Name: の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 学ぶ酵母細胞のマイクロマニピュレーション技術を用いた減数分裂遺伝子解析と二倍体接合子選択の方法。Saccharomyces cerevisiaeを用いて、精密な細胞操作と遺伝子型同定の手法を習得できます。

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筆者の研究室での作業は、保健研究のカナダの研究所、イノベーションのためのカナダ財団、自然科学と工学研究評議会とコンコルディア大学によって運営されている。

二倍体菌株の構築 交配による二倍体の生産のためのプロトコル<ol><li>必要に応じて、単一のコロニーを生成する場合、最初の株はYPD、または選択培地上で三振してください。 two半数体株は、逆の交配型（すなわち、MATAとMATα）でなければならない。 </li><li>無菌接種ループを使用しては、2つの半数体株の一つから、コロニーの小さな部分を選択。新しいYPDプレートストリークループ一回プレート間の直線の上に。プレートの底部上に矢印の付いた線の方向をマーク。 </li><li>同じYPDプレート上の2番目の歪みのためにこれを繰り返します。最初にこの時間は、ストリークコロニーの垂直を、第二の最初の連勝を横切る。第二ストリークの方向をマークと第二ストリークが最初に交差するエリアに注意してください。二倍体が生成される場所をこのエリアにはなります。 </li><li> 30℃で一晩YPDプレートをインキュベートする。 </li><li>レプリカプレートを選択新しく形成された二倍体の成長を許可する選択培地上にYPDプレート。 </li><li>単一のコロニーを生成するために、同じ選択培地上に単一コロニー可能であれば、または二倍体の縞と縞の小さな部分を選択してください。 </li></ol> ASCIの胞子形成と消化 プロトコル<ol><li>上記のプレートから単一コロニーをピックアップし、（1センチメートルX 1CM）胞子形成（SPO）プレート上にパッチを小さくすると胞子形成に3-7日のために30℃でインキュベートする。 </li><li>胞子形成を光学顕微鏡下でそれぞれのパッチからの細胞を見てチェックすることができます。水の5〜10μlので顕微鏡のスライド上の場所細胞は、液滴の上にカバースリップを置き、ASCIの存在を探します。 ASCIが簡単に見つからない場合は、インキュベーターに戻す。 </li><li>パッチのいずれかの効果的な胞子形成がある場合は、四分子​​ジュースの100μLを滅菌した15mlのコニカルチューブを準備する。 </li><li>滅菌3ミリメートル接種ループ（細胞がループの¼をカバーする必要があります）と四分子のジュースの代わりにこの胞子形成のパッチから細胞を採取する。優しくスワールループを細胞がソリューションとループとのミックスを落ちるようにする。 </li><li> 4 - 10分（ザイモリアーゼと歪み自体の濃度や活性に応じて）のために四分子ジュース（ザイモリアーゼを含む）に残す。これは、子のう胞子を周囲の細胞壁の消化を可能にする。 </li><li> YPDプレート上に接種領域の上部と下部をマーク。 </li><li>省略可能。反応物を氷冷滅菌のdH 2 Oを1mLのを加えることによって停止することができます細胞は5minsのために解決することができます。手で軽く混ぜ、氷上で維持して上清から1mLのを削除します。 </li><li>手順5から消化細胞の5μLを取り、そっと場所は、事前にマークYPDプレートの接種領域の行にドロップします。 </li><li>やっと寒天と接触しながら非常に軽くラインにドロップ1〜3回を広めるために滅菌3ミリメートル接種ループを使用してください。 </li><li>液体は寒天に吸収することを許可する（手順7が省略された場合、これは外側の細胞壁の消化が減少または停止される場合です）。解剖顕微鏡に進みます。 </li></ol> ASCIの解剖 プロトコル以下のプロトコルはシンガーMSMシステム200マイクロマニピュレーションの顕微鏡で説明されていることに注意してください。このようなツァイスマイクロマニピュレータのMRとして手動マイクロマニピュレーターを使用している場合、このプロトコルは、若干の修正を追跡することができる。 <ol><li>フィールドの半分は細胞が含まれており、半分が空であるプレートの領域に焦点を当てる。ゆっくりとそれはフィールドの空の領域に触れるように焦点に針をもたらす。これは、針が前回使用時の細胞が含まれていないことが保証されます。針と寒天との間の接触は、ゆっくりと焦点に入ってくる暗い黒い丸として見られている。 </li><li>位置A1に行列に移動し、再び寒天を貫通することでマークを付けます。これは、それが完了する前に顕微鏡をオフに実行された場合、プレートの向きを判断することです。 </li><li>検索モードに切り替えます。 