の調製ショウジョウバエ胚

こんにちは。ブルース・リードです。私はカナダ、オンタリオ州ウォータールーにあるウォータールー大学生物学部の助教授を務めています。本日は、ライブイメージング解析に向けたソフトリー胚の調製のために私たちが開発した新しい手法を記録するため、このビデオアーカイブを作成しています。

ショウジョウバエ胚を用いたライブイメージング解析を行う際、タイムラプス撮影を頻繁に使用しますが、これは数時間に及ぶことがあります。したがって、胚を脱水および低酸素状態から保護する技術を確立することが重要です。さらに、胚への圧迫を完全に回避できる手法の開発も目的としています。

マウンティングにおいて、私たちは「ハンギングドロップ法」と呼ぶ、非常にシンプルで安価かつ効果的な手法を考案しました。ハンギングドロップ法は、実体顕微鏡や正立型複合顕微鏡を用いた胚のライブイメージング解析に適しています。このタイムラプス動画では、ハンギングドロップ法で調製し、タイムラプス蛍光顕微鏡で撮影した8つのGFP発現胚を示しています。

このイメージングシーケンスは、4時間以上の経過時間を表しています。動きが出始めたことは、これらの胚が生存可能な状態にあることを示しています。それでは、ハンギングドロップ法の詳細なステップバイステップの手順について説明します。

胚は、標準的なブドウジュース、卵、またはプレート上で回収します。Fly max scientific equipment社製の自動dsof FLA卵回収装置を使用することで、あらかじめ設定した発生段階での胚の同期的な回収が可能になります。胚の手動回収の準備として、顕微鏡スライドに両面テープを貼り付け、テープの剥離紙を取り除きます。

ハンギングドロップ法では、厚さ5 mmのポリカーボネート製プラスチックシートで作製したカスタムチャンバーが必要です。シートを顕微鏡スライドガラスの寸法に切り出し、ローターを用いて深さ3 mmのくぼみを作製します。ライブイメージングチャンバーの加湿は、チャンバーのウェルに合うようにカットし、蒸留水で濡らしたティッシュを用いて行います。

Halo Carbon oilはガス透過性があり光学的に透明であるため、ショウジョウバエ胚のライブイメージングに適しています。Halo Carbon oil series 700とseries 56を1対1の比率で混合すると、ショウジョウバエ胚の操作に適した粘度になります。胚は、精密ピンセットまたは非常に細い絵筆を用いて、ブドウジュース寒天プレートから回収できます。

胚は互いに、またピンセットの先端に付着します。そのため、胚は容易に塊となり、塊状に集まってピンセットに張り付きます。

あらかじめ準備したデコレーションスライド上のテープの粘着面に、チップをゆっくりと下ろします。実体顕微鏡で胚を確認しながら、ピンセットの側面で胚を軽く押すか、あるいは撫でるように動かします。この際、内側のガラス膜（vilin membrane）を破らずに、卵膜（corone）のみを破る必要があります。

この操作には、手の震えを抑えること、忍耐、そしてある程度の練習が必要です。外殻が破れた後、脱塩素化された胚はピンセットに付着しやすくなります。脱塩素化された胚がテープの粘着面に触れないよう注意してください。

テープから迅速に回収することは非常に困難であるため、脱塩素化された胚をハロー（halo）へ移します。カバーガラス上にカーボンオイルを滴下しておきます。これを近くに用意しておくのが得策です。ピンセットの先端をハロー上のカーボンオイル滴に触れさせます。

次の胚を処理する前に、黒色の背景と斜めに設定したファイバー照明を用いて、胚が鉗子からオイル転送液へと移動したことを肉眼で確認してください。ハロカーボンオイル内では鉗子が浮力を持つため、鉗子からオイルを拭き取っておくと便利です。調整された胚は、オイル滴の表面に浮遊します。

ハンギングドロップ法において、胚をオイルドロップの底に押しやり、カバーガラスを素早く反転させることで、胚の位置と向きを制御することができます。加湿されたライブイメージングチャンバーのウェル上でカバーガラスを反転させます。カバーガラスを反転させると、胚はカバーガラスの下面に接して静止します。

胚の静止位置を実体顕微鏡下で確認します。十分でない場合は、この手順を繰り返します。胚が目的の位置に配置されたら、カバーガラスをテープでライブイメージングチャンバーに固定します。

テープに穴を開けて、チャンバーを換気させます。これで、胚をイメージングする準備が整いました。