の調製ショウジョウバエ胚
March 13th, 2009
ライブイメージング解析のためのショウジョウバエの胚を作製する、シンプルで安価な、そして効果的な方法が提示される。我々のプロトコルは、湿度およびガス交換を提供し、ショウジョウバエの胚を圧縮しません。このメソッドは、実体顕微鏡や正立複合顕微鏡を用いてショウジョウバエの胚のGFPベースのライブイメージングに適しています。
Hello.My 名前はブルース・リードです。私は、カナダのオンタリオ州ウォータールーにあるウォータールー大学の生物学部の助教授です。今日、このビデオアーカイブを作成して、ライブイメージング分析のために柔らかい胚を準備するために開発した新しい技術を文書化しています。
ショウジョウバエの胚を用いたライブイメージング解析を行う際、タイムラプス撮影を頻繁に行っており、これが数時間続くこともあります。したがって、胚を脱水症や低酸素症から保護する技術を持つことが重要です。さらに、胚の圧迫を回避する技術も開発したいと考えています。
取り付けでは、私たちが考え出したのは、吊り下げ式の準備と呼ばれる非常にシンプルで安価で効果的な方法です。吊り下げ式ドロップ調製物は、実体顕微鏡や直立型複合顕微鏡を用いた胚のライブイメージング解析に適しています。このタイムラプス動画は、ハンギングドロッププロトコルを使用して調製され、タイムラプス蛍光顕微鏡で画像化された8つのGFP発現胚を示しています。
このイメージングシーケンスは、4時間を超える経過時間を表しています。動きの始まりは、これらの胚が生存可能な状態にあることを示しています。ここでは、Hangingドロッププロトコルの実行方法について、ステップバイステップで詳しく説明します。
胚は、標準的なブドウジュース、卵、またはプレートに集められます。Fly maxの科学機器から自動化されたdsof FLA卵コレクターを使用して、自動コレクターは、所定の発生段階で胚の同期コレクションを提供します。胚の手の装飾に備えて、顕微鏡スライドに両面粘着テープを貼り付け、テープの裏地をはがします。
吊り下げ式のドロッププロトコルには、厚さ5mmのポリカーボネートプラスチックのシートから作られたカスタムチャンバーが必要です。シートを顕微鏡スライドの寸法にカットし、ローターで3ミリメートルの深さのくぼみを作ります。ライブイメージングチャンバーの加湿は、チャンバーに合うようにカットされ、蒸留水と結合された組織片を使用して達成されます。
Halo Carbonオイルは、ガス透過性があり、光学的に透明であるため、協調したショウジョウバエの胚のライブイメージングに最適です。ハロカーボンオイルシリーズ700とシリーズ56を1対1の比率で混合すると、ショウジョウバエの胚を扱うのに適した粘度が得られます。胚は、宝石商の鉗子または非常に細い絵筆を使用して、ブドウジュース寒天プレートから収集できます。
胚は互いにくっつき、鉗子の先端にくっつきます。それらは簡単に塊、胚の塊に集められます。鉗子に付着します。
チップは、事前に準備したデコレーションスライドのテープの粘着性のある表面にそっと下ろされます。実体顕微鏡で胚を見ながら、鉗子の側面で胚を優しくつつくか、なでます。内側のビリン膜を破裂さずにコロネを壊す必要があります。
これには、安定した手の忍耐とある程度の練習が必要です。外側のコロンが破裂すると、脱塩素化された胚が鉗子に付着する傾向があります。脱塩素胚がテープの粘着面に接触しないように注意してください。
脱塩素化胚をハローに素早く転写したテープからそれを取り出すことは非常に難しい場合があります。カーボンオイルがカバースリップに滴ります。ハローキャロンオイルドロップの表面に鉗子の先端を触れることで、これを近くに置いておくことをお勧めします。
胚が鉗子から油に取り除かれると、胚の移動は、次の胚を塩素処理する前に、黒い背景と斜めの角度に設定された光ファイバー照明源を使用して肉眼で確認できます。ハローカーボンオイルの浮力のために、鉗子からオイルを拭くと便利です。配位した胚は油滴の表面に浮かんでいます。
胚を油滴の底に押し込み、吊り下げ式のドロッププロトコルでカバースリップをすばやく反転させることで、胚の位置と向きを制御できます。ライブイメージングチャンバーの加湿ウェルにカバースリップを反転させます。カバースリップが反転すると、胚はカバースリップの下側に寄りかかって休むことになります。
胚の静止位置は、実体顕微鏡で確認することができます。満足できない場合は、手順を繰り返すことができます。胚が所望の位置に着いたら、カバースリップをテープでライブイメージングチャンバーに固定します。
チャンバーは、テープに穴を開けることによって換気されます。これで、胚を画像化する準備が整いました。
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概要
この記事では、ショウジョウバエの胚を生体イメージング分析のために準備する簡単で効果的な方法を紹介します。このプロトコルは、適切な湿度とガス交換を確保しながら胚の圧縮を防ぎ、GFPベースのイメージングに適しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- イメージング技術
背景
- ショウジョウバエの胚の生体イメージング分析は、通常タイムラプス撮影を用いて行われます。
- 胚は長時間のイメージングセッション中に脱水と低酸素症に対して脆弱です。
- 胚の圧縮を避ける技術は、正確なイメージングに不可欠です。
- GFPベースのイメージングは最適な結果を得るために特定の条件を必要とします。
研究の目的
- ショウジョウバエの胚を脱水から保護する方法を開発すること。
- イメージング中に適切なガス交換を確保すること。
- 生体イメージング中に胚の圧縮を避けること。
使用した方法
- 生体イメージングのためのショウジョウバエの胚の準備。
- イメージングセッション中の湿度制御の実装。
- イメージングのための立体顕微鏡または直立複合顕微鏡の使用。
- GFPベースのイメージング技術の適用。
主な結果
- この方法は胚の湿度とガス交換を効果的に維持します。
- 胚は圧縮されずに、より良いイメージング品質を可能にします。
- GFPベースのイメージングは長期間にわたって明瞭な結果をもたらします。
- この技術は研究者にとってシンプルでコスト効果があります。
結論
- この方法はショウジョウバエの胚の生体イメージングの品質を向上させます。
- この分野の研究者に信頼できるアプローチを提供します。
- このプロトコルは様々な研究室で容易に採用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Live imaging of model organisms is critical for target validation and phenotypic screening in early discovery. The hanging drop protocol addresses key limitations of dehydration, hypoxia, and mechanical compression that compromise embryo viability and data quality during extended time-lapse imaging. By enabling uncompressed, physiologically relevant imaging of Drosophila embryos, the method supports mechanistic de-risking of genetic and pharmacological interventions in a scalable, cost-effective format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic regulation in dynamic processes such as tissue morphogenesis and cell adhesion without mechanical artifacts from compression.
