Name: ロブスター属Americanus口胃神経系の解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 26 min 22 s
Description: 学ぶロブスターHomarus americanusの口胃神経系の精密解剖法。神経節と神経を組織から分離し、神経回路の機能研究に用いる標本を作成する。神経生理学と発生生物学の研究に有用です。

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我々は、顧問、博士イヴマーダーに感謝します。この研究は、イブマーダーとNS059255にNS17813 AE T.する健康補助金の国立研究所によってサポートされていました

前にこのプロトコルを開始するロブスターの胃は、動物から削除され、コンパニオンのJoveの記事（ビアーマン＆トビン、2009）に記載のように準備する必要があります。以下の手順の大半は、解剖顕微鏡下で実行する必要があります。 一部交連神経節を私は絶縁型<ol><li>オリエント料理は、その前端が（唇で）あなたと後端（幽門によって）から離れていることをあなたに向かっています。 </li><li>それは皿に、できるだけ平らになるように胃が固定されていることを確認します。 <ol><li>唇の両側に食道を突き止める。 </li><li>必要に応じて、総郭の間に配置された他のピンを再配置する。 </li></ol></li><li>皮下組織を削除します。 <ol><li> gm2/gm3筋肉の近くに皮下組織をつかむ、これらの筋肉から、それを切り離して、ゆっくりと前方方向に引き出します。 </li><li>すべての接続をsnippingによって下にある脂肪から皮下組織を分離。口胃神経系の重要な部分を囲む中央の動脈、周りの増加は十分に注意してください。 gm1b筋肉の間に位置する口と胃の神経節、の約0.5cmの半径内皮下組織はそのままにしておきます。 </li><li>分離された皮下組織を切り取ります。 </li></ol></li><li>基盤となる組織から脳を切り離します。 <ol><li>胃の前方部分の交連神経に脳の前方部分から両側に投影する二つの大きな交連神経を識別します。 </li><li>これらの神経はそのままに、静かにピンセットで脳を持ち上げて、組織の他の部分から脳を分離するカット。口と胃の神経は脳の下にあるとそのまま保持する必要があるとして、これを行うように注意してください。 </li></ol></li><li>周囲の組織から交連神経節を区切ります。 <ol><li>交連神経のどれか1つを1交連神経に従ってください。 </li><li> イオンと息子を識別する-これらの神経はそのまま残す必要があります。交連神経節は、外放射多くの神経を持つことになります。 （ イオンと息子を除いて）それらのほとんどをカットしますが、解剖を終えながら、場所に交連神経節を保持するために取り付けられたつの余分な神経を残す。 </li><li>他の交連神経節で繰り返します。 </li></ol></li><li>外側から内側へのイオンと息子を清掃してください 。胃への神経系を固定するために唇神経はそのままにしておきます。食道神経節は、 イオンの sが交差していた座っている。あなたが劣った心室神経をつかんで下にカットするまで引き上げてその下にクリアすることができます。 </li></ol>パートII -分離口と胃の神経節（STG）と残りの神経を。 <ol start="7"><li>周囲の組織からSTGを区切ります。 <ol><li> STGはgm1b筋肉やダウンgm2a、bの筋肉の間で実行される動脈の内部に位置しています。 gm2a、bの筋肉に近い動脈の断端を探してください。 </li><li> DVNを公開するために、上と前方動脈の切断端を引き出します。あなたが残りの皮下組織のレベルに達するまで引き上げ続けます。一度分離した、動脈は、それが残りの皮下組織に接触するレベルにトリミングすることができます。 </li><li>ロブスターの演壇に位置していた筋弁を切り取ります。 </li><li>動脈がSTG上記の脂肪の内側トンネルを作ることが観察、動脈上の皮下組織を持ち上げて。動脈の内側にはさみの一刃を入れ、その上の筋肉を切る。あなたが安全にSTGを超えている確かにカットのように、DVNを見ることができることを確認してください。動脈以下、前方にカット続けます。あなたがSTGの上にカットとして、STNがダウンして筋肉へのSTGとダイビングから前方に放射さ見ることができます。完全にSTGの上に筋肉を分離するために前方カット続けます。 </li><li>離れてSTNから任意の組織をクリアします。 </li></ol></li><li>周囲の組織からAGNのを区切ります。 （あなたがAGNから録音する予定がない場合でも、あなたは、細胞内記録のための神経節を突き止めるために無傷の神経の部分が必要になります。） <ol><li>より良いAGNのを確認するには、残りの皮下組織および基礎となる筋肉の薄い層を取り除く。 </li><li> STGへのちょうど後方、DVNの両側に脂肪と筋肉の暗いトンネルを識別する。 </li><li>トンネル内の1つはさみの刃を貼り、神経、上記の組織をカット。それを分離するために、神経以下、横方向に切断続ける。 （カップルミリメートル神経節を固定するのに十分ですが、そこから録音する場合はAGNの5mm以上を公開。） </li><li>それは接続を切断することによりinnervates筋肉からAGNを切り離します。 </li><li>他のAGNを分離するために反対側に繰り返します。 </li><li>両方AGNのが解剖された後、胃にSTGを接続しているすべての筋肉と組織をカット。 </li></ol></li><li> MVN sを分離する彼らはLVNから分岐し、脂肪の下に横方向に横断する小さな神経の二国間のペアです。 <ol><li>で2つLVN Sには、枝の近くに、DVNの片側に脂肪カットスルーにハサミまたは2つの鉗子を使用してどちらかここでは、MVNのほど遠いものであり、それらをカット危険にさらすことはありません。 </li><li>脂肪層を持ち上げ、そして小さなMVNの下を識別する。これらの神経はgm1b筋肉のレベルまで横方向にちょうど後部内側を走る。 </li><li>今のようにそれがもつれにならない神経はそのままに、MVN上記の脂肪の層を取り除きます。あなたは、解剖の終わりに胃オフからその外側端をカットします。 </li><li>他のMVNを分離するために反対側のプロセスを繰り返します。 </li></ol></li><li> LVNのと後部神経を分離します。 <ol><li>ここで、横方向にDVNオフLVNの分岐からは、その上に脂肪をカットしてLVNに従ってください。準備に応じて、時には神経上記の全体の脂肪層をオフにプルアップすることができます。 </li><li> PSNの枝がオフ点まで、LVNを明らかに続ける。 </li></ol></li><li> pynを分離する。 <ol><li> pynを見つけ、それが幽門を介して後方に移動する神経です。 </li><li>この領域をカバーする薄い膜を取り除きます。 </li><li> pynに接続されている幽門の小さなセクションを、カットすることでpynを分離します。 </li><li>優しく幽門セクションを持ち上げて、あなたがPDNに接続する分岐に到達するまでpynのいずれかの側に組織を切り取る。 </li></ol></li><li> PDNを分離する。 <ol><li> PDNを見つけ、それが幽門散大筋に後方に移動する神経です。 </li><li> PDNに接続されている幽門散大筋の小さなセクションを、カット。 </li><li>優しく、幽門散大筋のセクションを持ち上げて、pynに接続する分岐に到達するまで、PDNのいずれかの側に組織を切り取る。 </li></ol></li><li> LVNにpynとPDNを結ぶ腹LVNを 、分離する。 <ol><li> pynとPDNが腹LVNに接続する三角形の分岐点で、このようなvplnなどの腹側LVNオフ枝、その神経のいずれかの小さなセクションを分離する。これは、腹側LVNを引っ張らないようにハンドルとして使用されます。 </li><li>ハンドルを持ち上げて、腹LVNの両側に組織を切り取る、あなたがどこにPSN分岐点をオフに到達するまで前方方向に働いて。 </li></ol></li><li>反対側のLVNと後部神経を分離するために13 -手順10を繰り返します。 </li><li>胃から口胃神経系を切り離します。 <ol><li>完全に胃からのLVNを切り離すには、PSNを引っ張るとPDNとpynを除いて、LVNと腹LVNに接続されているすべての組織や神経を切る。反対側にこのプロセスを繰り返します。 </li><li>各MVNの外側端をカット。外側の端を持ち上げて、神経と下層胃組織の間に余分な添付ファイルをカット。 </li><li>前端で、交連神経に余分な添付ファイルをカットし、それぞれの側に唇神経を切断。 </li><li>視覚的に胃の組織に追加の添付ファイルをカットして識別し、口胃神経系のシステムをスキャンします。 </li><li>交連神経節上記の、および胃から口胃神経系剥離、両方交連神経の前端につかむと皿の側面に移動。これを行うとして、神経系を解放するために、残りの添付ファイルをカット。 </li></ol></li><li>小さなSylgard皿を準備します。 <ol><li>小皿にSylgardの表面に十分にある胃の組織をこする。これは、生理食塩水は、皿に均等に分散されるように、Sylgardの疎水性を減少します。 </li><li>冷やした生理食塩水とSylgard皿をすすぎ、記入してください。 </li></ol></li><li> 、両方の交連神経の前方の端をつかんで、大きな皿の神経系を持ち上げ、そして小さな皿にそれを置くことによって準備さSylgard皿に神経系を転送します。 </li><li> minutenピンとタングステンワイヤから切断薄くピンの組み合わせを使用して、小さな皿にSTNSをピン。 <ol><li>準備が劣る心室の神経が離れてSylgardから指していることをチェックして背側にアップしていることを確認してください。 </li><li>脳を取り出して、交連神経をピン。 </li><li>ゆっくりと後方と横方向にPSN sのそれぞれを引っ張り、そしてそれらを確保することによりタイトでフラットな神経系を引き出します。 </li><li> PDN sから幽門散大筋を外し、PDN sをピン</li><li>削除幽門pyn sからセグメント、およびpyn sをピン</li><li>このような口唇神経、MVN sとAGN秒として、残りの孤立した神経を突き止める</li></ol></li><li> Desheath STG。 <ol><li> STGはSylgardに対して平らになると横方向のAGNの、前方STNと後部DVNで張り詰めた開催を確認してください。 </li><li> DVN内の軸索の可視化を可能にするために照明を配置します。 </li><li>小さ ​​なピンや細かいタングステン針を使用して、STGにちょうど後部DVNを 、周囲の鞘に小さな浅い穴を作る。 </li><li>神経鞘における水平断裂を作成するには、軸索の背側、DVN渡っ針を引き抜きます。 </li><li> STGへの後方神経鞘のフラップを取得し、STGの背側からシースを除去するために前方に引き出します。 </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 略語： </td></tr><tr><td> STNS </td><td>口と胃の神経系</td></tr><tr><td> STG </td><td>口と胃の神経節</td></tr><tr><td> COG </td><td>交連神経節</td></tr><tr><td> STN </td><td>口と胃の神経</td></tr><tr><td> MVN </td><td>内側心室神経</td></tr><tr><td> イオン </td><td>下食道神経</td></tr><tr><td> 息子 </td><td>優れた食道神経</td></tr><tr><td> AGN </td><td>前胃神経</td></tr><tr><td> DVN </td><td>背心室神経</td></tr><tr><td> LVN </td><td>外側心室神経</td></tr><tr><td> PSN </td><td>後胃の神経</td></tr><tr><td> vpln </td><td>後腹側外側神経</td></tr><tr><td> pyn </td><td>幽門神経</td></tr><tr><td> PDN </td><td>幽門拡張器の神経</td></tr></tbody></table>

<ol><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+interacting+central+pattern+generators+in+lobster+stomatogastric+ganglion%3A+influence+of+feeding+and+partial+pressure+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen.</a> J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).</li>
