Name: P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: 学ぶP2X2受容体C末端と相互作用する脳タンパク質を特定するプロテオミクス手法。GST融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイと質量分析により、ラット脳ライゼートから結合タンパク質を同定し、P2X受容体シグナル伝達の理解を深める。

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実験手順実験手順（図2）は以下の段階的な方法で説明されている4つの部分から構成されています。 パート1：P2X2受容体のC末端のサブクローニングおよび発現。 我々はそれが結合する脳のタンパク質を同定するために全長細菌におけるP2X2受容体のC末端を表明している。 <ol><li> P2X2受容体のC末端（残基353〜472）（図1）pGEX 4NT1（GEライフサイエンス）にクローン化と塩基配列決定と検証、PCRにより増幅した。 </li><li>組換えプラスミドを大腸菌に形質転換された組換えタンパク質の発現用大腸菌（BL21）。 </li><li> P2X2 CT - GSTプラスミドを含む細菌（ 大腸菌 BL21）のグリセロールストックを滅菌ピペットの先端で擦り取り、適当な選択マーカーとルリア-ベルターニ（LB）培地（50 g / mlのアンピシリン）5mlに接種し、 37℃でオービタルシェーカーで一晩インキュベート。 </li><li> 600nmの光学密度に達するまで一晩培養したが、適切な抗生物質（50μg/ mlのアンピシリン）を含むLB培地250 mlに接種し、37℃で2〜3時間、250 rpmでオービタルシェーカーでインキュベートした〜 0.6から0.7。 </li><li>培養は、1mMのIPTGで誘導し、さらにタンパク質発現のための3時間37℃でインキュベートした。 </li><li>文化は、その後、4C（文化1mlのは、発現レベルを分析用に保存し、&quot;誘導&quot;としてラベル付けされた）で15分間5000gで回転させた。上清を捨て、ペレットを生理食塩水トリス- EDTA（STE）緩衝液（10mMトリス- HCl、150mMのNaCl、1mMのEDTA pH8.0）を20mlに再懸濁した。 </li><li>懸濁液を50mlファルコンチューブに15分間5000gで回転させた。上清を捨て、半乾燥したペレットは、一晩、-70℃で凍結した。 </li><li> - 70Cペレットを氷冷溶解緩衝液40ml中（2％（w / v）のサルコシル、15 mgのリゾチーム、150mMのNaCl、50mMのトリスpH7.5、5mMのDTTと完全なプロテアーゼ阻害剤の錠剤）に再懸濁し、 、および懸濁液を氷上で30分間インキュベートした。このインキュベーションの間、3ミリリットルグルタチオン - セファロース4BビーズをPBSに続いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、20mlのT - PBS（0.1％（v / v）のPBSでtritonX - 100）20mlで洗浄した。ビーズを1mlのPBSに再懸濁させた。 </li><li>細菌懸濁液は、液体窒素と超音波処理で3回凍結融解（オフ/オン1秒、氷上で3分間30ミクロン）と、さらに4％（v / v）のトリトンX - 100、10mMのマグネシウムと30分間インキュベートした。氷上で4と2 mMのATP。 </li><li>ライセートは、4Cとペレットで15分を20000 gで遠心し（上清のペレットと1 mlのサンプルが細胞質ゾルと膜中のタンパク質の量をテストするためにSDSのページ用に保存された）を廃棄した。上清を4℃で1時間（または一晩）のためのビーズとインキュベートした。 </li><li>ビーズを5分間、500gで遠心した上清を（サンプルの非結合画分のために保存された）を廃棄した。ビーズをT - PBSに5回（洗浄は洗浄のコントロールのために保存された）で洗浄した。 </li><li>ビーズを50％（w / v）のスラリーを得たPBSに再懸濁し、使用まで4℃で冷蔵庫に保存されていました。タンパク質濃度はBradfordアッセイ（製造者の指示当たり）によって推定された。 </li></ol>第2部：全脳ライセートの調製 P2X2受容体が豊富に脳8で表されることが知られている。本解析では、我々は、ラットの全脳溶解（図3）から、P2X2受容体と相互作用するタンパク質を特定しようとした。 <ol><li>成体ラットの脳を採取（動物はUCLA IAACUC承認されたプロトコルに従って、実験動物の管理と使用に関するNI​​Hのガイドに従って屠殺し）し、直ちに氷冷PBS（3X）を洗浄した。 </li><li> 150mMのNaClを含有する氷冷溶解バッファーのセル10ミリリットル（収穫脳の〜5倍の湿重量）を溶解するために、50mMトリス- HCl、pH7.4の、10mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのNaFを、1mMののNa 3 VO 4、1mMのPMSF、ロイペプチン、5μg/ mlの、1％（v / v）のNP - 40、およびプロテアーゼインヒビターカクテル錠を収穫し、脳に追加された。 </li><li>均質な一貫性の混合が達成されるまで脳組織をガラスDounceホモジナイザーで氷の上均質化した。 </li><li>細胞溶解液は、連続したセルを削除するには、5分間に2000 gで回転させた。上清はそのまま細胞小器官と細胞膜の凝集物を除去するために60分間29000グラムで再び採取し、分離独立しました。 </li><li>すぐに遠心分離後上清を新しいチューブに移した。全脳のライセートのタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより測定した（通常〜15 mg / mlの）。 </li><li>ライセートを分取し、AT - 70Cで保存した。 </li></ol>パート3：P2X2 C -テイル関連したタンパク質の単離全脳ライセートからP2X2 CT - GSTの結合パートナーを同定するために、アッセイのプルダウンは、CT - Gを用いて実施したSTは、餌としてグルタチオンセファロース4Bビーズに固定化。コントロールについては、ビーズに結合しただけではGSTが使用されました。 <ol><li>脳ライセートを4℃で1時間、GSTビーズとpreclearedした。ペレットを廃棄した上清を更なる分析のために使用されていました。 </li><li>グルタチオンセファロース4 Bのビーズに結合したGSTとP2X2 CT - GST（10μg）を等量のLysis Buffer中で4℃で回転して、ラットの全脳のライセートからprecleared可溶化タンパク質を100gで一晩インキュベートした。 </li><li>ビーズは5分間1000gで遠心した上清を捨てた。 </li><li>ビーズを溶解緩衝液で一回洗浄し、修正Laemliバッファーで煮沸された[4％（w / v）のSDS、10％（v / v）の2 - メルカプトエタノール、2％（v / v）グリセロール、0.004％（W / V）ブロモフェノールブルーおよび0.125 M TrisCl pHを6.8] 5分間。 </li><li>サンプルは、5分間5000gで遠心し上清は、（図4）10％SDS - PAGEにより分離した。ゲルを染色SYPROルビータンパク質ゲルを染色（製造元の指示に従って）と紫外線下で可視化した。 P2X2 CT -関連タンパク質を餌としてGST - nullを使用して回復したものと比較した。