ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

In vivo 2光子イメージングを使用して軸索を切断するには、麻酔をかけたゼブラフィッシュの胚をアロスの一滴以内に配置し、TEFLロンダリングとカバースリップからなる特殊なチャンバーで硬化させます。ガラスライトをチャンバーの上部に置き、その後、exオトミーの前に逆さまにします。切断したい軸索の前の画像を撮り、40倍で70倍にズームインし、エクソマイズしたい領域で

そして、レーザーをオフにして、レーザー出力を上げます。レーザーを短時間オンにします。軸索の残像では、外耳切開術が成功すると、軸索の破片が散らばっているのがわかります。

こんにちは、ジョージア・オブライエンです。こんにちは、サンドラ・リゴです。そして、私はショーナ・マーティンです。

私たちは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の分子細胞・発生生物学部のAlvarez TI研究室の出身です。今日は、生きたゼブラフィッシュの胚における2光子exソドミーとタイムラプス共焦点イメージングの手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて末梢体性感覚軸索の変性・再生を研究しています。

それでは始めましょう。まず、埋め込み用の1%低溶融アグロ溶液を準備します。アグロスを電子レンジで加熱して二重遠位の水に溶かし、アレックを小さなチューブに散水し、摂氏42度の加熱ブロックに保管します。

最初の胚は、受精後22〜24時間で5%PTUリンガー溶液に入れて、明るく自家蛍光を発する色素の形成を阻害し、2光子顕微鏡で軸索を覆い隠すことができます。次に、イメージング用の胚を選別し、鉗子で優しく引き離して胚の卵子を取り除きます。胚が選択されると、PTUリンガーに約0.02%のトリカを追加して麻酔をかけます。

先に進む前に、動物が触れても反応しないことを確認してください。ガラスまたはテフロンリングの片側に真空グリースを塗布し、ガラスカバースリップに固定することにより、長期イメージングチャンバーを準備します。PTU リンガーの多くを転送しないように注意してください。

ガラスピペットで1つの胚を42度のアグロ溶液に移します。次に、1滴のアグロスを含む胚を準備済みのカバースリップに移します。移植したら、アグロスが硬化する間、必要に応じて胚を配置します。

イメージングチャンバーは、銅のスリップが上面になるように、完了すると反転することに注意してください。電動ステージがあり、一度に複数の場所を画像化できる場合は、胚ごとにこれらの手順を繰り返します。アグロローズが完全に固まるのを待ちます。

次に、リングに0.02%tri犬用PTUリンガーを充填します。最後に、リングの反対側に真空グリースを塗布します。次に、ガラスライトでそれらを覆います。

シールチャンバーを裏返します。これで、2つの4トンエキゾトミーイメージングの準備が整いました。イメージングの準備をするには、マウントされた胚を顕微鏡下のスライドホルダーに置きます。

40 x 0.8 の開口数水対物レンズで 1 つの胚に焦点を合わせます。次に、レーザーをオンにします。レーザーを波長910ナノメートル、出力30ミリワットに設定します。

イメージングソフトウェアを開きます。猪の研究室のためにサンゴで開発されたスキャン画像ソフトを使用しています。この力で、切断される軸索の候補を探すためにフィールドをスキャンできます。

見つかったら、ターゲット軸索の画像を撮ります。最初と最後のZ位置をマークし、画像を取得して、Zスタックの最大投影を行います。次に、exアイテム化したい軸索の枝を70倍に拡大します。

電力を 180 ミリワットに上げ、Z スライスの数を 1 に設定します。グラブを押して、レーザーでシングルスキャンを開始します。これは軸索を切断するのに十分なはずですが、この手順を顕微鏡と実験目標に合わせて最適化する必要があります。

最後に、ズームアウトします。電力を30ミリワットに下げて、新たに切断された軸索の画像を撮ります。カスタムメイドの2光子スコープが研究室にない場合は、Zes five 10 confocal two photon microscopeを使用して軸索を切断することもできます。

まず、マウントされた胚をステージに置き、25 x 水対物レンズを使用して焦点を合わせます。次に、アルゴンヌレーザーの2つの光子をマルチトラック設定でオンにして、一方から他方に切り替えることができるようにします。GFPの検出には両方のレーザーが使用されますが、2つの光子の発光は赤で、アルゴンレーザーの発光は緑で視覚化されます。

この2つを区別するために、アルゴンヌレーザーを使用して、Z設定で耐える軸索を特定します。最初と最後の光学セクションにマークを付けます。共焦点画像を撮影し、ザックの最大投影を作成します。

アルゴンレーザーをオフにし、約9%の透過率で2光子レーザースキャンをオンにします。軸索にまだ焦点が合っていることを確認するには、停止ボタンをクリックして、切り抜きツールが利用可能になるようにします。切り抜きを使用して、対象領域を拡大します。

通常、約70倍にズームします。損傷する軸索の領域を選択し、この領域に焦点を合わせます。ズームはモードタブで確認できます。

次に、[チャネル]タブで、2つの光子の強度を約9%の透過率から15〜30%の透過率に変更します。新しい設定を有効にするには、高速XYボタンをクリックし、その後すぐに停止をクリックします。過剰な損傷を避けるために、手順が機能した場合、軸索は散在する破片と見なす必要があります。

