グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法
March 2nd, 2009
GFP融合タンパク質は、広く共焦点顕微鏡による細胞小器官を可視化するために使用されます。しかし、細胞小器官の形態に影響を与える変異のスクリーニングは通常、個々の変異誘発を必要とし、時間のかかる作業です。ここで、我々は同時に、酵母のほぼ5000の非必須遺伝子のオルガネラ- GFPマーカーを組み込む方法を示しています。
この手順は、最初に細胞のラインを増殖させ、次にアレイを新しいプレートにピンアウトすることにより、CP 1 GFPのアレイを調製することから始まります。同時に、DMA の新しいコピーを準備します。次に、ACP one GFPアレイをDMAにメイトして二倍体を選択し、胞子形成培地上で胞子形成します。
5日後、筋腫の子孫はLRK培地で発芽し、その上でMAT Aハプロのみが成長します。さらに2回の選抜ラウンドを通じて、ACP 1つのGFPと、缶マイシンでノックアウトされた遺伝子の両方を持つハプロ細胞を回収します。最後に、プレートから直接個々の菌株を取り出し、共焦点顕微鏡でミトコンドリアの形態を観察することができます。
こんにちは、ブリティッシュコロンビア大学生命科学研究所の細胞発生生物学科の法律研究室のチャップTです。こんにちは、同じくローンラボのジェシー・チャオです。本日は、ロボットシステムを使用して酵母のさまざまな変異体背景にGFPマーカーを組み込むためのハイスループットな方法をご紹介します。
私たちの研究室では、この手順を使用して、D、小胞体、ミトコンドリアなどのオルガネラの形態を研究しています。それでは始めましょう。このプロトコルでは、2つの異なる酵母株を使用します。
A CP one GFPは、プラスミドPKT1 28を用いたA PCR媒介相同組換えにより作製されるACP oneのC末端GFPタグを有する株である。ひずみの背景は BY 7 0 4 3 です。また、非必須遺伝子の約5, 000の欠失変異体の配列であるDMA株または欠失変異体アレイも使用します。
これらの非必須遺伝子はすべて、G 4 18でノックアウトされました。アレイのひずみバックグラウンドは BY 47 41 です。ACP One GFP細胞のAlanの増殖を開始するには、ヒスプレートに5ミリリットルのACP One GFP培養液を一晩
注ぎます。プレートを炎または生物学的ヒュームフードで十分に乾かします。乾いたら、プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、ロボットを使用してA CP one GFP株をプレートあたり1,536コロニーに配列します。
同時に、YPDG 4 18プレートにレプリカピンで固定することにより、DMAの新しいコピーを準備します。その後、菌株が成長した後、プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。A CPをDMAと1つのGFP株にしました レプリカピン留めしてYPDプレート上にコロニーを重ね、プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。
レプリカプレートをインキュベーションした後、SDヒスGの下のコロニーに18枚のプレートを4枚配置して配置細胞を選別するために、プレートを摂氏30度で一晩インキュベートする。胞子形成と発芽を開始するために、最初のレプリカプレート、YPDG 4 18プレート上の二倍体は、次のステップで胞子形成の効率を高めます。1日のレプリカプレートのために摂氏30度でインキュベートした後、二倍体は、減らされたレベルの炭素と窒素源を含む強化された胞子形成培地に付着し、筋胞子の形成を誘導します。
次に、プレートを摂氏25度で最低5日間インキュベートします。インキュベーション後、マットを発芽させ、LRK培地にコロニーをレプリカで配置することにより、近視の子孫です。この培地は、胞子からタブロイド細胞の発芽を誘導し、プレートを摂氏30度で2日間インキュベートして、GFP対立遺伝子と単一の変異対立遺伝子の両方を持つ細胞を選択します。
マットA細胞は、遺伝子欠失を運ぶハプロ細胞を選択するlade G four 18培地の下にレプリカプレーティングされ、これらのプレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。次のレプリカプレート、マット、L-H-R-K-G上の縮瞳子孫を4つの18培地に選択し、単一の変異体の成長のために選択します。また、ACPはGFPを摂氏30度で一晩インキュベートします。
その後、プレートは摂氏4度で最大3か月間保存できます。CP one GFPを発現する目的の変異体をプレートから直接視覚化するためには、まずプレートから目的のコロニーをピックします。細胞を摂氏30度で増殖させ、YPDまたはSDヒス培地を早期の対数期まで増殖させます。
最後に、この共焦点画像にGFPフィルターをセットした共焦点顕微鏡を用いて変異体を可視化し、ACP one GFPマーカーを持つ変異体と野生型を共焦点顕微鏡で可視化し、ミトコンドリアの形態を研究しました。この特定の変異体は、破壊されたミトコンドリア表現型を示すため、さらなる研究の有力な候補です。ロボットシステムを使用して、マルチクローナルマーカーであるCP one GFPを欠失変異体アレイに効率的に組み込む方法を示した必要があります。
この手順を行うときは、メディアを新鮮にし、その場所が乾燥するのに十分な時間を確保することが重要です。湿りすぎていると結露が蓄積し、汚染の可能性が高まります。また、すべての選択メディアはこのプロトコルにとって重要であるため、正しく作成されていることを再確認する必要があります。
この手順は、他のタイプのマーカーにも使用できます。例えば、erを可視化するために、マーカーエア11とGSPを日常的に使用する。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この研究は、酵母の約5,000個の非必須遺伝子にオルガネラ-GFPマーカーを組み込む方法を提示し、オルガネラの形態を視覚化するプロセスを合理化します。この手法を使用することで、研究者はオルガネラの構造に影響を与える変異を効率的にスクリーニングできます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 遺伝学
背景
- GFP融合タンパク質は細胞構造を視覚化するための重要なツールです。
- 従来の変異スクリーニング方法は労力がかかります。
- 酵母は遺伝学研究のモデル生物として機能します。
- 共焦点顕微鏡法により、オルガネラの詳細な画像化が可能になります。
研究目的
- オルガネラマーカーを同時に組み込む方法を開発すること。
- オルガネラの形態に影響を与える変異のスクリーニングを促進すること。
- 酵母における遺伝学研究の効率を向上させること。
使用された方法
- 培養細胞からのCP one GFPアレイの調製。
- DMAとGFPアレイを交配させて二倍体を選択すること。
- 特定の培地上で二倍体の胞子形成。
- 共焦点顕微鏡を用いたミトコンドリアの形態観察。
主な結果
- オルガネラ-GFPマーカーの酵母遺伝子への成功した組み込み。
- 望ましい遺伝子改変を持つ単倍体の細胞の効率的な回復。
- 共焦点顕微鏡によるオルガネラの形態の視覚化。
- 遺伝子変異のスクリーニングプロセスの合理化。
結論
- この方法は遺伝子スクリーニングに必要な時間を大幅に短縮します。
- オルガネラの機能を研究するための堅牢な枠組みを提供します。