ASCIを見つけます。好ましくは、細胞が十分に広がっている地域にあるASCIを選択してください。細胞のクラスターを持つ領域を避けてください。 ASCIから4子のう胞子はまだお互いに接続する必要があります。二つの子のう胞子は、他の二つよりも若干大きくなることがあります。 one子嚢胞子が緩いと子のう胞子の残りの部分に接続されていないASCIを避けます。 </li><li>針で子嚢を拾う。ゆっくりと板に針を持ち出す。マイクロニードルの影が見られる、ライ​​ン子嚢を持つこのアップがピックアップされる。円（針の先端）の黒の輪郭が見えるまで、再び針に近づく。このサークルで四分子をタッチしてからすぐに離れて針を引き抜きます。子嚢からすべての4つの子のう胞子が針に付着し、追加の細胞はこの子嚢の一部ではないマイクロニードルで収集されなかったことをしていることを確認します。 </li><li>遠く離れてプレートからマイクロニードルを引いて、マトリックス（最初の子嚢のため、に行くに行くA1の位置）。子嚢が再配置されるそれぞれの位置をメモしておいてください。マイクロニードルでプレートに触れるとすべての4つの子のう胞子は、マイクロニードルをオフに来るまで引いて、子嚢を下に置きます。ニードルアームまたはYPDプレートを保持しているプラ​​ットフォームの穏やかなタッピングは、この段階ではしばしば有用です。 </li><li> ASCIの希望数が選択されるまで、マトリックス上で連続した位置にステップ3-5と場所ASCIを繰り返します。 </li><li>各子嚢に戻って、ゆっくりとプラットフォームまたは両方の組み合わせをタップする、針でいじめが離れて4つのセルが壊れる。各子嚢の各子嚢胞子は、4つの行で区切られるまで、マトリックス内の新しい位置の背後にある一つを残して細胞を採取する。 </li><li> ° C成長パターンを観察するために数日間30℃インキュベーターでYPDプレートを置きます。 </li><li>選択培地にレプリカが板切除した細胞を必要に応じて。 </li></ol>接合体の移転 プロトコル<ol><li>単一のコロニーを得るために適切な媒体上の反対側の嵌合タイプを持つ2つの半数体系統外ストリーク。 </li><li>メイトこれら二つの菌株は、上述したように、4〜6時間（または一晩、必要に応じて）から成長することができます。 </li><li>光学顕微鏡下で受精卵を確認してください。受精卵は、芽の有無に関係なくどちらダンベル型のセルとして表示されます。 </li><li> 3ミリメートル接種ループ（細胞がループの¼をカバーしてください）で細胞をピックアップし、無菌のdH 2 Oの100μLにそっと置く</li><li> YPDプレート上に接種領域の上部と下部をマーク。 </li><li> 5μL取ると優しく場所は、事前にマークしたYPDプレートの接種領域の行にドロップします。 </li><li>やっと寒天と接触しながら非常にゆっくりとラインの低下を広めるために3ミリメートル接種ループを使用してください。 </li><li>液体は寒天に吸収することができます。解剖顕微鏡に進みます。 </li><li>フィールドの半分は細胞が含まれており、半分が空であるプレートの領域に焦点を当てる。ゆっくりとそれはフィールドの空の領域に触れるように焦点に針をもたらす。これは、針が前回使用時の細胞が含まれていないことが保証されます。針と寒天との間の接触は、ゆっくりと焦点に入ってくる暗い黒い丸として見られている。 </li><li>位置A1に行列に移動し、再び寒天を貫通することでマークを付けます。これは、それが完了する前に顕微鏡をオフに実行された場合、プレートの向きを判断することです。 </li><li>検索モードに切り替えます。受精卵を見つけます。 </li><li>針との接合子を拾う。 </li><li>場所は、行列に個別に受精卵。 </li><li>受精卵が数日間に成長することができます。 </li><li>適切な選択培地上にレプリカプレートは受精卵。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> 図1：反対の交配型の二つの半数体株の交配は、二倍体株を生成します。 <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> 図2：温度感受性株（LEU2栄養要求性を持つ）と野生型株（LEU2）との間の交配のTHRE結果（A）YPDプレート。消化細胞は、2つの黒線の間に厚さ成長が見られている左側の接種地域に広がっている。解剖されているASCIは、均等に、右側の行列には等間隔育つ。 （B）（A）のプレートは、SD -ロイシンドロップアウトプレート上に複製されました。検証子嚢胞子が解剖されたことを示すLEU2マーカーの午前2時02分成長に注意してください。 （C）（A）のプレートは、YPDプレート上に複製され、37℃でインキュベートした。さらに子嚢胞子が解剖されたことを検証する2：02の成長に注意してください。