四生物学的には（四脳およびつの独立したプルダウンをすなわち）が実行された複製。 </li></ol>パート4：タンパク質の同定。 ゲル電気泳動により分離されたタンパク質をゲルから切り出し、質量分析12で同定された（注）。過程を通して粉塵がない場合は、ケラチン汚染を減らすために重要です。実験者は、常時、ヘアネット、手袋を顔のマスクを着用し、手袋を使用することなく関心のゲル地区には決して手を触れないようにしてください。 <ol><li>ダウンP2X2プルダウンから回収されたすべての可視タンパク質バンドは、きれいなカミソリの刃とさいの目に切られた（図4）を摘出した。 GST -ヌルのゲルの対応する領域は、車線プルダウンものレベルより下のタンパク質のその存在を保証するためにバンドの染色（GST - nullの餌のための特異的なバンドがまた摘出したと確認された）に関係なく同じ方法で摘出染色感度は見逃していなかった。 </li><li>ゲル片を200 50％50 mM重炭酸アンモニウムの溶液（v / v）のアセトニトリル（ACN）と室温で15分間ボルテックスチューブをインキュベートした。この洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>ゲル片は、200μlのアセトニトリル（ゲル片が縮小し、色で不透明になるはず）を追加することにより脱水した。 </li><li> Acetontrileは削​​除され、ゲル片は、約10分間speedvacで乾燥させた。 </li><li>ゲル片はその後、新たに調製した10mMのDTT/10 mMトリス（2 - カルボキシ - エチル）ピースを浸漬するのに十分な量のホスフィン塩酸塩（TCEP）の30μlのでインキュベートした。これは、56C水浴で30分間放置した。 </li><li>次のDTT溶液を50％アセトニトリル溶液とammounium炭酸で洗浄ゲルスライスに100μlの500 mM重炭酸アンモニウムに置き換えられました。 </li><li>洗浄溶液を吸引し、アセトニトリル200μlのは、ゲルを脱水に追加されました。 </li><li>アセトニトリルを除去し、100μlを調製したばかりの100mMヨードアセトアミドのソリューションは、フリースルフヒドリルをアルキル化するために追加されました。このステップでは、暗所で室温で25分間進めた。 </li><li>ヨードアセトアミド溶液を除去し、ボルテックスしながらゲル片は、2分間50％acetontrile液（pH8.0）に50 mM重炭酸アンモニウム200μlで洗浄した。この洗浄工程を繰り返した。 </li><li>洗浄溶液を除去した後、ゲル片を〜10分間speedvacによって削除された200μlのアセトニトリルと共にインキュベートした。 </li><li>このステップでゲル片は、トリプシン消化のための準備が整いました。ゲル片を30μlのトリプシン溶液（20 ng /μLのワーキング濃度）中でインキュベートしても腫れするゲルのための10分間氷上に置いた。過剰トリプシンは37℃で12〜16時間進行させた彼らが消化を通して浸漬保つために50mMの重炭酸アンモニウムと30μlのを重ねてゲル粒子を除去し、再水和した。 </li><li>五の5％溶液（v / v）のギ酸はトリプシンと逮捕消化を無効にするには追加されます。 </li><li>チューブは〜15分間攪拌し、きれいと標識0.5mlのバイアルに移していたチューブの底に液体をもたらすために簡単に遠心分離した。 </li><li>それらはちょうど簡単な遠心分離によって分離、10〜15分間2回ボルテックスで続いてカバーされたので、50％アセトニトリル中0.1％の次の30μL（v / v）のギ酸はゲル片に追加されました。このステップは、ステップ間のギ酸 - アセトニトリルを置き換えて、一回繰り返した。 </li><li>最終的な液体は、単一バイアルで除去し、すべての抽出溶液は、混合した。