Name: の調製ショウジョウバエ胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶショウジョウバエ胚のハンギングドロッププロトコルを用いたライブイメージング調製法。脱水と低酸素を防ぎ、圧迫を回避してGFPイメージングを可能にする簡便で効果的な技術です。

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我々は感謝ディスカバリーグラントだけでなく、研究ツールとカナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）からインストゥルメントの助成金を介してBHRにサポートを認めます。我々はまた、H.織田と例のライブイメージングシーケンスで使用された遺伝資源を提供するためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターを認めます。

準備<ol><li>標準的なブドウジュース寒天プレート4の胚を収集する。それは自動化されたショウジョウバエの卵コレクタ（Flymax科学機器（株））を使用すると便利です。同期を使用すると、胚のコレクションが必要な発育段階で胚の適切な数値を得るために実行しなければならないdechorionationsの数を減らす予定上演。 </li><li>顕微鏡のスライドに両面テープの一部を添付してdechorionationのスライドを準備する。テープから裏紙を取り外します。 </li><li>チャンバーのウェル中に収まるように組織片を切断することにより、ライブイメージング室を準備します。ウェル内の組織を配置し、蒸留水で濡らす。 </li><li> 1:1の比率でハロカーボンオイル（ハロカーボン製品社）粘度のシリーズ700とシリーズ56を混ぜる。混合物は、保存され、無期限に使用することができます。 </li><li>カバースリップ（22 X 40ミリメートル、第2号）の表面にハロカーボンオイルのいくつかの小滴を置きます。ボリュームは重要ではないが、20〜40μlの順で指定する必要があります。 </li></ol>手順<ol><li>実体顕微鏡の助けを借りて、どちらかの宝石商のピンセット（5番）や非常に細かいペイントブラシを使用して、グレープジュース、寒天プレートから胚を回収する。胚は、相互に及び鉗子&quot;のヒントに固執する傾向があり、それらは簡単にまとまって集まっている。 </li><li>実体顕微鏡の助けを借りて、軽くdechorionationのスライド上のテープの表面に鉗子の先端に付着した胚の塊を下げる。 </li><li>再び実体顕微鏡を使用して、静かに内側の卵黄膜（卵黄膜が破裂している場合胚がバーストされる）を破裂させずに外側のワックス状の絨毛膜を開いて打開するために鉗子の面で胚を揺らす事や脳卒中。 </li><li>外側の絨毛膜が破裂した後は、絨毛膜から胚をいじめる。dechorionated胚は、鉗子の表面に付着する傾向があります。テープの表面にdechorionated胚を触れないように注意してください。 </li><li>とすぐに胚がdechorionatedなので、すぐにカバースリップ上にハロカーボンオイルの予め調製したドロップに移す。ハロカーボンの油滴の表面にdechorionated胚を運ぶ鉗子の先端をタッチして - これは石油に鉗子から胚をdislodges。 </li><li>油滴の胚の転送を確認してください。これは、黒い背景上で動作し、斜めの角度で設定された光ファイバー照明の光源を使用していることが肉眼で行うことができます。 </li><li>別の胚をdechorionateを試みる前に、鉗子から任意の油をきれいに。油でコーティングされた鉗子はdechorionationをより困難に、絨毛膜の表面上に小さいものがある。 </li><li> Dechorionated胚は、ハロカーボンのオイルで好調です。鉗子や絵筆を使用し、実体顕微鏡を通して見ながら、油滴の底面に胚を押してお好みのポジションに配置。 </li><li>すぐにライブイメージングチャンバーの優に超えるカバースリップを反転。胚は、所望の方向にカバースリップに対して休んでいることを確認してください。油で彼らの浮力のために、胚はカバースリップの下面に対してフロートします。テープでライブイメージング室にカバースリップを修正。テープがカバースリップの端とライブイメージングチャンバーのウェルの端との間のギャップにまたがる地域にテープで穴をカットすることによりチャンバーを換気する。 </li><li>直立蛍光顕微鏡または蛍光実体顕微鏡は、現在のイメージ胚をするために使用することができます。 </li></ol>

<ol><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li>
<li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li>
<li>Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+Ep+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).</li>
</ol>

