Name: 計測線虫（Caenorhabditis elegans）寿命 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 学ぶ C. elegansの固体培地上での寿命測定法。同期化した成虫をUV殺菌した大腸菌で飼育し、2〜3日ごとに生死を記録する。老化遺伝学研究に有用な標準プロトコルです。

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この作業は、老年学の賞とNIHグラントMKGSへ1R01AG031108 - 01 NIH訓練助成金P30AG013280でサポートされているのグレン/遠くブレークスルーによってサポートされていました。 MKは、高齢化のエリソン医学財団新奨学生です。

パート1：準備線虫の増殖培地（NGM）プレートこのセクションでは、寿命の実験のための固体NGMプレートの準備について説明します。アンピシリン（アンプ）とNGMに追加fluorodeoxyuridine（FUDR）の両方を持っていない添加物、およびアンプ/ FUDRプレートが含まれていては標準のNGMプレート、：基本的な寿命の実験では、プレートの2つのタイプが必要です。アンピシリンは、外国の細菌汚染を防ぐために使用されます。 FUDRは、細胞分裂を阻害卵の生産が減少し、孵化から卵を防ぎます。長寿の分析のためのFUDRの使用は、成人の寿命に影響を与えると成長する幼虫からそれらを分離するために数日ごとにワームを転送する必要がなくなりますしていません。プレートの両方のタイプがEでシードされていますその後、紫外線への曝露によって殺されている大腸菌 OP50細菌、。 <ol><li> NGM（レシピとストレージノート用のセクション5を参照）とラベルのペトリ皿を準備します。あなたは、NGMの10 mLの当たり1 60ミリメートルのペトリ皿が必要に​​なります。以前に調製した固体NGMで開始している場合は、1.2に進みます。あなたが新鮮なオートクレーブNGMで開始している場合は、1.4に進みます。 </li><li>完全に30秒のパルスに高い上に電子レンジで固体NGMを溶かす。構築から加圧ガスの気泡を防ぐために、パルス間の渦巻のメディア。 </li><li> 55 ° Cの水浴中または冷却するためにベンチの上に置いて液体NGM。 </li><li>一度NGMは55に達する℃〜150 mMのFUDRの33μLを追加し、100mLのNGM（アンプ/ FUDRプレート用）と渦巻きは100 mg / mLのアンピシリンを100μLミックスする。追加の薬剤を使わずにNGMプレートは1.5に直接進む。 </li><li>各60ミリメートルのペトリ皿に無菌操作、ピペット10mLのNGMを使用。可能であれば気泡を形成することは避けてください。泡はフォームをすれば、それらはピペットチップを使用してポップすることができます。 </li><li> NGMが固化し、乾燥させるためにふたでベンチでプレートを残す。可能であれば、細菌を追加する前に2日間ベンチでプレートを残すが、プレートがより早く必要とされる場合は、1日に動作します。 </li><li>当日のプレートはE.の新鮮な縞から単一コロニーを、乾燥、種子の液体LB培地を終了する前にLB寒天培地上で大腸菌 OP50細菌を。あなたは、60 mmのプレートあたり一晩OP50文化の少なくとも1 mLを準備する必要があります。 </li><li>場所OP50 37文化℃のシェーカーと細菌は（文化が飽和状態に達するはずです）一晩増殖することができます。 </li><li> 10分3,500 gで回転させてペレットOP50細菌。 </li><li>文化が10倍集中して上清を再懸濁します細菌の90％を削除します。 </li><li>固化NGMプレートの中央に10倍濃縮OP50文化の100μL添加します。優しくスワールプレート、必要に応じて細菌の文化を広げるために（理想的に細菌が板壁の近くに来ることなく、NGMの中心的なエリアをカバーしてください）​​。メディアの表面に欠陥がNGMに巣穴にワームを可能として、NGMの表面にピペットチップを触れないようにしてみてください。 </li><li>細菌の培養は固体NGM（通常は約24時間かかります）で乾燥させるため一晩ベンチ上でプレートを残す。 </li><li>一度乾燥、細菌の増殖を阻止するのに十分な紫外線量にプレートの表面を露出。あなたは、ストラタジーン社製のUV Stratalinker 2400を使用している場合： <ul><li> Stratalinkerにプレートを置き、蓋を取り除く</li><li>ドアを閉めて、Stratalinkerをオンに</li><li>プレス"エネルギー" </li><li> '9999'はキーパッドを使用して入力してください</li><li>プレス"スタート" </li><li>プレートは、約5分間紫外線にさらされる</li></ul></li><li> UV -死菌したプレートは、° Cまでの1ヶ月間4℃逆さまに保存することができます。 </li></ol>パート2：動物の年齢、同期の人口を獲得するために敷設タイミン​​グ卵を実行するこのセクションでは、一般的なハッチ、日付とワームの人口を生成する。これは、生殖アクティブな大人が定義された期間についてはプレート上に卵をできるようにすると、それらの卵を開発することによって実現されます。 <ol><li> （オプション）FUDRせず、新鮮なNGMプレートに約20の若い成虫を転送します。ワームは、細菌性のすべてを通って伝播し、食べることを可能にするために25℃でプレートにしておきます。細菌の食品が消費された後に孵化したワームは、dauer段階成長停止が入力されます。あなたが最初にプレートに転送する方法多くのワームに応じて、週間以内に周りdauer幼虫を見て開始されます。 Dauerの幼虫は、最大1ヶ月間次のステップに使用することができます。 </li><li> FUDRのない新鮮なNGMプレート（任意）転送20〜30 dauer幼虫。食品dauer幼虫の存在下で2日以内に生殖アクティブな大人になると25℃で、その後数日間、生殖アクティブのまま℃に</li><li> FUDRのない新鮮なNGMプレートに10〜15生殖アクティブな大人を転送します。このプレートは、時限の産卵（TEL）プレートと呼ばれます。 </li><li> ℃で6時間tを可能にするために25℃TELプレートを残す彼はワーム産卵のために時間を。 </li><li> TELプレートから成虫を削除します。