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<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+profiling+of+identified+neurons+reveals+cell-specific+constraints+on+highly+variable+levels+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).</li>
</ol>

ロブスターの胃とSTNSの解剖学は、よく以前に5,6に記載されており、この解剖の手順のバリエーションが多くの研究に利用されている。我々は、開始前に、解剖に5-7とSTNS 5,8胃の解剖学に精通することをお勧めします。そのような知識が神経や組織への偶発的な損傷のリスクを減少します。 準備の健康を維持するために、それは涼しい温度で準備を維持するために重要です。これは、簡単に生理食塩水を4と30分毎に交換することによって達成される˚C生理食塩水は冷蔵庫で保管。冷生理食塩水に浸漬する場合、孤立STNSの準備は、多くの時間実行可能です。関連ロブスター属のヨコエビの録音は 、in vitro 9 の 5日間を通してSTGから安定したリズム活動を示している。類似の堅牢性は、H.で見られているamericanus（OBS pers.。）。 交連神経節からSTGへの調節の入力は、継続的な運動パターンを維持するために必要です。したがって、正常なリズム活動を維持するために、これらの神経節とイオン 、 息子 、とSTNの神経はそのまま保持されている必要があります。 AGNの（胃ミル（GM）軸索を含む）、MVNの（ラテラル胃（LG）と劣った心臓（IC）軸索を含む）、pyn S：我々が説明する解剖では、いくつかの運動神経を（運動ニューロン軸索を含む）保持（幽門ニューロン（PY）軸索を含む）、PDNの（幽門拡張器（PD）軸索を含む）、とLVNの（ラテラル幽門（LP）、内側胃（MG）、LPGの軸索だけでなく、GMからのものを含む、 PDとPY）。追加の（または別の）神経を解剖することにより、他の運動ニューロンの軸索が記録されることがあります。運動ニューロン軸索のそれぞれの個々のタイプは、ニューロンのプロジェクトの、そのタイプに筋肉を支配する神経から解剖し、記録することによって個々に記録することができる。 この製剤は、神経系の機能に焦点を当てた研究のさまざまな目的で使用されることがあります。ニューロンの活動はsomaの複数形や軸索から細胞内、シャープ電極記録を用いて、または神経から細胞外に電気インパルスを記録することによって、どちらか記録することができる。 STGニューロンの多くのイオンチャネルは、部分的にクローニングされており、mRNAは、手動で引っ張らsomaの複数形10,11から測定することができる。

<table><tbody><tr><td>極細タングステン線 (直径0.001 in.)</td><td>器具</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>1-2mmに切断し、極細ピンとして使用する。</td></tr><tr><td>ピンセット #5</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>ミニュテンピン</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Moriaスプリングシザー (刃長7mm)</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td>これらは最高級品である。同社からより経済的なスプリングシザーも販売されている。</td></tr><tr><td>シャーレ (100x15mm)</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>Sylgard 182を2-4mm充填する。</td></tr><tr><td>Sylgard 182</td><td>その他</td><td>Dow Corning</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>ピンホルダー</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>オプション。脱鞘はシザーと極細ピンセットのみで行うことができる。</td></tr><tr><td>超極細ピンセット #5SF</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>タングステン針</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>オプション。脱鞘はシザーまたは極細タングステン線を切断して作ったピンで行うことができる。</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ロブスター属americanus口胃神経系の解剖

