ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

生体内2光子イメージングを用いて軸索を切断するには、TEFLON製ランダリングとカバースリップで構成される専用チャンバー内で、アロスが凝固する間に麻酔をかけたゼブラフィッシュ胚を液滴の中に配置します。チャンバーの上にガラスライトを置き、軸索切断の前に上下を反転させます。切断したい軸索の40倍の事前画像を取得し、切断したい領域を70倍でズームします。

レーザーをオフにした状態で、レーザー出力を上げます。レーザーを短時間オンにします。軸索の残像に、軸索の破片が散在していれば、切断は成功しています。

こんにちは、ジョージア・オブライエンです。こんにちは、サンドラ・リゴです。そして、ショーナ・マーティンです。

私たちはカリフォルニア大学ロサンゼルス校の分子細胞発生生物学部、Alvarez TI研究室の者です。本日は、生存ゼブラフィッシュ胚における2光子励起切除およびタイムラプス共焦点イメージングの手順をご紹介します。当研究室では、この手法を用いて末梢体性感覚軸索の変性と再生について研究しています。

それでは始めていきましょう。まず、埋め込み用の1%低融点アガロース溶液を調製します。アガロースを2回蒸留水に溶解させ、電子レンジで加熱した後、小さなチューブに分注し、42°Cのヒーティングブロックで保存します。

まず、受精後22～24時間で胚を5% PTUリンガー液に浸し、色素の形成を抑制します。色素は強い自己蛍光を発するため、2光子顕微鏡での軸索の観察を妨げる原因となります。次に、イメージングに使用する胚を選択し、ピンセットで慎重に引き離して絨毛膜を取り除きます。胚の選択後、PTUリンガー液に約0.02% tricaineを添加して胚を麻酔します。

次に進む前に、動物が接触に反応しないことを確認してください。ガラスまたはテフロン製のリングの片側に真空グリスを塗り、それをガラスカバースリップに固定して、長期イメージングチャンバーを準備します。その際、PTUリンガー液を多く移さないように注意してください。

ガラスピペットを用いて、1個の胚を42°Cのアグロ溶液に移します。次に、アグロ溶液1滴と共に、胚を準備したカバーガラス上に移します。移した後は、アグロ溶液が硬化する間に、胚を任意の向きに配置します。

作業完了後、イメージングチャンバーを反転させ、銅製のスリップが上面になるようにすることに留意してください。電動ステージを使用しており、複数の部位を一度にイメージングできる場合は、これらの手順を各胚に対して繰り返します。アガロースが完全に凝固するまで待ちます。

次に、リングに0.02% tri canine PTUリンガー液を満たします。最後に、リングの反対側に真空グリスを塗布し、ガラス板で覆います。

シールチャンバーを裏返します。これで、2光子励起顕微鏡によるイメージングの準備が整いました。イメージングを行うために、固定した胚を顕微鏡下のスライドホルダーに設置します。

40倍、開口数0.8の水浸対物レンズを用いて、1つの胚にフォーカスを合わせます。次に、レーザーをオンにします。レーザーの波長を910 nanometersに、出力を30 milliwattsに設定します。

イメージングソフトを起動します。本研究室では、Boar's Laboratory向けに開発された走査画像ソフトウェアを使用しています。この倍率で、切断対象となる候補軸索を探索します。

目的の軸索が見つかったら、その画像を撮影します。Z方向の最初と最後の位置をマークして画像を撮影し、Zスタックの最大強度投影（maximum projection）を作成します。次に、詳しく調べたい軸索の分枝を70倍に拡大します。

出力を180 milliwattsまで上げ、Zスライスの数を1に設定します。「grab」を押して、レーザーによるシングルスキャンを開始します。これにより軸索を切断するには十分なはずですが、使用する顕微鏡や実験目的 glove に合わせて、この手順を最適化する必要があります。

最後に、ズームアウトします。出力を30 milliwattsに下げ、切断したばかりの軸索の画像を撮影します。研究室にカスタムメイドの2光子顕微鏡がない場合は、Zeiss LSM 510共焦点2光子顕微鏡を使用して軸索を切断することも可能です。

まず、マウントした胚をステージ上に配置し、25x水浸対物レンズを用いてピントを合わせます。次に、マルチトラック設定で2光子レーザーとArgonneレーザーをオンにし、一方から他方へ切り替えられるようにします。どちらのレーザーもGFPの検出に使用されますが、2光子励起による放出は赤色で、Argonneレーザーによる放出は緑色で可視化されます。

これらを区別するために、Argonneレーザーを用いて、Z設定の下で追跡可能な軸索を特定します。最初と最後の光学切片をマークしてください。共焦点画像を取得し、Zスタックの最大投影図を作成します。

アルゴンレーザーをオフにし、透過率約9%の強度で2光子レーザースキャンをオンにします。軸索がまだ焦点内にあることを確認するため、停止ボタンをクリックしてクロップツールを使用できるようにします。クロップ機能を用いて、関心領域をズームアップします。

通常、約70倍までズームします。損傷させる軸索の領域を選択し、その領域に焦点を合わせます。ズーム倍率は「mode」タブで確認できます。

次に、「channels」タブで、2光子励起の強度を約9% transmissionから15～30% transmissionに変更します。新しい設定を有効にするには、「fast XY」ボタンをクリックし、その後すぐに「stop」をクリックしてください。過剰な損傷を避けるため、手順が正しく行われていれば、軸索が散在する破片として観察されるはずです。