プレートは、視覚的に大人を削除する前に、卵の検査を行うことができます。ワームは、卵の十分な数を配置していない場合はTELプレートは、成虫を削除する前に24時間の合計に、最大で25 ° Cで残すことができます。 </li><li> 20℃の場所TELプレート° Cの卵が孵化しているとワームはL4幼虫期（これは通常、野生型線虫C. elegansのために2日かかりますが、遅い開発の表現型を有する株のために長い時間がかかることができる）するために開発されるまで。 </li></ol>パート3：寿命のためのスコアの動物彼らは死ぬまでこのセクションでは、パート2からのワームの年齢同期人口に従ってください。ワームは、卵の生産と細菌汚染を防ぐためにアンプ/ FUDRプレート上で維持され、それらが外部刺激に応答しなかったときに死んだと見なされます。 <ol><li>シードアンプ/ FUDRプレートにL4幼虫を移す。テスト対象の各菌株または条件の場合は、それがプレート25〜30ワームを2〜3プレートを設定するのが一般的です。 C.の画像虫のライフステージは、基準（図1）のために用意されています1。 </li><li> 20位のアンプ/ FUDRプレート℃で24時間。 </li><li> 24時間後、視覚的にワーム、メディア、および細菌を評価する。次のいずれかが観察されている場合、新鮮なアンプ/ FUDRプレートにワームを転送します。 <ul><li>ワームは、細菌性のほとんどを食べている。早期寿命の実験のワームの1〜2回の枯渇から細菌を防ぐために週を転送する必要があります。 </li><li>幼虫のかなりの数が存在する。これは通常、ワームは、若年成人の代わりにL4sとしてアンプ/ FUDRプレートに移され、FUDRが発効する前にいくつかの卵を産むことができたていたことを示しています。 FUDRは、一般的に完全な大人に成長してから幼虫を防止しますが、時折少しは大人に成長すると実験動物と混同になります。 </li><li>ライブ/増殖する細菌が観察されています。一般的に、アンプとUV -殺害の組み合わせは生菌は、実験を汚染しないことが保証されますが、時折それが発生します。 </li><li>真菌の増殖は、メディア上に観察される。早期に十分なキャッチした場合、真菌の増殖は通常、ピペットチップやスパチュラを用いて切り取ることができます。一度それは新しいプレートにワームを転送する方が簡単です、直径数ミリメートルより大きくなるように成長する。 </li><li>解剖スコープを使用して、それぞれのワームが生きているのか死んでいるかどうかを決定する。 </li><li>静かにプレートをタップします。それがタップに反応して移動する場合、ワームは生きている。 </li><li>ワームは、頭部領域でのプレート、ズームをタップに応答していない場合。 </li><li>ゆっくりとプラチナの転送ピックとワームの頭をタップします。それが頭を動かすことによって応答しない場合、死んだとしてワームのスコアを獲得。 </li><li>デッドワームは、プレートから除去することができます。 </li></ul></li><li>生きていると死んでいる日付とワームの数を記録。 </li><li> 20℃にプレートを返す</li><li>すべてのワームが死亡するまで繰り返しては、3.3から3.6まで2〜3日おきに繰り返します。 </li></ol>パート4：代表的な結果。 線虫の寿命実験によって生成された生データは、試験した各菌株のための生きていると死んでいるワームの対応する数値と日付のリストです。それぞれの日に死ぬワームの数は通常、生存曲線（図2Bのようにグラフィカルにプロットされている毎日で生きているワームの割合（図2A）を、計算するために反転され、時限産卵の日を0日とみなされます）。研究では個々のワームの寿命は、それぞれの日に死ぬワームの数から計算し、系統間の比較のために平均値と中央値の寿命を計算するために使用することができます。それぞれの日に生きているワームの数のカウントは、寿命の解析に直接使用されません。固体培地上で維持ワームは、時折"逃げる"、またはメディアの下にプレート上下の壁の上のどちらかクロールされます。それぞれの日に生きているワームの数は、どのように多くのワームは、実験の過程を通して逃げたかを判断するために使用することができます。逃げるワームは、通常は分析から削除されます。 N2、Cのベンチマークとして、典型的な中央値の寿命20℃でUV -死菌で維持虫野生型株、° Cは、卵から測定された約25日です。 パート5：ソリューション<table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 線虫の増殖培地（NGM）、100mLの： </td></tr><tr><td colspan="2">組み合わせる： </td></tr><tr><td> 0.3グラム</td><td> NaClの</td></tr><tr><td> 0.25グラム</td><td>ペプトン</td></tr><tr><td> 2グラム</td><td>寒天</td></tr><tr><td colspan="2"> 40分間オートクレーブし、℃で、[追加]を55に冷ます。 </td></tr><tr><td> 100μL </td><td> 1 M MgSO 4を </td></tr><tr><td> 100μL </td><td> 5 mg / mLのコレステロール</td></tr><tr><td> 100μL </td><td> 1 M塩化カルシウム2 </td></tr><tr><td> 1.625 mLの</td><td> 1.5 M KPI液pH6.0 </td></tr><tr><td colspan="2">液体NGMは、室温でプレートを注いですぐに使用したり、固化させ、長期的に保存することができます</td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> ルリアブロス（LB）、1L： </td></tr><tr><td> 10グラム</td><td>リプトン</td></tr><tr><td> 5グラム</td><td>酵母エキス</td></tr><tr><td> 10グラム</td><td> NaClの</td></tr><tr><td> 10mLの</td><td> 1 MトリスpH8.0 </td></tr><tr><td> 1 L </td><td>脱イオン水</td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ、室温で保管。 