<ol><li>Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

酵母の解離は、目的のマーカーを使用して新しい株を選択すると便利なツールです。 four子のう胞子の理論的な成長パターンを決定する際には、栄養細胞の遺伝子型を調べることが重要です。プラスミドが存在する場合、これは子嚢胞子（s）はプラスミドを受信し、操作している菌株について予測し、結論に影響を及ぼすとなる影響を与えるとして、それは、単一のローまたはハイコピーである場合は、1つは知っている必要があります。 特定の株が短期間に多数の子のう胞子を生産する他のものよりも良い胞子を形成することができます。他の株は、子のう胞子の低い割合をもたらす可能性があります。これは、十分な真のASCIを選択することができる限り、実験に影響することはありません。また、株は細胞壁の消化中に異なる反応を示すと、それは経験的に四分子ジュースのインキュベーション時間を調整する必要があります。 目的のマーカーを持つ細胞を選択する場合は、1つは、すべての子のう胞子の成長パターンは、理論的な成長パターンに対応する子嚢からとすべての子のう胞子の大部分は、予想される成長パタ...

<table><tbody><tr><td>Singer MSM System 200</td><td>顕微鏡</td><td>Singer Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-ソルビトール</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>SOR508</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001</td><td></td></tr><tr><td>ザイモリアーゼ 100T</td><td>試薬</td><td>生化学工業</td><td>120493</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>PEP 403</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>酵母窒素源 (Yeast nitrogen base)</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Bio-トリプトン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>POA 301</td><td></td></tr><tr><td>アガー</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アデニン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-ウラシル</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>URA 241</td><td></td></tr><tr><td>L-トリプトファン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP 100</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS 200</td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン</td><td>試薬</td><td>Amresco</td><td>0877-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>MET 222</td><td></td></tr><tr><td>L-チロシン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR 333</td><td></td></tr><tr><td>L-イソロイシン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO 910</td><td></td></tr><tr><td>L-バリン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL 201</td><td></td></tr><tr><td>L-リシン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS 101</td><td></td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA 302</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU 202</td><td></td></tr><tr><td>L-トレオニン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>試薬</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU 222</td><td></td></tr></tbody></table>

の解剖サッカロマイセスセレビシエ asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

酵母は、多くの異なる細胞プロセスを研究するために使用される非常に扱いやすいモデル系である。共通の実験室株<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;一倍体または二倍体の状態のいずれかに存在する。 two半数体から対立遺伝子を組み合わせることができるし、ゲノムへの変更を導入する能力は、ASCIの生産と解剖が必要になります。半数体細胞からのASCIの生産は二倍体株を生成するために互換性のある交配型を持つ2つの酵母の一倍体株の交配から始まります。これは、固体培地上または液体のいずれかのいくつかの方法で行うことができます。それは選択的に半数体株のどちらに比べて彼らの成長を促進する培地で二倍体のために選択することが有利である。二倍体は、ASCI、二倍体の減数分裂生殖から生じる4倍体の娘細胞の束を形成するために栄養の乏しい培地で胞子形成するために許可されています。栄養細胞とASCIの混合物を次いで、ASCIの子のう胞子を包む膜の嚢を離れて消化する酵素のザイモリアーゼで扱われます。一個ASCIを拾う四ascoporesを分離して再配置できます解剖顕微鏡下でマイクロニードルでマイクロマニピュレーションを使用する。解剖ASCIは、数日間増殖し、適切な選択培地にレプリカプレーティングによって興味のマーカーまたは対立遺伝子のためにテストされています。

酵母細胞のマニピュレーションは、減数分裂の遺伝学的分析のために必要とされるか、二倍体の受精卵を選択する。これらmicromanipulationsは、解剖顕微鏡のマイクロニードルを用いて実施されています。マイクロニードルは、細胞を再配置するために使用され、自動化の様々な程度で使用可能なマニピュレータによって制御されます。

の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

酵母は、多くの異なる細胞プロセスを研究するために用いられる、非常に扱いやすいモデルシステムである。一般的な研究用株であるSaccharomyces cerevisiaeは...