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

どのように神経系の活動を生産し、環境への対応を理解することを目標に、神経科学者が関心の活性を発揮し、アクセス可能と実験的手法に従順なモデルシステムに電源を入れます。アメリカンロブスターの口胃神経系（STNS）（<i&gt;ロブスター属americanus</i&gt;、また大西洋またはメインロブスターでした）知っているネットワークとネットワークの神経調節を生成するリズムを研究するためのモデルシステムとして確立されている。 STNSは、そのプロジェクトの一元口と胃の神経節（STG）に調節ニューロンを含む、3前核（2交連神経節と食道神経節）で構成されています。 STGは2つの中枢パターン生成ネットワークを構成する約30ニューロン、甲殻類の摂食行動の根底にある幽門と胃のネットワークが含まれています<sup&gt; 1,2</sup&gt;。それはこのシステムを研究することは可能ですが、<i&gt; in vivoで</i<sup&gt; 3</sup&gt;、STNSが孤立したとき、そのリズム活動を生み出し続ける<i&gt; in vitroで</i&gt;。皿のSTNSの物理的な分離は、細胞内の電気生理学的記録のための神経のsomaの複数形にし、細胞外記録用STNSの神経へ簡単にアクセスすることができます。 STNSを分離すると、2つのプロセスです。動物からの胃を解剖最初の部分は、付属のビデオ資料に記載されています。<sup&gt; 4</sup&gt;。このビデオの記事では、微細な解剖の技術は、胃からSTNSを分離するために使用されています。この手順では、電気生理学的記録に使用できる神経系の準備をもたらす。

我々はアメリカのロブスターの胃から口胃神経系の微細な解剖を説明します（<i&gt;ロブスター属americanus</i&gt;）。

ロブスター属Americanus口胃神経系の解剖

神経系がどのように活動を生成し、環境に反応するかを理解することを目的として、神経科学者は、...を特徴とするモデルシステムに着目しています。

ロブスターから胃神経系（ST gastric nervous system）を単離する手順は、粗解剖と精細解剖の2つのパートに分けることができます。このビデオでは、胃からの体性胃神経系の精細解剖について解説し、STGと呼ばれる脂肪胃神経節と、cogsと呼ばれる交連神経節を含みます。基本的には、まずcgsを単離し、次にSt Gを単離することで、神経と神経節を周囲の組織から分離させる必要があります。この手順の結果、神経系の機能に焦点を当てたさまざまな研究に使用可能な状態で、胃神経系がディッシュ上にピン留めされて準備されます。こんにちは。ブランダイス大学生物学部のEve Martyr博士の研究室のAnnalise Tobinです。こんにちは、同じくMartyr研究室のHillary Burmanです。本日は、ロブスター（Homarus Americana）の胃から体性胃神経系を単離し、胃がどのように除去されるかを確認するためのプロトコルをご紹介します。JoVEの付随ビデオプロトコルをご参照ください。当研究室では、リズム動作を生成する小規模な神経回路におけるニューロンの機能を研究するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、これがどのように行われるかを確認するために、ロブスターの胃の標本作製を行う必要があります。付属のビデオを参照してください。まず、唇に近い内側端が自分から遠ざかり、後端が自分の方に向くように標本を配置します。ここからの手順では、標本をより正確にピン留めします。食道を唇の両側でピンで固定し、必要に応じて、肉眼解剖中に配置した他のピンを調整して胃を平らにします。次に、まずgm、2つのGM3筋肉の近くで皮下組織を掴み、これらの筋肉から切り離して、前方にゆっくりと牽引して皮下組織を除去します。体性胃神経系の一部を包む中心動脈の周囲の接続部を、注意深くハサミで切断しながら、皮下組織を下の脂肪層から分離させます。この際、皮下組織を損なわずに残してください。GM one B 筋肉の間に位置する体性胃神経節から半径約 0.5 centimeter 以内の範囲で、分離した下皮を切り離します。