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M MgSO 4を 、300mLの： </td></tr><tr><td> 73.95グラム</td><td> MgSO 4を </td></tr><tr><td> 300 mLの</td><td>脱イオン水</td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ、室温で保管。 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 5 mg / mLのコレステロール、200mLの： </td></tr><tr><td> 1グラム</td><td>コレステロール</td></tr><tr><td> 200 mLの</td><td> 100％エタノール</td></tr><tr><td colspan="2">滅菌濾過し、室温で保管してください。 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M CaCl 2を 、500mLの： </td></tr><tr><td> 27.75グラム</td><td> CaCl 2の </td></tr><tr><td> 500 mLの</td><td>脱イオン水</td></tr><tr><td colspan="2">滅菌濾過し、室温で保管してください。 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1.5 M KPI液pH6.0、1L： </td></tr><tr><td colspan="2">組み合わせる： </td></tr><tr><td> 31.4グラム</td><td> KPI二塩基</td></tr><tr><td> 179.6グラム</td><td> KPI一塩基</td></tr><tr><td> 850 mLの</td><td>脱イオン水</td></tr><tr><td colspan="2">熱KPIは、溶液中に溶解できるように混合しながら。 10 N NaOHでpHを6.0に調整する。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 1リットルに脱イオン水を追加します。 </td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ、室温で保管。 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 Mトリス、pH 8.0： </td></tr><tr><td> 60.57グラム</td><td>トリス</td></tr><tr><td> 400mLの</td><td>脱イオン水</td></tr><tr><td colspan="2"> HClでpHを8.0に調整する。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 500mLの脱イオン水を追加。 </td></tr><tr><td colspan="2">滅菌濾過し、室温で保管してください。 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 150mMのFluorodeoxyuridine（FUDR）、10 mLの： </td></tr><tr><td> 0.3693グラム</td><td> FUDR </td></tr><tr><td> 10mLの</td><td>滅菌脱イオン水</td></tr><tr><td colspan="2"> -20℃で保存</td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 100 mg / mLのアンピシリン（アンペア）、10 mLの： </td></tr><tr><td> 1グラム</td><td>アンピシリン</td></tr><tr><td> 10mLの</td><td>滅菌脱イオン水</td></tr><tr><td colspan="2"> -20℃で保存</td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 50 mg / mLのカルベニシリン（炭水化物）、10 mLの： </td></tr><tr><td> 500mgの</td><td>カルベニシリン</td></tr><tr><td> 10mLの</td><td>滅菌脱イオン水</td></tr><tr><td colspan="2"> -20℃で保存</td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 Mイソプロピルβ- D -チオガラクトピラノシド（IPTG）、10 mLの： </td></tr><tr><td> 2.38グラム</td><td> IPTG </td></tr><tr><td> 10mLの</td><td>滅菌脱イオン水</td></tr><tr><td colspan="2"> -20℃で保存</td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%201.png" alt="図1"> 図1℃の明視野像は、卵を含む虫のライフステージ、4つの幼虫（L1 - L4）、および成人。すべてのパネルには、成人男性を（ウッド（1988）からイメージ）を示している、右下を除いて雌雄同体を示す。 <img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%202.png" alt="図2"> 図2℃から代表的な結果DAF - 2遺伝子の突然変異を含む株に野生型株のN2を比較線虫の寿命実験。ワームは、卵、それぞれの日に観測された死者ワームの数、およびそれぞれの日に生きている残りの元のサンプルの割合（のような死者のワームの1日あたりの数から計算）のころからの日数を含めて、収集したデータを示す（A）表。 （B）の生存率は（）で提供される寿命のデータに対応する曲線。 <imgsrc files></imgsrc> 図3。若年者と高齢成人のCとの間のリポフスチンの代表比較エレガンス 。明視野イメージは、右上、左およびDAPIチャンネル蛍光画像に表示されています。トップパネルは、4日目のワームや下のパネルが11日、古いワームを（のような卵から測定）売主。