この手順は、遺伝的に異なる2つの接合型酵母細胞の交配から始まります。二倍体のみが成長可能な培地へのレプリカプレート法によって、二倍体を選別します。その後、二倍体を胞子形成プレートにパッチし、ascus（嚢）を形成させます。子嚢を解剖し、ハプロイドをプレート上の規定の位置に配置します。得られたハプロイドが視認可能なコロニーまで成長した後、選択培地でレプリケーションを行い、個々の細胞の遺伝子型を特定します。こんにちは、エイドリアン・モリスです。私はAudrey Maheです。私たちはモントリオールのコンコルディア大学にあるMichael Satcher博士の研究室に所属しています。本日は、一般にraと呼ばれる酵母の細胞の解剖手順についてご紹介します。この手順を当研究室で用い、新規ジェノタイプを持つハプロ D 株を導入し、2つの変異を組み合わせた際の影響を検討します。それでは開始しましょう。二倍体株を構築するために、異なる接合型の2つのハプロ株を交配させます。まず、ハプロ株を適切な培地（本件では YPD）でストリークし、単一コロニーを形成させます。滅菌済みの白金線を用い、2つのハプロ株のうち一方のコロニーの一部を少量採取し、新しい YPD プレート上でストリークします。プレート上に直線的に塗布した後、プレートの底面に矢印でストリークの方向を記入します。次に、同じYPDプレート上のもう一方のハプロイド株からコロニーの一部を少量採取します。最初の株に対して垂直にストリークを行い、1回目のストリークに交差するように2回目のストリークの方向を記入します。そして、2回目のストリーキングが1回目と交差する領域に注目してください。この領域から二倍体が生成されます。YPDプレートを30°Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、YPDプレートから、新たに形成された二倍体を特異的に増殖させる選択培地へレプリカプレートを作成します。プレートを30°Cで一晩インキュベートします。二倍体がプレート上で生育したら、可能であれば単一コロニーを、あるいは二倍体ストリークのごく一部を採取し、同一の選択培地でストリークして単一コロニーを形成させます。二倍体株が得られたら、単一コロニーをピックアップし、胞子形成プレートに少量ずつパッチします。30 °Cで3〜7日間培養し、胞子形成を誘導します。胞子形成を確認するために、各パッチの細胞を光学顕微鏡で観察します。5〜10 µLの水を用いて細胞を顕微鏡スライドに載せます。ドロップレットの上にカバーガラスを載せ、子嚢の有無を確認します。子嚢が見当たらないか、容易に見つからない場合は、プレートをインキュベーターに戻します。いずれかのパッチで効果的な胞子形成が認められたら、100 µLのtetra juiceを入れた滅菌済みの15 mLコニカルチューブを用意します。滅菌した3 mmの白金線を用いて、この胞子形成パッチから細胞を採取し、テトラッドジュースに入れます。白金線をゆっくりと回して細胞を落とし、溶液と混ぜ合わせます。細胞をテトラッドジュースに4～10分間静置します。これにより、ASCO胞子を囲む細胞壁を消化することができます。子嚢の解剖用のプレートを準備するために、YPDプレートの接種領域の上下に印を付けます。細胞が十分に消化されたら、消化した細胞を5 µL取り、滅菌した3 mmの接種ループを用いて、あらかじめ印を付けたYPDプレートの接種領域に滴状に一列に静かに配置します。オーガにわずかに接触させる程度に、液滴を1〜3回、慎重に沿って広げます。液体をオーガに吸収させてください。これで、子嚢の解剖を開始する準備が整いました。子嚢の解剖を開始するには、解剖プレートをsinger MSM system 200マイクロマニピュレーション顕微鏡の下に配置します。視野の半分に細胞が含まれ、もう半分が空白であるプレートの領域に焦点を合わせます。ニードルが視野の空白領域に接するように、ゆっくりとピントを合わせます。針とアガールの接触面は、徐々にピントが合う暗い黒色の円として観察されます。針がアガールに接触した後、少し引き戻し、針が触れた領域に細胞が沈着していないかを確認してください。これにより、前回の使用による細胞が針に残っていないことを確認できます。マトリクスの位置A1に移動し、オーガで穴を開けて印を付けます。これも同様に、プレートの向きを判断するために行うものです。外れている場合は、解剖前の準備が完了しています。検索モードに切り替えます。子嚢を探します。1つの子嚢に含まれる4つの子嚢胞子は、まだ互いに付着したままであるはずです。2つのASCUS胞子は、他の2つよりもわずかに大きい場合があります。1つのASCA胞子が離れており、他のASCA胞子と繋がっていない子嚢は避けてください。子嚢を採取するには、ニードルをゆっくりとプレートに近づけます。マイクロニードルの影が見えたら、採取したい子嚢に合わせて調整します。