Name: ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部における免疫組織化学法。一次・二次抗体を用いてタンパク質を可視化し、シナプス形成の遺伝的制御を研究する。神経発生生物学の理解に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

あなたが始める前に<ol><li> PBT（1X PBS中0.1％トリトンX100）、PBTB（0.2％PBTでBSA）、及びPBTN（PBTBの2％のNGS）：以下の溶液を調製。 </li><li>ショウジョウバエの幼虫を解剖。 ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖を参照してください。 </li></ol>免疫組織化学<ol><li> PBTを含む1.5 mlチューブに幼虫を移動します。 PBTで15分間二回幼虫を洗ってください。注：洗浄するために、nutatorミキサーで1.5 mlチューブを置く。 pippetorで液体を除去し、新鮮な液体でそれを置き換えます。 </li><li> PBTを削除します。 30分間二回PBTBで洗浄する。 </li><li> PBTBを削除します。 15分間二回PBTNで洗浄する。 </li><li> 1時間または一晩4℃で室温でPBTNで希釈した一次抗体でインキュベートする。 </li><li> PBTBで二回リンスします。注：追加のソリューションをすすぎ、速やかに削除する。 </li><li> PBTBで15分間2回洗浄する。 </li><li> 30分間PBTNで洗浄する。 </li><li> PBTNで希釈した（とあなたがいずれかを使用している場合標識した1次抗体）を二次抗体でインキュベートする。 </li><li>室温で1.5時間アルミホイルとインキュベートでカバー。 </li><li> PBTBで二回リンスします。 </li><li> PBTBで15分間2回洗浄する。 </li><li>取り付けに進んでください。 </li></ol>取り付け注：サンプルはすぐにイメージ化される場合グリセロールでマウント。サンプルを撮像する前に格納される場合（1週間以上にわたって）またはサンプルが複数回撮像する必要がある場合はゴールドを延長するにマウントします。使用するには、2〜3分間65℃の水浴で延ばすのボトルを置きます。ゴールドを延長するのアリコートを取り、45〜50℃でヒ​​ートブロック上に保持<ol><li>時計皿にPBTのステンドプレップを注ぐ。 </li><li>処理のためにきれいなガラススライド上に、いくつかのグリセロールを置く。 </li><li>鉗子を使用してコーナーで時計のガラスからそれらを抽出することで処理のスライドに動物を移動する。彼らがダウンしてキューティクル側であることを確認してください。 </li><li>処理のスライドガラス上に新鮮なカミソリの刃で頭と尾を削除します。ブレード＃16 exactoナイフはこのためにうまく機能します。 </li><li>別のスライド（スライドをマウント）で、グリセロール/延長し、清潔なピンセットを用い、それを広めるの小滴を置く。 </li><li>それらを反転しないように注意しながら、それらのエッジにより実装スライドに切除した動物を移動します。同じ方向の行にそれらをマウントしてみてください。スライドごとに6月8日の動物をマウントします。 </li><li>延長する/グリセロールに端を置き、ゆっくりとそれを放出することによって上にカバースリップをドロップします。 </li><li>マニキュアとスライドをシール。 （注）[ワニスが乾燥するまでイメージしないでください。これは、通常10分かかります。延長させる金にマウントされているサンプルについては、密閉またはイメージを作成する前に、少なくとも3時間のためのスライドを乾燥させる。] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

それはNMJの可視化を可能にするため、免疫組織化学（IHC）は、NMJ生物学の研究に不可欠です。これは、神経細胞膜（例えば、HRP）、前シナプス（例えば、CSP、SYT）、および/またはpostsynapse（例えば、DLG）を認識する抗体を使用することによって実現されます。シグナル伝達分子、構造タンパク質、または興味の新規タンパク質も染色することができます。その後、遺伝子が変異またはmissexpressed、およびIHCは、シナプスの構造および/または神経シグナリングの摂動を検出することができますすることができます。 ショウジョウバエのNMJは、その基本構造と機能を点灯初期の研究以来、大きな人気を得ている。1-4 ショウジョウバエ NMJの研究で確認されている分子の多くは脊椎動物で保存されている。4したがって、洞察力は、研究を通して学んだショウジョウバエNMJの多くのシステムにおけるシナプス生物学にも適用可能である。いくつかの可能なアプリケーションでは、シナプスの発達、可塑性、および神経疾患に関与...