次のステップは、脳を下の組織から切り離すことです。まず、脳の前端から胃の前端にある Commis 神経節に向かって左右に伸びている2本の大きな Commis 神経を特定してください。これらの神経を傷つけないように注意しながら、ピンセットで脳をそっと持ち上げ、切断して脳を他の組織から切り離します。この際、体性胃神経が脳の下にあるため、損傷させないよう細心の注意を払ってください。交連神経節を周囲の組織から分離するには、まず交連神経のいずれかを辿って神経節の位置を確認します。次に、ION（眼下神経）とSON（上眼窩神経）を特定します。これらの神経は損傷させないようにしてください。各交連神経節からは、多くの神経が放射状に伸びています。IONとSON以外のほとんどの神経を切断します。また、解剖を完了させるまで交連神経節を固定しておくため、神経を1本余分に残しておきます。同様の手順で、もう一方の交連神経節から出ている神経を特定し、切り離します。次に、IONおよびSONを外側から内側に向かって洗浄します。胃への固定に利用するため、唇神経は温存してください。食道神経節はiOSの交差部分に位置しています。下室神経を掴んで上向きに誘導し、その下方を切断することで、その下の領域をクリアにすることができます。次のステップは、STGを周囲の組織から分離することです。STGは、GM 1B筋からGM 2aB筋にかけて走行する動脈の中に位置しています。gm付近にある動脈の切断端を探します。2本のAB筋を用いて動脈を上方および内側へ牽引し、DVNを露出させます。残りの皮下組織までさらに上方へ牽引し続けてください。分離後、動脈を、残っている皮下組織に接する高さまで切り揃えます。次に、ロブスターの吻（ふん）に位置していた筋肉フラップを切り離します。続いて、動脈の上の皮下組織を持ち上げます。動脈は脂肪組織の中にトンネルを作っています。STGの上方を確認してください。ハサミの片方の刃を動脈の中に入れ、その上方の筋肉を切断します。切開しながらDVNを確認し、安全であることを確かめてください。STGの上方で、動脈に沿ってさらに前方へ切開を進めます。STGの上方を切開すると、STGから前方に向かって分出し、筋肉内へと潜り込むSTNを確認できます。さらに前方に切開を進め、STG上の筋肉を完全に分離します。STNから組織を取り除いてください。これで、他のいくつかの神経の単離に進むことができます。次に、周囲の組織から分離させる神経はAGNsです。AGNから記録を行う予定がない場合でも、神経節を固定するためにはその一部が必要になります。AGNsをより明確に観察するために、STGの直後にある残りの皮下組織と、その下の筋肉の薄い層を除去してください。DVNスティックの両側の脂肪と筋肉の中にある暗いトンネルを探し、ハサミの刃の一方をトンネルに入れ、神経の上の組織を切断します。神経に沿って外側へと切断を続け、神経を単離します。神経節をピンで固定するには数mmで十分ですが、A GNから記録を行う場合は、少なくとも5mmを露出させてください。接続部を切断して、支配している筋肉からAGNを切り離します。同様の操作を反対側でも繰り返し、もう一方のAGNを単離します。両方のAGNの解剖が完了したら、STGと胃を接続しているすべての筋肉および組織を切断します。次に、M vnsを単離します。これらはLVNから分枝し、脂肪の下を外側に向かって走行する一対の小さな左右相称の神経です。DVNが2本のLVNに分枝する付近の片側で、ハサミまたは2本のピンセットを使用して脂肪を切開してください。ここではM VNSから十分に離れているため、それらを切断するリスクはありません。脂肪層を持ち上げ、その下にある細い神経を確認します。MVNは、GM1筋肉のレベルのすぐ後方で外側に向かって走行しています。MVNの上の脂肪層を除去します。このとき、神経が絡まないように、神経はそのままにしておきます。神経系の解剖の最後に、その外側端およびM VNSへの付着部を切断します。反対側でも同様の手順を繰り返し、もう一方のMVNを単離します。次に、後神経にあるLVNの単離を行います。まず、DVNから外側に分岐しているLVNを確認します。LVN上の脂肪を切除しながら、その走行を追います。サンプルの状態によっては、神経上の脂肪層全体を剥離できる場合もあります。PSNが分枝する点までLVNの露出を続けます。次にPYNを確認します。これは孔の上を後方に走行する神経です。この領域を覆っている薄い膜を除去します。PYN管に付着しているporiの小さな部分を切断し、PYNを単離します。次に、切断した部分をそっと持ち上げ、PDNに接続する分枝に到達するまで、PYNの両側の組織を切り除きます。