黒い円形の輪郭が見えるまでニードルを移動させます。この円で四分子に触れさせ、すぐにニードルを引き離します。子嚢から放出された4つの胞子すべてが針に付着しており、この子嚢に含まれない他の細胞がマイクロニードルに採取されていないことを確認してください。マイクロニードルで子嚢を採取したら、プレートから十分に離してマトリックスへ移動します。1つ目の子嚢は、位置a1へ移動させてください。マイクロニードルでプレートに触れ、4つのaskus胞子がすべてマイクロニードルから離れるまで引き離して、askusを配置します。この段階では、ニードルアームまたはYPDプレートを保持しているプラットフォームを軽く叩くと効果的です。目的の数の子嚢（asci）が得られるまで、マトリックス上の連続した位置から子嚢を順次特定し、ピックアップして配置します。ASCUSを移動させた各位置を記録してください。目的の数の子嚢をピックアップした後、それぞれの子嚢に戻り、針でほぐす、プラットフォームを軽く叩く、あるいはその両方を組み合わせて、4つの細胞を分離させます。細胞を1つ残して回収します。残りの細胞を移送します。マトリックスの新しい位置にEを配置し、それぞれが完了するまで繰り返します。各アスクスのAPOを4列に分離します。アスクスの解剖を1回完了させます。YPDプレートを30 °Cのインキュベーターに数日間置き、成長パターンを観察します。解剖した子嚢が成長したら、レプリカプレート法で選択培地に転写します。必要に応じて、レプリカプレートへの転写を行い、元の解剖用プレートと選択培地プレートの両方を一晩培養します。選択培地プレートで得られた結果を判定し、適切なハプロ細胞を特定して選択してください。選択培地で二倍体を識別できない場合は、接合後の早期段階で容易に識別できる、接合した半数体（接合子）を手動で選択する必要があります。半数体細胞の調製および接合の手順は前述のものと同一ですが、二倍体が出現すると予想される領域を、30 °Cでより短い時間インキュベートした後に観察します。4〜6時間が目安として適切ですが、最終的な時間は経験的に決定する必要があります。光学顕微鏡下で接合子を確認します。接合子は、出芽の有無にかかわらずダンベル状の細胞として観察されます。3 mmの白金線を用いて細胞を回収し、100 µLの滅菌水に静かに加えます。細胞をあらかじめ印を付けたYPDプレートに移した後、3 mmの白金線を使用して、培地表面にわずかに触れる程度で液滴を非常に静かに直線状に塗り広げます。液体が培地に吸収されるまで待ちます。解剖顕微鏡に移動します。視野の半分に細胞があり、もう半分が空いている領域に焦点を合わせます。ニードルが視野の空いている領域に接するように、ゆっくりとピントを合わせます。既報の通りに行う。ニードルに前回の使用時の細胞が残っていないことを確認する。位置A1のマトリックスへ移動し、オーガーで穿刺してマークを付ける。プレートの向きを再度確認します。検索モードに切り替え、接合子を探します。ニードルで接合子をピックアップします。接合子は個別にマトリックス上に配置します。接合子を数日間培養します。二倍体細胞を胞子形成プレートにパッチし、パート3の手順に従って進めます。反対の接合型の2つの半数体株を接合させることで、二倍体株が生成されます。このYPDプレートは、lu 2 ox 萎縮を持つ温度感受性株と野生型株の接合結果を示しています。消化された菌株は、左側の接種領域に塗布されており、2本の黒線の間に濃厚な増殖が見られます。解剖された子嚢胞子は、右側のマトリックス上に等間隔に増殖しています。このYPDプレートをSDロイシン欠乏プレートにレプリケートしたところ、LU2マーカーについて2対2の増殖が見られ、有効なASCO胞子が解剖されたことが示されました。元のYPDプレートは別のYPDプレートにもレプリケートされ、より高い温度である37 °Cで培養されました。そこでの2対2の増殖により、ASCO胞子が解剖されたことがさらに検証されました。ハイブリッド細胞（haid cells）を2種類作成し、二倍体を精選する方法を説明しました。これは2つの異なる手法に基づいており、一方は栄養要求性マーカーを用い、もう一方は細胞形態に基づいています。この手順を用いる際は、栄養要求性マーカーが予測通りに現れているか、四分法（tetra dissection）を用いて新しく構築されたハイブリッド細胞を精選することが極めて重要です。また、消化しすぎたり、不十分な消化になったりしないように注意することが重要です。消化しすぎると、四分胞子（tetrads）がまとまったままでいられなくなり、逆に消化が不十分な場合は、四分胞子の状態で分離させることが困難になります。以上で説明を終わります。実験の成功をお祈りいたします。

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