我々は、ハンギングドロッププロトコルを呼び出すのライブイメージング解析、のために、ショウジョウバエの胚を作製する新しい方法を説明します。残念ながら、それは倒立顕微鏡を扱う場合ハンギングドロッププロトコルを使用することはできません。このケースで挟み込む技術が（上記の抽象的で説明したように）使用され、胚の圧縮は、懸念のままする必要があります。 セルの形状とサイズは形態形成運動に関連付けられている力を計算するために測定される実験では、正立顕微鏡やハンギングドロッププロトコルの使用は減少し胚の圧縮に望ましいおかげです。また、ハンギングドロッププロトコルを使用して減少した胚の圧縮は、挟む技法は平らな表面を提示するのに対し、胚のラウンド、歪みのない表面を提示の結果を持っています。共焦点顕微鏡を使用する場合、それは、したがって、挟持方法対ハンギングドロッププロトコルを使用している場合（スタックごとにさらに多くのスライス）より広いZ -スタックを収集することが必要です。 Z -スタックあたりのスライス数の増加は、しかし、レーザーの励起に関連するすべての写真毒性または光退色としてだけでなく、収集時間...

顕微鏡スライド、カバーグラス（22 × 40ミリメートル、2号）、両面テープ、宝石商の鉗子（デュモンスタイル第5号：標準装備し、ハンギングドロッププロトコルを使用して、ライブイメージングのために胚を作成するために必要な材料は、以下の項目が含まれています）、ハロカーボンオイルシリーズ56とシリーズ700（ハロカーボン製品社）、ユーティリティナイフまたは単一のエッジのかみそりの刃、ティッシュペーパー、はさみ、蒸留水、汎用テープ、20〜40μlを配信するための適切なピペット。ライブイメージングプロトコルはまた、カスタムメイドのライブイメージングチャンバーを必要とします。この値は5 mmは標準的な顕微鏡スライド（75 × 25 mm）の寸法にポリカーボネートプラスチックシートを考えるとスライド（20 X 55 mm）を3mmの深いうつ病を作成するにはローターを使って切断することによって調製される。実体顕微鏡（顕微鏡を解剖）と光ファイバ照明用光源へのアクセスも必要です。

の調製ショウジョウバエ</emハンギングドロッププロトコルを使用してライブイメージングのための>胚

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

緑色蛍光タンパク質（GFP）をベースボックスに追加ライブイメージングは​​、そのような組織の形態形成、細胞間接着、または細胞死などの動的過程の遺伝的調節を研究するための強力な手法です。 GFPを発現するショウジョウバエの胚は、容易にどちらかの立体または共焦点顕微鏡を用いて画像化している。あらゆるライブイメージングプロトコルの目標は、このような脱水や低酸素などの有害な影響を最小限に抑えることです。ライブイメージング解析のためのショウジョウバエの胚を調製するための以前のプロトコルは、ハロカーボンのオイルでdechorionated胚を配置し、ハロカーボンガス透過膜とカバーの間にそれらを挟む関与している<sup&gt; 1月3日</sup&gt;。この方法で取り付け胚を通じて、圧縮の導入は、形態形成のあらゆる生体力学ベースの解析のために望ましくない合併症を表します。我々はハンギングドロッププロトコルを呼び出す私たちの方法、、ライブイメージング中の胚の優秀な生存率の結果と胚が圧縮されている必要はありません。簡単に言えば、ハンギングドロッププロトコルは、順番に、湿度の高い室以上の位置に固定されるカバーガラス、から中断されているハロカーボンオイルの滴で胚の配置を含む。ガス交換を提供し、脱水を防ぐことに加えて、この配置は、タイムラプス買収時の位置から流出することを防止するためにハロカーボンのオイルの胚の浮力を利用しています。このビデオでは、ハンギングドロッププロトコルを使用して、ライブイメージングのためのショウジョウバエの胚を収集して準備する方法について詳細に説明します。このプロトコルは、実体顕微鏡あるいは直立化合物の蛍光顕微鏡を用いたイメージングdechorionated胚に適しています。

ライブイメージング解析のためのショウジョウバエの胚を作製する、シンプルで安価な、そして効果的な方法が提示される。我々のプロトコルは、湿度およびガス交換を提供し、ショウジョウバエの胚を圧縮しません。このメソッドは、実体顕微鏡や正立複合顕微鏡を用いてショウジョウバエの胚のGFPベースのライブイメージングに適しています。

緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いたタイムラプス生細胞イメージングは、...などの動的プロセスの遺伝学的調節を研究するための強力な手法です。

こんにちは。ブルース・リードです。私はカナダ、オンタリオ州ウォータールーにあるウォータールー大学生物学部の助教授を務めています。本日は、ライブイメージング解析に向けたソフトリー胚の調製のために私たちが開発した新しい手法を記録するため、このビデオアーカイブを作成しています。ショウジョウバエ胚を用いたライブイメージング解析を行う際、タイムラプス撮影を頻繁に使用しますが、これは数時間に及ぶことがあります。したがって、胚を脱水および低酸素状態から保護する技術を確立することが重要です。さらに、胚への圧迫を完全に回避できる手法の開発も目的としています。マウンティングにおいて、私たちは「ハンギングドロップ法」と呼ぶ、非常にシンプルで安価かつ効果的な手法を考案しました。ハンギングドロップ法は、実体顕微鏡や正立型複合顕微鏡を用いた胚のライブイメージング解析に適しています。このタイムラプス動画では、ハンギングドロップ法で調製し、タイムラプス蛍光顕微鏡で撮影した8つのGFP発現胚を示しています。このイメージングシーケンスは、4時間以上の経過時間を表しています。動きが出始めたことは、これらの胚が生存可能な状態にあることを示しています。それでは、ハンギングドロップ法の詳細なステップバイステップの手順について説明します。胚は、標準的なブドウジュース、卵、またはプレート上で回収します。Fly max scientific equipment社製の自動dsof FLA卵回収装置を使用することで、あらかじめ設定した発生段階での胚の同期的な回収が可能になります。胚の手動回収の準備として、顕微鏡スライドに両面テープを貼り付け、テープの剥離紙を取り除きます。ハンギングドロップ法では、厚さ5 mmのポリカーボネート製プラスチックシートで作製したカスタムチャンバーが必要です。シートを顕微鏡スライドガラスの寸法に切り出し、ローターを用いて深さ3 mmのくぼみを作製します。ライブイメージングチャンバーの加湿は、チャンバーのウェルに合うようにカットし、蒸留水で濡らしたティッシュを用いて行います。Halo Carbon oilはガス透過性があり光学的に透明であるため、ショウジョウバエ胚のライブイメージングに適しています。Halo Carbon oil series 700とseries 56を1対1の比率で混合すると、ショウジョウバエ胚の操作に適した粘度になります。胚は、精密ピンセットまたは非常に細い絵筆を用いて、ブドウジュース寒天プレートから回収できます。胚は互いに、またピンセットの先端に付着します。そのため、胚は容易に塊となり、塊状に集まってピンセットに張り付きます。あらかじめ準備したデコレーションスライド上のテープの粘着面に、チップをゆっくりと下ろします。実体顕微鏡で胚を確認しながら、ピンセットの側面で

the-preparation-drosophila-embryos-for-live-imaging-using-hanging

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JoVE Journal

Biology

生物学

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

ここでは、ステンドグラスの取り付けプロトコルを提示...

の直立イメージングショウジョウバエ胚

個々の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>エッグチェンバース

SACは、姉妹染色分体の有糸分裂分離を監視し、その信号を開始する場所を動原体である。方法は、染色体の動きと動原体タンパク質とその調整のいずれかの採用と離職率を可視化するために記述されている...

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

このビデオでは、生きたショウジョウバエの胚に試薬を送達するマイクロインジェクションの方法を説明しています。研究者は、この方法を使用して、胚発生の初期段階で核酸やタンパク質などの外因性化合物を導入できます。この注目のプロトコールは、任意の可溶性試薬(ここではライブイメージング実験用の蛍光タンパク質)の注入手順の設定方法と実行方法を示しています。...

ショウジョウバエの生胚へのマイクロインジェクション:発生中の胚への試薬の早期送達

ここでは、アポトーシス細胞のクリアランスのダイナミクスを研究するための効果的な方法を説明...

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。...

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

ここでは、ショウ ジョウバエ...

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ...

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

学ぶショウジョウバエ胚のハンギングドロッププロトコルを用いたライブイメージング調製法。脱水と低酸素を防ぎ、圧迫を回避してGFPイメージングを可能にする簡便で効果的な技術です。

の調製ショウジョウバエ胚

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