計測線虫（Caenorhabditis elegans）寿命

C Elganの寿命を測定するために、繁殖期間を計測した卵の繁殖を用いて年齢同期集団を生成します。活動中の成虫の両性具有虫は紫外線で殺菌された大腸菌をまいた線虫成長培地に移され、6〜8時間卵を産み、その後2日間取り除きます。これらの卵から虫が孵化し、L4幼虫段階に成長します。L4匹の線虫は、生きた細菌汚染を防ぐためにアンピシリンを含む新しいNGMプレートに移され、繁殖を防ぐためにFUDRを投与され、成虫へと成長させられます。

この時点からは、すべての虫が死ぬまで2〜3日ごとに成虫を観察します。各時点で死んだミミズはプレートから取り除かれ、記録される生きたミミズと死んだミミズの数が記録されます。私はワシントン大学病理学部マット・キャラインの研究室のジョージ・セトンです。

今日は寿命の測定方法と、私たちの肝炎の優雅さをご紹介します。この手法を私たちの研究室で用いて老化の遺伝学を研究しています。では、始めましょう。

基本的な寿命実験には、添加剤を含まない標準NGMプレートと、NGMにアンピシリンとフルオキシウリジンを添加したAMP FUDRプレートの2種類が必要です。両方のプレートには大腸菌OP 50菌が入っており、紫外線曝露によって死滅します。まず10ミリリットルのNGM溶液を準備します。

60ミリのペトリ皿ごとに、32回のパルスで高温で電子レンジで加熱することで固体NGMを完全に溶かします。パルスの間に媒体を渦巻きさせて、加圧ガスの気泡が蓄積するのを防ぎ、液体NGMを55度の水浴やベンチの上に置いてメディアを冷却させます。メディアが55度まで冷え、素手でガラス容器を快適に持てるようになったら、薬剤を加える準備が整います。

薬のプレートを注ぐには、150ミリモラーFUDRを33マイクロリットル、1ミリリットルあたり100ミリグラム100マイクロリットルを加えます。アンピシリンは100ミリリットルのNGMあたりにアンピシリンを混ぜて混ぜ、異物の細菌汚染を防ぐために使用され、FUDRは卵の孵化を防ぐために使われます。そのため、幼虫から分離するために数日ごとに移動させる必要はありません。

次に培地を注ぎ、プレートをベンチで2日間乾燥させます。その前日に、プレートが新鮮な大腸菌のストリークから単一のコロニーを作った液体LB培養液を乾燥させ終えます。LBオーガーにOP 50の細菌がいます。60ミリメートルのプレートに対して少なくとも0.5ミリリットルの培養液を準備してください。

OP 50培養液を37度のシェイカーに入れ、細菌を一晩増やします。翌日、OP 50の細菌に3,500gの遠心力を10分間ペレットで投与しました。細菌を10倍の濃度で再懸濁させるのに十分な量の上清液をデカントします。

次に、各プレートに濃縮培養液を100マイクロリットル接種します。ピペットの先端をNGM表面に触れないようにしてください。培地表面の欠陥により、ミミズがスワールプレートを潜り、細菌がプレート壁に近づかずにNGMの中央部分を覆い、プレートを24時間ベンチで乾燥させることができます。乾燥したら、プレートの表面を細菌の増殖を止めるのに十分な紫外線照射を照射し、私たちはストラタ遺伝子のUVストラドルリンカー2,400を使用します。

まず、蓋を閉めずにストラドルリンカーにプレートを積み込みます。今度はエネルギーボタンを押してください。キーパッドで9 9 9 9を入力してスタートボタンを押してください。

プレートは約5分間紫外線にさらされます。UV殺菌が入ったプレートは、逆さまにして4度の温度で最大1か月間保存できます。このセクションでは、共通の孵化日を持つミミズの個体群を生成する方法を説明します。

まず、約20匹の若年成虫を薬剤なしで新しいNGMプレートに移すことから始めます。皿を約1週間25度の温度で放置し、ミミズが繁殖して1週間以内に細菌の餌をすべて食べ尽くすのを待ちます。成長停止期の新孵化した幼虫は、20〜30個のダウアー幼虫を薬剤なしで新しいNGMプレートに移植し、25度の環境で餌の存在下で培養するべきです。