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</ol>

長寿の遺伝的制御は 、Cで広く研究されている寿命を決定することができる容易さと速さが主な原因虫 、。この記事に記載されているプロトコルは、Cの再現性の寿命のデータを取得するための基本的な枠組みを説明しエレガンスとはrelatednematodeの種にも適用できます。2は 、これらの手順は、さまざまな条件下での寿命を測定するために適合させることができるいくつかの簡単な変更を行うことで。ここでは、RNA干渉（RNAi）、細菌の欠乏による食事制限、および薬物のないNGM、生菌を含むいくつかの一般的なバリエーションを、説明します。 おそらく、このプロトコルの最も一般的なバリエーションは、生菌でワームのメンテナンスです。これは、いくつかのマイナーな変更を加えることによって達成することができます。最初に、細菌（1.13までのステップ1.7）でプレートをシードするための手順を変更。代わりに飽和するOP50の文化を育てると、200μLの培養液から直接プレートに中期対数増殖期とピペットに成長する。細菌は一晩...

<table><tbody><tr><td>アガー</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>試薬</td><td>MidSci</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>BactoTryptone</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3 (211705)</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9699248 (1332-01)</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>試薬</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>フルオロデオキシウリジン (FUDR)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &amp;#946;-d-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>試薬</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C5</td><td></td></tr><tr><td>KPi 二塩基塩</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087862 (3252-01)</td><td></td></tr><tr><td>KPi 一塩基塩</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087861 (3246-01)</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9561800 (2500-01)</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>S251</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr></tbody></table>

計測線虫（caenorhabditis elegans）</em固体培地上>寿命

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

老化は細胞成分と死亡率をもたらす細胞内小器官の進行性の悪化によって特徴付け変性過程です。線虫<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;老化の生物学を研究するために使用される主なモデルとして登場しました。事実上すべての生物学的なサブシステムは、加齢に伴って機能低下を起こしているので老化の合計率を考慮した場合、寿命は、関心の主要エンドポイントです。線虫では、寿命は一般的に動物が外部刺激に応答残る日数として定義されます。線虫は、液体培地で、プレートの固体培地上でいずれかを伝達することができます、そしてテクニックは、両方の条件下での寿命を測定するために開発されている。ここでは、固体の線虫の増殖培地上で維持線虫の寿命を測定するための一般的なプロトコルを提示し、UV -死菌の飼料を与えた。これらの手順は、簡単に、生菌、食事制限、およびRNA干渉で構成される食事療法を含め、様々な一般的な条件下でアッセイの寿命に適合させることができます。

この記事では、UV殺菌細菌食品を固体培地上で維持線虫の寿命を測定するための一般的なプロトコルを提示する。

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em固体培地上>寿命

老化とは、細胞成分やオルガネラの漸進的な機能低下によって特徴づけられる退行性プロセスであり、最終的に死に至るものである。線虫の...