このボリュームはspeedvacで〜30 ULに減少した。サンプルは現在、逆相質量分析法によるナノ液体クロマトグラフィーと蛋白質の同定のための準備ができていた。この特定の例では、このステップはThermoFからOrbiトラップタンデム質量分析計で実施され他のモデルとメーカーの楽器は簡単にこれまでに説明したアプローチと相まってすることができるがisher（その高質量精度、タンパク質の検出と一般的に堅牢なオペレーティング機能のための高速なデューティサイクルのために選択）、。 </li><li>質量分析の詳細と基準について簡単に紹介されています。すべてのペプチドは逆相ナノLC（Eksigent）によって分離し、ペプチドを3μL/ minの流量でC18逆相カラム上に負荷された。移動相0.1％ギ酸と水で2％ACNでした、移動相Bは0.1％ギ酸とACNで20％の水である。ペプチドは、220 NL / minは5分以上95％Bにして、90分間にわたって50％Bに5％のBからの線形グラデーションを使用しての流速でカラムから溶出させ、そして最終的に5分間一定の95％Bを保っていた。スペクトルは、MS / MSスキャンのMSのスキャンとLTQに使用Orbiトラップとデータ依存モードで獲得されました。ペプチドはBioworksのソフトウェアパッケージに統合SEQUESTのアルゴリズムを用いてラットIPIのデータベースv.3.53に対してスペクトルを検索することによって同定された。 xcorrは≥2（+1）、≥3（+2）、≥4（+3）、およびDeltaCN&gt; 0.1：それぞれのペプチドは、以下の基準を満たしていた。タンパク質同定のために使用される全てのスペクトルは、手動で検査し、以下の二つのペプチドが同定されたときにタンパク質が受け入れられなかった。唯一のタンパク質はGST -ヌルプルダウン中に4 P2X2プルダウンのそれぞれと欠席以下の提示は、さらなる分析のために考慮された。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 P2X2受容体のサブユニットの模式図。 A.漫画は、P2X2受容体のサブユニットのトポロジを示します。細胞質ドメインはNおよびC末端で構成されています。 P2X2受容体（赤）のC末端は、アッセイをプルダウンするための餌として使用した。本研究で使用したP2X2受容体C末端のB.アミノ酸配列は。 <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> 図2。発現、精製に使用されるプロトコルのフローチャートとタイムライン、プルダウンし、タンパク質の同定。我々は、タイムラインとプロトコルの概要を示す。成体ラット脳ライセートはアッセイプルダウンに使用する直前に新しく調製した。 <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> 図3。ラット脳におけるP2X2 C末端ネットワークのバイナリプロテオーム解析の模式図。GSTビーズに結合したGST蛋白質と融合させたP2X2受容体のC末端は、アッセイをプルダウンするために使用されました。脳ライセートを調製し、タンパク質は固定化した組換えタンパク質とインキュベートした。非結合画分を溶解緩衝液で洗浄した。タンパク質は、質量分析により同定した。 <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> 図4。P2X2受容体のC末端の結合パートナーの識別。GST（青い箱）と融合受容体のC末端と相互作用推定タンパク質のスペクトルを示すSYPRO染色したゲル。単独でGST単独（黄色のボックス）とグルタチオンセファロースビーズ用コントロールレーンも表示されます。矢印は質量分析によって、さらなる分析のために摘出しユニークなバンドの例を示している。