最後に、軸索が実際に損傷したことを確認するには、4 88ナノメートルのアルゴンレーザーに戻します。別の共焦点画像を撮影し、Zacksの最大投影を作成します。2光子レーザー顕微鏡を使用して軸索を切断する2つの方法を示したので、zes LSM five 10を使用した再生の共焦点TimeLapseイメージングを見ていきます。

タイムラプスイメージングを準備するには、タイムラプスムービーを設定する少なくとも30分前に、加熱されたステージをオンにしてください。マウントされた胚を顕微鏡下のスライドホルダーに置きます。目的の空気対物レンズを持つ1つの胚に焦点を合わせます。

20 x 0.5の開口数対物レンズを使用し、Zeiss LSM five 10イメージングソフトウェアを開いてから、適切なレーザーをオンにして、目的の構成をセットアップします。スキャンステージとマルチタイムウィンドウを開きます。マルチタイムソフトウェアをお持ちの場合は、マルチタイムウィンドウで最初の胚の位置と構成を定義します。

スキャンウィンドウで高速スキャンをアクティブにしてから、ステージを目的のXY位置に移動します。スキャンウィンドウの最初と最後のZ位置をマークします。スキャンウィンドウでも停止を押してからmidを押し、中央のZスライスのスキャンが終了するのを待ちます。

次に、ステージウィンドウのマーク位置を押します。1つの胚のみをイメージングする場合は、マルチタイムウィンドウの単一位置タブをクリックします。[Replace X]、[y]、[Z]をクリックし、[save configuration]をクリックします。

前の設定を上書きするように求められたら同意します。これで、マルチローウィンドウで画像取得のパラメーターを設定できます。機械化されたステージがある場合は、複数の胚をイメージングするために複数の場所を設定できます。

この場合、最初のロケーションの X、Y、Z、および構成を定義する前に、複数のロケーション タブを選択する必要があります。また、複数のロケーションタブのすぐ下にあるプルダウンメニューがロケーション1にあり、設定セクションのプルダウンメニューにマルチローワンと表示されていることを確認してください。「save configuration」をクリックする前に、マルチタイムウィンドウで残りの胚の位置と設定を定義します。

次の胚の位置を特定し、高速スキャンを押してから、ステージを目的のXY位置に移動し、スキャンウィンドウで最初と最後のZ位置にマークを付けます。ストップを押します。次に、スキャンウィンドウの途中で、中央のZスライスのスキャンが終了するのを待ちます。

次に、マーク位置を押します ステージウィンドウで、X、Y、Z の置換をクリックします。複数の場所タブのすぐ下にあるプルダウンメニューが場所 2 にあり、設定セクションのプルダウンメニューにマルチローブ 2 と表示されていることを確認します。次に、[構成の保存]をクリックします。一致する。以前の設定を上書きするように求められた場合は、残りの胚に対してこのプロセスを繰り返します。

マルチローウィンドウで画像取得のパラメータを設定します。ブロックセクションのリストでGRGLオプションを選択します。次に、必要なグループの繰り返し回数を入力します。

これは、共焦点が各位置で画像を取得する回数です。パラメータセクションに希望のウェイト間隔を入力します。これは、1回のイメージングの繰り返しの開始から次の繰り返しの開始までの時間です。

設定セクションで Zack XY を選択します。下部のセクションにベースファイル名を入力します。[画像データベースの選択]をクリックして、データベースを選択します。

オプションボタンをクリックし、MDBフォルダを選択して一時ファイルも保存します。[最終画像を開いたままにする] をオンにします。最終画像、ザックの中央、およびウェイト間隔を選択します。

[OK]をクリックしてオプションウィンドウを閉じ、[開始時間]をクリックします。イメージング中は、マルチタイムウィンドウを開いたままにします。次に、データを分析します。

タイムラプス撮影が終了したとき。マルチタイムソフトウェアは、すべての一時ファイルを各場所の要約ファイルにコンパイルします。ムービーが完成する前に停止する場合は、必ず停止ではなく完了を押して、サマリーファイルを作成してください。

一時ファイルとサマリー ファイルは、指定された MDB フォルダーに自動的に保存されます。これは、受精後54時間でのexotomy後のタイムラプス共焦点動画の代表的な例です。最初のフレームは、外耳切除術前の軸索の背側図を示しており、次の時間には黄色の矢印が外耳切除部位を指しています。

ラプス動画は、ex otomy後1時間以内に始まり、12時間続きます。20分ごとに1つの共焦点スタックが収集されました。このラプス共焦点動画は、受精後78時間で同じパラメータを使用して記録されています。

最初のフレームは、ex sodomyの前の軸索の側面図を示しており、黄色の矢印がex sodomy部位を指しています。今回は、2光子ソドミーとタイムラプス共焦点イメージングを使用して、正確な組織損傷を生成し、生きたゼブラフィッシュの胚を視覚化する方法を紹介しました。この手順を実行するときは、過剰な損傷を引き起こさないように、2光子レーザーexソドミーに使用される電力量を最適化することが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。