C. elegansの寿命を測定するために、タイミングを合わせた卵産出により、年齢が同期した集団を作成します。活性のある成体雌雄同体虫を、UV殺菌したE. coliを播種したnematode growth media（NGM）プレートに移動させ、6〜8時間卵を産ませた後、次の2日間にわたって虫を除去します。これらの卵から虫が孵化し、L4幼虫期まで成長します。L4虫を、生菌による汚染を防ぐためのampicillinおよび生殖を防ぐためのFUDRを含む新しいNGMプレートに移動させ、成体に成長させます。ここから、すべての虫が死ぬまで、2〜3日ごとに成虫を観察します。各時点で、死んだ虫をプレートから取り除き、生存数と死亡数を記録します。私はワシントン大学病理学部のMatt Capline研究室のGeorge Setonです。本日は、寿命の測定方法と、それを用いたC. elegansの観察について解説します。当研究室では、老化の遺伝学を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。基本的な寿命実験には、添加物を一切含まない標準的なNGMプレートと、NGMにアンピシリンとフルオロデオキシウリジンを添加したAMP FUDRプレートの2種類のプレートが必要です。どちらのプレートにも大腸菌OP 50を播種し、その後、UV照射によって殺菌します。まず、10 mLのNGM溶液を調製することから始めてください。60 mmペトリ皿1枚につき、固形のNGMを電子レンジの高出力設定で32秒ずつのパルス状に加熱し、完全に溶解させます。加圧による気泡の蓄積を防ぐため、パルスの間に培地を揺らしてください。液状になったNGMを55 °Cの水槽に入れるか、またはベンチ上に置いて冷却させます。培地が55 °Cまで冷却し、ガラス容器を素手で無理なく持てるようになった時点で、薬剤を添加する準備が整ったことになります。薬剤添加プレートを調製する場合、100 mLのNGMに対し、150 mM FUDRを33 µL、および100 mg/mL Ampicillinを100 µL加え、混ぜ合わせるために旋回させます。Ampicillinは外来細菌の混入を防ぐためであり、FUDRは卵の孵化を防ぐために使用されます。これにより、成長した幼虫から分離するために数日ごとに線虫を移し替える必要がなくなります。次に培地を注ぎ、プレートをベンチ上で2日間乾燥させます。プレートの乾燥が完了する前日に、LBアガー上の新鮮なストリークから単一のE. coli OP50コロニーを用いて液体LB培養を行います。60 mmプレート1枚あたり、少なくとも0.5 mLの培養液を準備してください。OP 50培養液を37 °Cのシェーカーに入れ、一晩培養します。翌日、3,500 gの遠心力で10分間遠心分離し、OP 50細菌をペレット化します。上清を適切にデカンテーションし、細菌を10倍濃度で再懸濁します。次に、各プレートに濃縮培養液を100 µLずつ接種します。NGMの表面に欠陥があると線虫が潜り込んでしまうため、ピペットチップがNGMの表面に触れないように注意してください。細菌がプレートの壁に近づかず、NGMの中央領域を覆うまでプレートを回し、その後、ベンチ上で24時間乾燥させます。乾燥後、細菌の増殖を停止させるのに十分な強度のUV線量をプレート表面に照射します。本手法では、strata gene UV straddle linker 2, 400を使用しています。まず、プレートの蓋を外した状態でストラドルリンカーにセットします。次に、「Energy」を押してください。キーパッドで「9 9 9 9」を入力し、「Start」を押します。プレートを約5分間、UVに曝露させます。UVで殺菌した細菌を含むプレートは、4 °Cで逆さまの状態で最大1か月間保存できます。このセクションでは、孵化日の揃った線虫集団の作成方法について説明します。まず、約20匹の若成体虫を薬剤を含まない新しいNGMプレートに転写します。プレートを25 °Cで約1週間保持し、虫を増殖させ、1週間以内にすべての細菌餌を完食させます。成長停止したdower期のに孵化したばかりの虫が現れたら、20から30匹のdower幼虫を薬剤を含まない新しいNGMプレートに転写し、餌がある状態で25 °Cで培養します。dower幼虫は2日以内に生殖能を持つ成虫となり、その後数日間、生殖能を維持します。ここで、生殖能を持つ成虫を10から15匹、薬剤を含まない新しいNGMプレートに転移させます。このプレートを、定時産卵（TEL）プレートと呼びます。