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</ol>

イオンチャネルは、膜内在性タンパク質の主要なクラスです。彼らは選択的に形質膜を横断し、その電気化学的勾配下にイオンの移動を可能にする水の満たされた気孔が含まれています。開いた状態および閉じた状態との間のイオンチャネルのゲート。ゲーティングのステップは、P2Xリガンド依存性イオンチャネルの場合の送信機（例：ATP）によって引き起こされる、またはそれが他のタンパク質との相互作用により調節されることがあります。この10年間は、P2X受容体はATP 13に結合する方法についての我々の理解の増加を目撃していますが、P2X機能を調節するのに補助的なタンパク質の役割はあまりよく理解されたまま。このプロトコールに記載されているアプローチは、（最初​​のステップとして）細胞内のC -末端と相互作用するタンパク質を調べることによって、P2X2受容体によって形成されるシグナル伝達複合体を識別するために設計されています。 P2X2受容体シグナル伝達複合体の完全なマップは、これらの魅力的なチャネルの病態生理に多くの必要な洞察を提供します。

<table><tbody><tr><td>アセトニトリル</td><td>試薬</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>試薬</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>試薬</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素アンモニウム</td><td>試薬</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン三リン酸 (ATP)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォード試薬</td><td>試薬</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>クマシーブルー R-250</td><td>試薬</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>試薬</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール四酢酸 (EGTA)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>グルタチオンセファロース 4B ビーズ</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 (HCl)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) 培地</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム (NaF)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>試薬</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物 (PMSF)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤タブレット</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質標準</td><td>試薬</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>サルコシル</td><td>試薬</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップバイアル</td><td>器具</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO&amp;#174; Ruby タンパク質ゲル染色液</td><td>試薬</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>試薬</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>試薬</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap タンデム質量分析計</td><td>器具</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノ液体クロマトグラフィーシステム</td><td>器具</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

p2x2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

リガンド依存性イオンチャネルは神経系1でシナプスのコミュニケーションを貫く。システインループ、グルタミン酸ゲートおよびP2X受容体チャネル2：哺乳類ではリガンド依存性チャネルの3つのファミリがあります。それぞれの場合に送信機の結合はイオンが電気化学的勾配を流れに経由する細孔の開口部につながる。多くのリガンド依存性チャネルは、またダウンストリームチャネルの開口部の持続時間を超える可能性の役割5（例えば、遺伝子の調節）をシグナリングしているカルシウムイオン3、4、に透過性である。したがって、リガンド依存性チャネルは、数ミリ秒から数日までの幅広い時間スケールで信号を送ることができる。これらの重要な役割を考えるとそれはそれ自体がタンパク質、そしてどのようにこれらのタンパク質は、シグナル伝達に調整できることで規制されている方法リガンド依存性イオンチャネルを理解する必要があります。最近の研究では、多くが、すべてではありませんが、チャンネルは蛋白質シグナル伝達複合体6の一部である可能性を示唆している。この記事では、P2X2受容体細胞質ドメインのC末端の側面に結合するタンパク質を同定する方法を説明します。 P2X受容体はATP依存性陽イオンチャネルであり、7つのサブユニット（P2X1 - P2X7）で構成されています。 P2X受容体は広く彼らは興奮性シナプス伝達や神経伝達物質放出7のシナプス前促通を媒介する脳、で表されます。 P2X受容体は興奮性および非興奮性細胞に存在し、神経細胞シグナリング、炎症と心血管機能8で重要な役割を仲介している。 P2X2受容体は神経系9に豊富であり、この研究の焦点です。各P2Xサブユニットは細胞外領域7と細胞内のNおよびC末端（図1a）7によって分離された二つの膜貫通セグメント（TM1＆TM2）を持つと考えられている。 P2Xサブユニット10は、（P2X1 - P2X7）アミノ酸レベル11で30〜50％の配列相同性を示す。 P2X受容体はイオンチャネル型受容体の中で最も単純な化学量論であるのみ3つのサブユニットが含まれています。 P2X2のC -末端は120アミノ酸（図1b）を構成され、P2X2受容体のシグナル伝達複合体の一部である可能性があるという仮説を支持する、いくつかのタンパク質のドッキングのコンセンサス部位が含まれています。いくつかの機能がP2X2受容体9のない研究のC -末端に起因しているが、しかし、全長C末端を介して、このタンパク質の細胞内側に結合する分子のパートナーを説明しました。この方法を本稿では、P2X2受容体の全長C末端と相互作用するタンパク質を同定するプロテオミクスアプローチを説明します。

我々は、ATP依存性P2X2受容体の全長のC末端に結合する脳の蛋白質を識別するための単純なプロトコルを記述する。すべてのP2X受容体へのこのアプローチの拡張と体系的なアプリケーションは、P2X受容体シグナル伝達の理解につながることが期待される。

P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス

リガンド門扉型イオンチャネルは、神経系におけるシナプス伝達の基盤となっています1。哺乳類には、システインループ受容体、...