ダウアーの幼虫は2日以内に生殖活動が活発な成虫となり、その後数日間は生殖活動を続けます。次に、生殖活動のある成人10〜15人を薬なしで新しいNGMプレートに移します。このプレートはタイムド・エッグ・アンド・リーディング(TELプレート)と呼ばれます。

TELプレートは25度の温度で保ち、ミミズが卵を産むようにしてください。これらの卵から孵化した動物は実験動物となり、6時間後に寿命が評価されます。TELプレートに卵がないか確認してください。

まだ卵が足りない場合は、TELプレートを25度Cの温度で最大24時間放置してください。定期的に卵がないか確認しています。十分な数の卵が産まれたら、成虫をTELプレートから取り出します。

典型的な寿命実験では、1つの実験群につき30〜90個の卵が必要ですが、1つのTELプレート上で数百個の卵を生成することができます。約150個の繁殖活動可能な成人が6〜8時間で150個の卵を産みます。実験群を比較すると、30頭程度の動物でも大きな寿命差でも統計的有意性を得ることができます。

より控えめな違いを区別するために、より多くの動物を使うべきです。次に、成虫なしのTELプレートを20度の温度で置き、卵が孵化し、ミミズがL4幼虫段階に発達するまで待ちます。野生型Cの優雅な品種では通常2日かかりますが、発達が遅い品種ではさらに時間がかかることがあります。

このセクションでは、年齢同期された集団の生活を追う方法を説明します。まず、L4個の幼虫をTELプレートから座ったAMP FUDRプレートに移します。検査対象の株や状態ごとに、通常は25〜30匹のミミズを配置した2〜3枚のプレートを設置します。

AMP FUDRプレートは20度Cで24時間培養します。そして、ミミズ、培地、細菌が新しいAMP FUDRプレートに移すミミズを目視で評価します。もしミミズがほとんどの細菌の餌を食べてしまった場合、これは通常週に1〜2回起こります。

実験初期に十分な数の幼虫が存在する場合、これは通常、ミミズがL4ではなく若い成虫としてAMP FUDRプレートに移されたことを示しています。若い成虫はFUDRが発動する前に卵を産むことができ、時折幼虫がFUDRの影響を逃れて成虫に成長することもあります。これらの幼虫は実験を混乱させ、成虫を新しいプレートに移し、幼虫を含む古いプレートを捨てます。

生きた細菌が観察された場合は、新しい培養皿に移す必要があります。一般的にAMPとUV殺菌の組み合わせにより、生きた細菌が実験を汚染することはなくなりますが、時折発生することがあります。それと、ミミズも移植してください。

培地上で真菌の増殖が観察された場合。早期に発見できれば、ピペットの先端やヘラで菌を除去できます。直径数ミリメートル以上に大きくなると、通常は新しいプレートに移植しやすくなります。

すべてのミミズの寿命を2〜3日に一度測定します。解剖用スコープを使っています。各ミミズが生きているのか死んでいるのかを判断してください。

皿を優しく叩きます。ミミズはタップに応じて動くなら生きていると言えます。もしミミズがプレートを叩いて反応しない場合は、ヘッド部分にズームインし、プラチナトランスファーピックで優しくミミズの頭を叩いてください。

ミミズは死んだと評価しろ。頭を動かしても反応しない場合は、死んだミミズをプレートから取り除きます。すべてのミミズを確認した後、日付と生きているミミズの数を記録します。

固体培地上に飼育されたワームは、時折板面から飛び出し、壁を這い上がったりします。逃げるミミズは研究から完全に除外されています。終わったら、プレートを20度のインキュベーターに戻します。

さらに2〜3日待ってから、ナンバープレートを再度確認してください。この方法をすべてのミミズが死ぬまで続けてください。1日に死亡するミミズの数は通常逆にして、1日に生きているミミズの割合を計算します。このデータは、産卵日を考慮した生存曲線としてグラフでプロットされます。

ゼロ日目。Nの典型的な中央値寿命です。シーエルガン野生型株は、20度摂氏のUV殺菌菌で維持されており、卵から約25日間の効果を発します。

私たちは今、寿命の測定方法と優雅さの見方をお見せしました。この基本的な手順を修正して、食事制限やRNA干渉など様々な環境条件を検査することも可能で、これらは補助テキストで説明されています。以上です。

ご視聴ありがとうございます。実験の成功を祈っています。