- Operational Value: Maintains embryo viability for over four hours, supporting longitudinal observation of gene function and pathway dynamics.
- Predictive Value: Reduces false positives from stress-induced phenotypes, improving confidence in target validation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for GFP-based live imaging that minimizes environmental variability.
- Operational Value: Uses low-cost, accessible materials (halocarbon oil, polycarbonate chamber, tape) suitable for high-throughput adaptation.
- Assay Readiness: Leverages embryonic buoyancy in oil to maintain positional stability, reducing drift and improving signal consistency in time-lapse acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports imaging of conserved developmental processes relevant to human disease models, facilitating cross-species extrapolation.
- Mechanistic De-risking: Allows observation of cellular behaviors (e.g., cell death, adhesion) under physiological conditions, improving predictive confidence for downstream preclinical models.
- Disease-Relevant System: Drosophila embryos expressing disease-associated GFP reporters can be used to monitor pathway modulation in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
The hanging drop protocol fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, particularly for assays requiring dynamic, uncompressed imaging of genetically encoded reporters.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct visualization of gene knockdown or overexpression effects on embryonic morphogenesis.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved fluorescence readouts essential for comparing compound or genetic condition effects.
- Analytics: Generates stable, high-quality timelapse data suitable for morphometric analysis and phenotypic quantification.
- Translational Research: Connects genetic findings in Drosophila to conserved pathways, informing target selection for vertebrate models.
- Enterprise Reuse: The protocol’s simplicity and low cost enable broad adoption across teams as a standardized imaging preparation method.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by eliminating compression artifacts and maintaining physiological conditions during imaging.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized humidity control, gas exchange, and embryo handling.
- Strategic Value: Reduces biological noise in screening campaigns, increasing assay sensitivity and reducing false hit rates.
- Portfolio Impact: Enables more reliable go/no-go decisions in target validation by providing higher-fidelity phenotypic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila embryo handling and dechorionation techniques.
- Depends on access to halocarbon oils and basic microfabrication tools for chamber preparation.
- Necessitates standardization of embryo age, genotype, and mounting consistency across users.
- Adaptation to other model systems may require optimization of oil buoyancy and chamber geometry.
- Practical limitation: Best suited for embryos that remain buoyant in halocarbon oil; not applicable to denser or adhesive cell types.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