本手順は、細菌溶解後のGST融合タンパク質として設計された、プリン作動性P2X受容体またはP2X2の組換えC末端の過剰発現から始まります。精製したタンパク質をグルタチオンセロス4Bビーズとともにインキュベートし、ブラッドフォード法を用いて濃度を測定します。次に、精製したラット脳ライセート由来のタンパク質を、グルタチオンセロスビーズに結合したP2X2受容体のC末端とともにインキュベートします。P2X2受容体のC末端に結合しているタンパク質複合体を、SDS-PAGEによるゲル電気泳動および切り出しによって分離し、質量分析により同定します。こんにちは。カリフォルニア大学ロサンゼルス校生理学部のJIT K研究室のHarpringです。こんにちは。カリフォルニア大学ロサンゼルス校麻酔科学科のTom Vka研究室のSarah Walburnです。本日は、P2X2受容体のCTSを単離および精製する手順をご紹介します。私たちはこれらのタンパク質を用いて赤色脳からの同定を行い、当研究室ではこれらのタンパク質を使用して P2X2 受容体に及ぼす機能的な影響を研究しています。それでは始めましょう。P2X2 受容体の細胞質ドメインは、N末端とC末端で構成されています。プルダウンアッセイでは、P2X2受容体のC末端をベイトとして使用します。この相互作用研究に使用したP2X2受容体C末端の配列も併せて示します。P2X2受容体のC末端全長を発現させるには、一般的な分子生物学的手法を用いて、受容体C末端のコーティング配列（残基353から472）をpGEX-4T-1プラスミドに組み込みます。次に、組換えプラスミドを発現用にE. coli BBL 21株に形質転換します。組換えプラスミドを保持する細菌をLB培地にて37 °Cで培養します。培養液の600 nmにおける吸光度が0.6から0.8の間になったとき、1 mMのIPTGで培養物を誘導し、37 °Cで3時間インキュベートします。3時間のインキュベーション後、培養液から1 mLの分注液を採取し、後の解析用に保存します。残りの培養液を4 °Cで15分間、5,000 ×gで遠心分離し、上清を捨ててペレットを20 mLのsaline tris EDTAバッファーに再懸濁させます。再懸濁したペレットを50 mLファルコンチューブに移します。次に、懸濁液を5,000 Gsで15分間遠心分離してセミドライペレットを回収し、-70 °Cで一晩凍結させます。翌日、凍結したペレットを40 mLの氷冷した溶解バッファーで再懸濁し、再懸濁したペレットを氷上に置いて30分間静置します。同時に、3 mLのグルタチオンセファロース4Bビーズを準備します。まず、ビーズを20 millilitersのPBSおよび20 millilitersのTPBSで洗浄します。その後、ビーズを純粋なPBSで洗浄し、1 milliliterのPBSに再懸濁します。溶解バッファー中の細菌懸濁液を、液体窒素を用いて凍結融解させます。凍結サンプルを氷上でインキュベートして融解させ、再び液体窒素中でパージしました。この工程を3回繰り返しました。次に、凍結融解懸濁液を氷上で超音波処理します。超音波処理後、細菌懸濁液を4% Triton X-110、millimolar magnesium sulfate、およびtwo millimolar ATPを含む溶液と共に、氷上で30分間インキュベートします。次に、溶解物を20,000 Gs、4°Cで15分間遠心分離し、上清を回収します。ペレットを廃棄する前に、細胞質および膜中のタンパク質を分析するため、上清を含むペレットの少量をサンプルとして採取します。上清をビーズと共に4°Cで1時間または一晩インキュベートします。インキュベーション後、ビーズを500 Gsで5分間遠心分離します。上清の大部分は廃棄しますが、未結合タンパク質の分画を代表する少量のサンプルを保存しておきます。ペレット化したビーズを25 mLのTPBSで5回洗浄し、洗浄コントロールとして各洗浄液を少量ずつ保存します。最後に、ビーズをPBSで再懸濁して50% w/vのスラリーとし、4°Cで保存します。タンパク質濃度は、メーカーの指示に従ってブラドフォード法を用いて推定することができ、500 µg/mLになると予想されます。全脳ライセートからP2X2 CT GSTの結合パートナーを同定するために、グルタチオンコーティングビーズ上に固定化したCT GSTをベイトとし、コントロールとしてプルダウンアッセイを行います。ここでは、ビーズに結合させたGST単体をベイトとして使用します。これを以後、GST Knoll Rat Brainin溶出液と呼びます。