最後に、軸索が確かに損傷していることを確認するため、488 nmのアルゴンレーザーに切り替えます。再度共焦点画像を取得し、軸索の最大投影（maximum projection）を作成します。以上で、2光子レーザー顕微鏡を用いて軸索を切断する2つの方法を示しましたが、次にZEISS LSM 510を用いた再生の共焦点タイムラプスイメージングについて見ていきましょう。

タイムラプス撮像の準備として、タイムラプス動画の設定を開始する少なくとも30分前には、加熱ステージの電源を入れておいてください。マウントした胚をスライドホルダーに載せ、顕微鏡下に配置します。希望する対物レンズを用いて、いずれか一つの胚に焦点を合わせます。

20x、開口数0.5の対物レンズを使用し、Zeiss LSM 510イメージングソフトウェアを起動して、適切なレーザーをオンにし、目的の構成を設定します。スキャンステージおよびマルチタイムウィンドウを開きます。マルチタイムソフトウェアを使用している場合は、マルチタイムウィンドウ内で最初の胚の位置と構成を定義してください。

スキャンウィンドウで高速スキャンを有効にし、ステージを目的のXY位置に移動させます。スキャンウィンドウで最初と最後のZ位置をマークします。スキャンウィンドウの停止ボタンを押し、続いて中間ボタンを押して、中央のZスライスのスキャンが完了するまで待ちます。

次に、ステージウィンドウのmark positionを押します。1つの胚のみをイメージングする場合は、マルチタイムウィンドウのsingle locationタブをクリックしてください。replace X, y, Zをクリックします。その後、save configurationをクリックしてください。

以前の設定を上書きするか尋ねられたら、「同意」を選択してください。これで、マルチLoウィンドウで画像取得のパラメータを設定できます。電動ステージを使用している場合は、複数の場所を設定して、複数の胚を撮影することが可能です。

この場合、最初の場所のX、Y、Zおよび構成を定義する前に、「multiple locations」タブを選択してください。また、「multiple locations」タブの直下にあるプルダウンメニューが「location one」になっており、構成セクションのプルダウンメニューが「multi lo one」になっていることを確認してください。「save configuration」をクリックする前に、マルチタイムウィンドウで残りの胚の位置と構成を定義してください。

次の胚プレス・ファストスキャンの位置を確認し、ステージを目的のXY位置に移動させ、スキャンウィンドウ内で最初と最後のZ位置を指定します。「stop」を押します。次に、同様にスキャンウィンドウ内で「mid」を押し、中央のZスライスのスキャンが完了するまで待ちます。

次に、「mark position」を押してください。ステージウィンドウで、「replace X, Y, Z」をクリックします。「multiple locations」タブの直下にあるプルダウンメニューが「location two」に設定されており、「configuration」セクションのプルダウンメニューが「multi lobe two」になっていることを確認してください。その後、「save configuration」をクリックします。同意を選択してください。前の構成を上書きするかどうかを問われた場合は、残りの胚に対してもこのプロセスを繰り返します。

マルチloウィンドウで画像取得のパラメータを設定します。ブロックセクションのリストからGR GLオプションを選択してください。次に、希望するグループ繰り返し回数を入力します。

これは、共焦点顕微鏡が各位置で画像を収集する回数です。パラメーターセクションに目的の待機間隔を入力してください。これは、1回のイメージング繰り返しの開始から次回の開始までの時間です。

設定セクションでZack XYを選択します。下部のセクションにベースファイル名を入力してください。「select image db」をクリックし、データベースを選択します。

オプションボタンをクリックし、一時ファイルを保存するためのMDBフォルダーを選択します。「最終画像をオープンに保持」にチェックを入れます。「最終画像を保存」を選択し、Zackの中央を選択して、重量間隔を指定します。

「OK」をクリックしてオプションウィンドウを閉じ、次に「開始時間」をクリックします。イメージングの間はマルチタイムウィンドウを開いたままにしてください。それでは、データの解析に移ります。

タイムラプス撮影が終了すると、Multi-Timeソフトウェアがすべての一次ファイルをコンパイルし、各測定地点のサマリーファイルを作成します。撮影の完了前に動画を停止したい場合は、必ず「stop」ではなく「finish」を押してください。これにより、サマリーファイルが正しく作成されます。

一時ファイルとサマリーファイルは、指定されたMDBフォルダに自動的に保存されます。以下は、受精後54時間における切断後のタイムラプス共焦点動画の代表的な例です。最初のフレームは切断前の軸索の背面図であり、黄色の矢印で次以降の切断部位を示しています。

タイムラプス動画は摘出後1時間以内に開始し、12時間継続させます。20分ごとに1つの共焦点スタックを収集しました。このタイムラプス共焦点動画は、受精後78時間における同一のパラメータを用いて記録されています。

最初のフレームは、軸索切断前の側面の図であり、黄色の矢印で切断部位を示しています。ここでは、2光子切断とタイムラプス共焦点イメージングを用いて、ゼブラフィッシュ胚の生体内で精密な組織損傷を発生させ、可視化する方法を説明しました。この手順を行う際は、過剰な損傷を避けるため、2光子レーザー切断に使用する出力を最適化することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。