<table><tbody><tr><td>実体顕微鏡 &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>光源 KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SSピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Adams&amp;#8482; ニュテーターミキサー</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>No.1 精密ナイフ</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>No. 16替刃</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗退色剤</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエ幼虫nmj免疫組織化学

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

市販<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;神経筋接合部（NMJ）は、シナプスの発達と可塑性の研究のために使用される確立されたモデルシステムです。の普及<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;モーターシステムはその高いアクセシビリティによるものです。それは、単一セルの分解能で解析することができます。その配置末梢体壁内に知られているhemisegmentあたり30の筋肉があります。 31運動ニューロンの総数は、高い忠実度を持つパターンにこれらの筋肉に付着する。分子生物学と遺伝学を使用して、一つはトランスジェニック動物または変異体を作成することができます。その後、一つはNMJの形態と機能に関する発達影響を調べることができます。免疫組織化学は、NMJの構成要素を明確にイメージするために使用することができます。この記事では、我々は可視化する抗体染色を使用する方法を示します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫NMJ。

このプロトコルは、解剖さショウジョウバエの幼虫の免疫組織化学を実行する方法を示しています。

ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学

ショウジョウバエ（Drosophila）の神経筋接合部（NMJ）は、シナプスの発達と可塑性の研究に用いられる確立されたモデルシステムである。その広範な利用は……

このプロトコールでは、シナプス形成に関与するタンパク質を可視化するために、解剖したgsof幼虫に対して免疫組織化学染色を行う方法について説明します。一次および二次抗体のインキュベーション、ならびに洗浄工程の間、終始1.7 mLチューブを使用します。その後、幼虫を処理用スライドに転送し、エグザクトナイフでトリミングして観察し、検体を抗退色剤の一滴の上に移動させます。マウンティングスライド上で、最終的にカバーガラスをネイルポリッシュでスライドに封印します。こんにちは、コロンビア大学医学部生理学・細胞生物物理学教室のBrian McCade研究室のJonathan Brentです。私たちは、神経筋接合部におけるシナプス形成の遺伝的制御および発達中の結節の研究にこの手順を用いています。それでは始めましょう。gsof幼虫の免疫組織化学染色を行う前に、まず幼虫を適切に解剖します。この手順については、付随するビデオ論文「Drosophila Larva N MJ Dissection」をご参照ください。手順を開始するために、3つの新鮮な溶液を調製します。まず、調製したばかりのPBSに界面活性剤を加えてPBT溶液を作成します。次に、牛血清アルブミンの分注液をとり、それをPBT溶液に加えます。PBTBを調製するには、まず、通常のヤギ血清（aqua normal goat serum）をPB TB溶液に加え、PBTN溶液を作成します。これらの溶液を調製した後、幼虫を1 mLのPBTを含む1.5 mLチューブに移します。これが1回目の洗浄となります。各洗浄工程では、幼虫が浸漬されている溶液を交換し、その後、低速回転のムテーターミキサーで幼虫をインキュベートします。幼虫をチューブからチューブへ移すと損傷を与えるため、移動させないでください。最初の洗浄は室温で15分間行います。15分間混合した後、ピペットを用いてPBTを新しいPBTに交換し、さらに15分間幼虫を洗浄します。洗浄液を交換する際は、常に幼虫を傷つけないよう注意してください。PBTでの洗浄が完了したら、PBTBで30分間幼虫を洗浄します。新しい溶液を用いて、さらに30分間この洗浄を繰り返します。これでPBTBによる洗浄は完了です。PBTNで1回15分間、2回洗浄します。2回目の洗浄ステップにおいて、一次抗体を希望の作動濃度になるようPBTNで希釈します。洗浄後、幼虫をこの抗体混合液中で、室温で緩やかに混合しながら1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。インキュベーションが完了したら、一次抗体溶液をサイフォンで取り除き、残存している抗体を完全に除去するためにPBTBで幼虫を数回素早くすすぎます。次回の抗体インキュベーションに向けて幼虫を調製するため、PBTBで15分間1回洗浄し、続いてPBTNで30分間2回洗浄します。二次抗体をPBTNで目的の作業濃度に希釈し、この混合液中で幼虫を1時間30分間インキュベートします。室温での操作の際は、光への露出を防ぎ、floor fourの退色を最小限に抑えるため、必ず幼虫を遮光して覆ってください。1.5時間後、二次抗体溶液を除去し、幼虫をPBTBでさらに数回リンスします。次に、幼虫をPBTVで15分間、2回洗浄します。以降の幼虫の洗浄および保存は、光への曝露を最小限に抑えて行う必要があるため、必ず遮光して保存してください。幼虫を1.5 milチューブからガラス処理スライド上のPBTへ移します。これで幼虫をマウントする準備が整いました。染色した幼虫を、65 °Cの水槽で2〜3分間、加熱されたゴールド溶液でマウントします。その後、Eloquaを取り出し、50 °Cに設定したヒートブロック上に保持します。処理用スライドにPB TBを少量塗布します。幼虫をPB TBへ移します。16番ブレードのエグザクトナイフを使用して、幼虫のクチクラ側が下になるように回転させ、幼虫の頭部と尾部を切り落とします。この手順にはカミソリを使用することもできます。次に、マウントスライドを準備し、加熱した分注液から40 µLのprolonged goldをきれいなスライドに滴下し、清潔なピンセットを用いて広げます。ピンセットを使用してください。準備した幼虫を6〜8匹、処理用スライドから封入用スライドへ慎重に移します。幼虫を封入する際は、方向を揃え、クチクラ側を下にするようにしてください。溶液の上にカバーガラスを落として被せます。延長プール（prolonged pool）の辺縁の一端にセットし、サンプルを覆うようにカバーガラスを慎重に載せます。カバーガラスの端を、好みの色の厚手で安価なマニキュアを用いてスライドガラスに密閉します。スライドを最低3時間乾燥させてください。スライドの撮像を調製直後に1回のみ行う場合は、長時間金溶液の代わりにグリセロールを使用することが可能です。その場合、ネイルポリッシュとグリセロールの乾燥時間は、あらゆる染色プロトコルにおける3時間とは対照的に、わずか10分程度で済みます。目的は、低背景ノイズと相まった高い特異的信号を得ることです。これは、高品質な抗体を使用し、ブロッキングおよび洗浄ステップを徹底的に行うことで達成されます。これらの画像は、野生型のシナプスおよび、wishful thinkingまたはwitch変異体として知られる変異型タイプ2 BMP受容体を発現するショウジョウバエ系統のシナプスを示しています。神経細胞膜は、西洋ワサビペルオキシダーゼに対する抗体を用いて青色に染色されています。赤色で示されたシナプス小胞は、抗シナプス抗体で染色されています。緑色で示されたポストシナプスは、anti-discs large抗体で染色されています。これらの結果は、type two BMP受容体を変異させると、シナプスの発育不全表現型が生じることを示しました。この変異体は、BMPがシナプス末端のブトン数を制御する逆行性シグナルであることを立証する上で重要な役割を果たしました。ここでは、幼虫の食道神経筋接合部における免疫組織化学的染色の方法を説明しました。この手順を行う際は、最大限の再現性を確保し、バックグラウンドを低く抑えるためには、適切なタイミングで手順を実行することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、分析する方法を示しています...