GST融合タンパク質結合アッセイは、標準的なプロトコルと溶解バッファーを用いて調製し、タンパク質濃度はブラッドフォード法により15 mg/mLと推定されました。アッセイを開始する前に。解凍した脳ライセートをGSTビーズとともにインキュベートした後、30 µLのGSTビーズを用いて4°Cで1時間インキュベートし、プリクリアリングを行います。ビーズを4°Cで1000 ×g、10分間遠心分離します。上清を回収し、その一部をコントロールとして保存しておきます。次に、事前洗浄済みの可溶化タンパク質が100 µg含まれるライセートの量を算出し、この量のライセートを10 µgのGST結合ビーズおよび10 µgのP two X two CT GST結合ビーズと混合します。溶解バッファーを用いて全量を200 µLに調整します。ライセートとビーズを、4 °Cのローテーターで一晩インキュベートします。翌日、ビーズを1000 Gsで5分間遠心分離し、上清を捨てる。1 mLの溶解バッファーでビーズを3回洗浄する。その後、調整済みの50 µLの溶解バッファーをビーズに加え、このバッファー中でビーズを5分間煮沸する。加熱したサンプルを5,000 GSで5分間遠心分離し、得られた上清を10% SDS-PAGEで電気泳動します。P two X two CT結合タンパク質を、GST Nolaベイトを用いて回収したタンパク質と比較します。分析の最終的な重要ステップは、ここから質量分析による同定のために、ゲルから分離したタンパク質を回収することです。ケラチンによる汚染を低減させるため、全工程を通じて塵埃がない状態を維持することが極めて重要です。まず、清潔なカミソリを用いてゲルからバンドを切り出します。次に、各バンドを3つの小さなセクションに細切し、GSTのゲルの対応する領域に基づき、ラベルを貼ったマイクロ遠心チューブにそれぞれ入れてください。バンドの染色にかかわらず、プルダウンなしのレーンも同様に切り出してください。染色感度を下回るレベルに存在するタンパク質を見逃さないようにするため、ゲルの断片を200 µLの50 mM炭酸水素アンモニウムと50% v/v アセトニトリルと混合し、室温で15分間チューブをボルテックスします。ボルテックスした後、洗浄液を除去し、この操作を繰り返します。最後の洗浄液を除去し、200 µLのアセトニトリルを加えてゲル片を脱水させます。ゲル片は収縮し、色が不透明になります。2分以内にアセトニトリルを除去し、ゲルの断片を乾燥させます。スピードバキュームで10分間乾燥させた後、ゲルの断片を、調製直後の10 millimolar DTTおよび10 milli molar TEP溶液中でインキュベートします。溶液の量（通常は約30 microliters）は、ゲルの断片が完全に浸るのに十分な量にする必要があります。ゲル片を還元溶液に入れ、56 °Cのヒートブロックで30分間還元させます。次に、DTT TEP溶液を除去し、代わりに洗浄液（500 mM 重炭酸アンモニウム含有 50% アセトニトリル）100 µLを加え、ボルテックスミキサーで10分間攪拌します。ボルテックス処理後、重炭酸アンモニウム洗浄液を吸引して除去し、ゲル片を脱水させるためにアセトニトリル 200 µLを加えます。ゲル片は2分以内に収縮し、色が不透明になります。アルキル化の後、遊離したスルヒドリル基を処理するため、アセトニトリルを、調製直後の100 mM IDO Acetamide溶液 100 µLに置換します。この混合物を室温・暗所で25分間インキュベートします。インキュベーション後、IDO Acetamide溶液を除去し、50 mM 重炭酸アンモニウムおよび 50% アセトニトリル 200 µLを用いて、ボルテックスミキサーで5分間洗浄します。この洗浄工程をもう1回繰り返します。最後の洗浄液を除去し、ゲルの断片を200 µLのアセトニトリル中で10分間インキュベートします。アセトニトリルを除去し、スピードバックを用いてサンプルを乾燥させます。このステップで、ゲル片はトリプシン消化の準備が整った状態になります。作動濃度約 20 ng/µL のトリプシン溶液を 30 µL 加え、氷上で 10 分間インキュベートします。ゲル片が十分に膨潤している必要があります。過剰なトリプシン溶液を除去し、再水和したゲル粒子を 30 µL の 50 mM 重炭酸アンモニウムに浸します。37 °C で 12 〜 16 時間消化を行い、その後 5 µL の 5% ギ酸を加えてトリプシンを不活化し、消化を停止させます。次に、チューブを15分間ボルテックスします。