- この手法は酵母における様々な遺伝学研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This high-throughput yeast organelle morphology method enables systematic interrogation of gene function in organelle biogenesis, supporting target validation in early discovery. By integrating robotic array handling with dual-marker selection, it delivers scalable, reproducible phenotypic data for mechanistic de-risking of genetic hits. The approach accelerates pathway mapping and prioritization of targets affecting mitochondrial or ER function in preclinical programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables genome-wide assessment of gene deletions on mitochondrial morphology to validate targets involved in organelle inheritance.
- Operational Value: Uses robotic pinning to process 4,672 mutants efficiently, reducing manual labor and increasing throughput.
- Predictive Value: Identifies genetic modifiers of organelle structure to de-risk targets early in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable organelle morphology readouts via confocal microscopy for assay standardization.
- Operational Value: Produces homozygous deletion strains with integrated GFP markers, ensuring consistent reporter expression across the array.
- Assay Readiness: Delivers arrayed haploid mutants ready for compound screening or genetic interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links yeast organelle phenotypes to conserved pathways relevant to human disease models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies gene function in organelle biogenesis to support target selection for preclinical validation.
- Pathway Elucidation: Maps genetic networks governing mitochondrial dynamics to inform mechanism-based compound screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification by providing organelle morphology data that informs target confidence and pathway relevance before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in organelle formation through systematic morphological profiling.
- Screening: Enables reproducible, array-based organelle imaging for high-content screening of genetic or chemical perturbations.
- Analytics: Delivers imaging-based phenotypic readouts that allow comparison of mutant conditions to wild-type controls.
- Translational Research: Connects yeast organelle defects to conserved cellular processes with potential relevance to preclinical disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for organelle-wide phenotypic screening across multiple GFP-tagged markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by linking genotype to organelle phenotype at scale.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized robotic handling and dual-selection workflow.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel evaluation of thousands of genetic backgrounds.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted target prioritization based on organelle morphology phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, mating, sporulation, and fluorescent microscopy.
- Depends on robotic pinning systems and controlled incubation environments for array handling.
- Necessitates standardized media preparation and selection protocols to avoid contamination and ensure mutant recovery.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different organelle markers (e.g., ER vs. mitochondria).
- Limited to non-essential gene backgrounds; essential genes require alternative approaches such as conditional alleles or CRISPRi.