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

このプロトコルは、無傷の麻酔とイメージングのための信頼性の高い方法を説明します...

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

の形態素解析ショウジョウバエ</em遺伝モザイクを使用>幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

このようなニューロンの樹状突起のような複雑な細胞の形状は、開発中に達成されるかを理解するために、それは正確にアッセイの微小管の組織にできることが重要です。ここでは、樹状突起分枝のニューロン感覚樹状突起の微小管の組織、気管、筋肉を調べるために堅牢な免疫標識法を説明し、他の...

免疫組織学的な感覚ニューロンの樹状突起における微小管の標識、気管、との筋肉ショウジョウバエ幼虫の体壁

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)は、シナプスの形態と機能を研究するためのモデルとして使用されます。このビデオでは、研究者がNMJを特徴付けるために定量化する重要な特徴について説明します。このプロトコル例は、定量を自動的に実行できるソフトウェアを示しています。...

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)の定量化:シナプスの形態と機能を評価する方法

このプロトコルは、近接ライゲーションアッセイは、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部で、その場のタンパク質-タンパク質相互作用に検出するために使用することができる方法を示しています。この技術では、大規模で胡-LIの太極拳シャオディスクは、シナプス後の領域に、以前に共免疫沈降を介して同定関連を複合体を形成することが示されている。...

の検出その場でタンパク質 - タンパク質複合体ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部

細胞内小器官の形態、サイズ、位置は進化的に保存されており、その機能に直接影響を与えるようです。これらのプロセスの根底にある分子メカニズムを理解することは、現代生物学の重要な目標となっています。ここでは、定量的手法の適用により、これらの研究がどのように促進されるかを示します。...

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

このレポートは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部を視覚化するための新しいサンプル調製手順を提供します。この方法は、従来の方法と比較してサンプルのカールを防ぐのにより効果的であり、 ショウジョウバエの...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

学ぶショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部における免疫組織化学法。一次・二次抗体を用いてタンパク質を可視化し、シナプス形成の遺伝的制御を研究する。神経発生生物学の理解に貢献する。

ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学

さらに動画を探す