ボルテックス後、チューブを短時間遠心して液体をチューブの底に集め、消化後のペプチドを含むこの溶液を、ラベルを貼った清潔な0.5 mLチューブに移します。次に、0.1%ギ酸を含む50%アセトニトリル抽出液をゲル片に約30 µL加え、10〜15分間ボルテックスします。この抽出液を新しい0.5 mLチューブに加えます。この手順を繰り返します。抽出液を新しいハーフミルチューブに移し、一晩消化液と2つの抽出液を含むハーフミルチューブをスピードバックで約 30 µL まで濃縮します。これで、このペプチド溶液を LC-MS/MS で分析できる状態になります。逆相ナノLC（C18逆相カラム）を用いてタンパク質を分離し、MSスキャンにはOrbitrapを、MS/MSスキャンにはLTQを使用したデータ依存モードでスペクトルを取得する。Bioworksソフトウェアパッケージに統合されたSequestアルゴリズムを用いてデータをラットIPIデータベースで検索し、タンパク質を同定する。その後、4つのサンプルの各繰り返し分に存在し、かつGSTでは消失しているタンパク質のスペクトルのみを手動で検査する。プルダウンが認められなかったものは、以降の解析から除外すること。ここでは、P2X2受容体のC末端と相互作用すると推定される一連のタンパク質を示すCipro染色ゲルを示します。青色のボックスで示されているのはGST融合タンパク質であり、黄色のボックスで示されているのはGST単独のコントロールレーンです。また、グルタチオン S-トランスフェラーゼ単独の結果も示されています。矢印は、質量分析によるさらなる解析のために切り出されたユニークなバンドの例を示しています。これまで、P2X2受容体のCTOの発現および精製方法について説明しました。また、プルダウンアッセイの実施方法および相互作用タンパク質の同定方法についても説明しました。この手順を行う際は、サンプルへのケラチン混入を減らすために、手袋とヘアネットを着用することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

細胞透過性架橋剤DSP [ジチオビス -...

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

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低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

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このプロトコルは、細胞環境において受容体に結合するアデニンヌクレオチドをリアルタイムで測定する方法を提示する。結合は、トリニトロフェニルヌクレオチド誘導体と非標準的な蛍光アミノ酸で標識されたタンパク質との間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)として測定されます。...

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

MRGPRX2受容体を介してマスト細胞を活性化できる短いペプチドのライブラリーを生成する技術が記載されている。関連する技術は、容易で安価であり、他の細胞受容体に拡張することができる。...

工学的HEK細胞を用いたMRGPRX2を活性化するペプチドのスクリーニング

ここでは、化学プローブと質量分析を使用して、天然細胞および組織からの疾患特異的タンパク質間相互作用の捕捉と同定を可能にするプロトコルを提示します。得られた相互作用データセットは、専用のWebベースのプラットフォームを介して分析され、動的なネットワーク機能不全と疾患に関連する経路の変化を明らかにします。...

疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

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学ぶP2X2受容体C末端と相互作用する脳タンパク質を特定するプロテオミクス手法。GST融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイと質量分析により、ラット脳ライゼートから結合タンパク質を同定し、P2X受容体シグナル伝達の理解を深める。

P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス

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