瞳孔散大筋の後方に走行するPDNA（瞳孔散大神経）の単離を進めます。まず、PDNに付着している瞳孔散大筋の一部を小さく切り取ります。次に、切り取った瞳孔散大筋の部分をそっと持ち上げます。PYNに接続する分枝に到達するまで、PDNの両側の組織を切り除きます。次に、PYNとPDNを腹側LVNに接続する三角形の分枝点にある、PYNとPDNをLVNに繋ぐ腹側LVNを確認します。VPLNなど、腹側LVNから分枝している小さな神経節を分離します。これをハンドルとして使い、ハンドルを持ち上げることで腹側LVNを牽引します。腹側LVNの両側の組織を、PSNが分岐する点に到達するまで前方に向かって切り出します。これで、胃の片側の後神経の剥離が完了しました。次に、反対側のLVNと後神経を単離します。左迷走神経（LVN）を胃から完全に切り離します。後迷走神経（PSN）を牽引し、後迷走神経（PDN）と咽頭迷走神経（PYN）を除く、LVNおよび腹側LVNに付着しているすべての組織と神経を切断します。反対側でも同様の操作を繰り返します。次に、各MVNの側端を切断します。側端を持ち上げ、前方端におけるMVNへの付着部を切断してください。その後、交連神経節への付着部を切断し、両側の唇神経を切断します。胃の体性神経系を視覚的に確認し、胃組織へのその他の付着部を特定して切断します。すべての接続を切断した後、Commis神経節の上方にある両側のcommis神経の前端を掴み、胃から体性神経系を剥離してシャーレの脇に移動させることができます。この操作を行う際、神経系を完全に分離させるために、その他の付着部を切断してください。これで解剖は完了です。まず、神経系を固定するためのソーガーディッシュを準備します。小さいディッシュに入ったソーガーの表面に、胃組織を十分に塗り込みます。これによりアガロースの疎水性が低下し、生理食塩水がディッシュ全体に均一に広がります。アガロースディッシュを冷やした生理食塩水で洗浄し、満たします。両側の交連神経の前端を掴んで、神経系を準備したアガロースディッシュに移します。神経系を大きなディッシュから持ち上げ、小さなディッシュに配置します。神経系を固定するために、極細ピンとさらに細いピンを組み合わせて使用してください。まずタングステン線からピンを作成し、下室神経がSylgardから離れる方向に向いていることを確認して、標本の背面が上になるようにしてください。次に、脳を取り除き、交連神経（commis nerves）をピンで固定します。各PSNを後方および外側に引き、ピンで固定することで、結紮した神経系を緩やかに引っ張り、平坦にします。続いて、P瞳孔散大筋をPNSから除去し、それらの神経をピンで固定します。次に、GYNsから幽門節を除去し、GYNsをピンで固定します。最後に、唇神経、m vns、AGNsなどの残りの単独神経をピンで固定します。次のステップは、S stのシートを除去することです。まず、S st GがSガードに密着し、側方AGNによってしっかりと固定されていることを確認します。前方STNと後方DVNを用いて照明を調整し、DVN内の軸索を可視化できるようにします。次に、小さなピンまたは細いタングステン針を使用します。STGの直後で、DVNを囲む神経鞘に小さく浅い穴を開けます。軸索の背側で染色されたDVNに沿って針を引き、神経鞘に水平方向の裂開を作ります。次に、STGの後方にある神経鞘のフラップをつかんで前方に引き、切断してSTGの背側から神経鞘を取り除きます。鞘を除去した後、試料を約4から15°Cの低温に維持すれば、実験に使用可能な状態となります。この試料は、最長で5日間、実験的に安定した状態を維持することが報告されています。無傷のSato胃神経系をSylgardディッシュにピンで固定してください。図に示されているように、神経は損傷がなく、細胞外記録が可能な状態で露出している必要があります。また、無傷のSTGの細胞体が視認でき、細胞内記録が可能な状態でなければなりません。以上で、ロブスターHoma Americanaの体性胃神経系の単離方法について説明しました。この解剖を行う際は、組織や神経を損傷させないよう、解剖学的構造に十分に精通しておくことが重要です。また、試料を4°Cから15°Cの間の低温に維持することが極めて重要です。解剖中、冷蔵庫で4°Cに保持しておいた冷たい生理食塩水を用いて、30分ごとに生理食塩水を交換することで、試料の低温状態を容易に維持できます。数時間から数日間は生存可能です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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