています<em&gt;ショウジョウバエ</em体壁には手をつけずにすべての臓器を削除することにより、NMJの研究のための&gt;幼虫。このテクニックは、イメージング、免疫組織化学、または電気生理学のための幼虫を準備するために適しています。

このプロトコルは、分析する方法を示しています<em&gt;ショウジョウバエ</em免疫組織化学および/または神経筋接合部のイメージングのための準備として、&gt;幼虫。

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

ショウジョウバエ（Drosophila）の神経筋接合部（NMJ）は、シナプスの発達と可塑性の研究に用いられる確立されたモデルシステムである。その広範な利用は...

この手順は、3齢幼虫を解剖プレートに置くことから始まります。幼虫の後端と前端にピンを刺します。はさみを用いて幼虫を切開し、ピンセットを用いて内臓を取り出します。最後に、固定中に幼虫の体壁をピンと張った状態で保持するため、体壁の四隅にさらに4本のピンを刺します。こんにちは、コロンビア大学医師外科大学生理学・ソロ生物物理学部門のBrian McCabe研究室のJonathan Brentです。本日は、ショウジョウバエ幼虫の解剖およびMJ解剖の手順について解説します。当研究室では、神経筋接合部のシナプス発達を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。ショウジョウバエの幼虫では、半体節あたりに30個の筋肉があり、それらの末梢体壁内における配置は既知となっています。計35個の運動ニューロンが、高度に定型的なパターンでこれらの筋肉に神経支配しています。神経筋接合部（NMJ）にアクセスするには、適切な解剖法を用いて各幼虫を慎重に解剖する必要があります。NMJは、免疫組織化学的なイメージングや電気生理学的な解析に使用できます。解剖プレートの上にHL 3.1バッファーを1滴落として手順を開始します。バッファーはあらかじめ調製し、氷上で冷却しておきます。大きなステンレス製ピンセットを使用して、バイアルの側面にいる遊泳中のthird end star幼生を慎重に採取します。この動きは、幼虫が蛹化（さなぎか）に入っていないことを示しています。解剖プレート上のバッファー滴の中に、幼虫を背面が上になるように置きます。冷たいバッファーで幼虫を麻酔し、静止させます。ピンセットを使用して、後方の球状部分の間に虫ピンを1本刺し、次に、幼虫が伸展して開展できる状態になるよう、暗色の口鉤の近くに2本目のピンを刺します。スプリングシザーを用いて、幼虫の後端に向かって小さな水平切開を加えます。シザーの片方の刃を切開口に挿入し、幼虫の前端に向かって縦方向に切開します。次に、ピンの左右の前端部分に水平切開を加えます。腸などの臓器を除去するには、動物にHL 3.1バッファーを数滴加えます。すると、腸やその他の臓器が溶液中に浮き上がってくるため、ピンセットを用いて体から取り除くことができます。また、他の臓器とともに気管系も除去してください。次に、切開して作ったフラップをピンで固定し、体内部の筋肉を露出させます。体壁を水平方向および垂直方向にしっかりと広げてください。フラップをピンで固定する際、残っている臓器の破片を取り除き、一度洗浄します。新鮮なHL 3.1バッファーを添加し、幼虫を固定する準備を整えます。1 XPBSで3.5%に希釈した調製直後のホルムアルデヒドに幼虫を完全に浸し、25分間待ちます。固定期間が終了したら、HL 3.1バッファーで幼虫を3分間、2回洗浄します。ピンを慎重に抜き、必要に応じて1 XPBSが入った1.5 mLチューブに幼虫を移します。幼虫は4 °Cで最大2日間保存可能です。最適な結果を得るために、解剖した幼虫はすぐに使用してください。適切に解剖されたショウジョウバエ幼虫には、いくつかの主要な構成要素があります。まず、筋肉、特に6番、7番、および4番を損傷させないように注意してください。次に、動物を適切に伸展させる必要があります。そうしないと、神経筋接合部へのアクセスができなくなったり、判別できなくなったりする可能性があります。適切に解剖された幼虫がここに示されています。NMJがはっきりと確認でき、実験準備が整った状態です。以上で、神経筋接合部を研究するための食道幼虫の解剖方法を説明しました。この手順を行う際は、筋肉を損傷させずに取り出すことが重要です。筋肉が損傷すると、研究対象となる神経筋接合部が存在しなくなるためです。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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