TELプレートを25°Cに保持し、線虫に産卵させます。これらの卵から孵化した個体を実験動物とし、6時間後に生存期間を測定します。TELプレートに卵があるか確認してください。まだ卵が十分にない場合は、TELプレートを25°Cで合計24時間まで放置してください。その間、定期的に卵の有無を確認します。十分な数の卵が産み付けられたら、TELプレートから成虫を取り除きます。一般的な寿命実験では、実験群あたり30～90個の卵が必要ですが、1枚のTELプレートで数百個の卵を生成することが可能です。生殖能力のある成体10～15匹が、6～8時間で約150個の卵を産みます。実験群を比較する場合、寿命に大きな差があるときは、わずか30匹の個体数でも統計的有意性を得ることができます。よりわずかな差を区別するためには、より多くの個体数を使用する必要があります。次に、成虫のいないTELプレートを20 °Cで、孵化した卵およびワームがL4幼虫期に達するまで培養します。野生型C. elegansでは通常2日かかりますが、発育遅延表現型を持つ系統ではより時間を要する場合があります。このセクションでは、齢同期させた個体群のライフサイクルを追跡する方法について説明します。まず、L4幼虫をTELプレートから準備済みのAMP FUDRプレートに移します。テストする各系統または条件について、通常は1プレートあたり25～30匹のワームを用いて、2～3枚のプレートを準備します。AMP FUDRプレートを20 °Cで24時間インキュベートします。その後、線虫、培地、および細菌の状態を視覚的に評価し、線虫を新しいAMP FUDRプレートに転写します。線虫が細菌の餌の大部分を消費している場合、通常はこの作業を週に1回または2回行います。実験の初期段階で、かなりの数の幼虫が見られる場合、これは通常、線虫がL4期ではなく若成虫の状態でAMP FUDRプレートに転移されたことを示しています。若成虫はFUDRが効き始める前に産卵することがあり、時折、幼虫がFUDRの影響を逃れて成虫に成長することがあります。このような状況では、これらの幼虫が実験結果を混乱させるため、成虫を新しいプレートに転移させ、幼虫が含まれる古いプレートは廃棄してください。生存し増殖している細菌が観察された場合は、虫を新しいプレートに移してください。通常、AMPとUV殺菌の組み合わせにより、生きた細菌による実験への汚染は防止されますが、稀に発生することがあります。その際は、虫を移してください。培地上に真菌の増殖が観察された場合、早期に発見できれば、ピペットチップやスパチュラを用いて真菌を除去することができます。直径が数ミリメートルを超えて増殖した場合は、通常、ワームを新しいプレートに移す方が効率的です。2〜3日ごとに解剖顕微鏡を用いて、すべての個体の生存期間をスコア判定します。各個体が生存しているか死亡しているかを確認してください。プレートを軽く叩きます。叩いた刺激に反応して動けば、その線虫は生存しています。プレートを叩いても反応しない場合は、頭部領域をズームアップし、白金線移送ピックで線虫の頭部を軽く叩いてください。ワームを死亡と判定します。頭を動かして反応しない場合は、死亡したワームをプレートから取り除いてください。すべてのワームを確認した後、日付と生存数および死亡数を記録します。固形培地で維持されている線虫は、潜り込んだり壁を登ったりして、時折プレート表面から脱出することがあります。脱出した線虫は、本研究から完全に除外します。終了後、プレートを20 °Cのインキュベーターに戻します。さらに2〜3日待機し、プレートを再度確認します。すべての虫が死亡するまでこの手順を繰り返します。通常、各日に死亡した虫の数を反転させて各日の生存率を算出し、タイミングを合わせた産卵日を基準として生存曲線としてグラフにプロットします。0日目。UV殺菌した培地を用いて20 °Cで維持された野生型C. elegans株の一般的な生存期間の中央値は、卵の状態から測定して約25日間です。以上で、寿命の測定方法と、老化に伴う優雅さ（エレガンス）の観察方法について説明しました。この基本手順を修正することで、食事制限やRNA干渉など、さまざまな環境条件の試験に適用することが可能です。これらの詳細については、補足テキストで解説しています。それでは、以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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