Name: グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学ぶ 酵母S. cerevisiaeにおける細胞小器官GFPマーカーのハイスループット導入法。約5,000の非必須遺伝子に同時に標識を組み込み、共焦点顕微鏡でミトコンドリア形態を可視化し、遺伝子変異の効率的なスクリーニングを実現します。

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この作品は、バイオテクノロジーおよび生物科学研究会議（助成金31/C15982）、保健研究、イノベーションのためのカナダ財団、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金、健康研究のためのマイケルスミス財団（助成金CJRへのカナダの協会によってサポートされていましたローウェン）、およびサイトのファイト。

材料および方法： <ol><li>酵母菌株： <ul><li> Acp1 - GFP（GFP：：彼）：Acp1のC末端GFP -タグは、プラスミドpKT128を（GFPとHIS5を含む）を用いてPCRを介した相同組換えにより生成されました。陽性形質転換体は、共焦点顕微鏡とコロニーPCRにより確認した。ブーンラボ（トングとブーン、2006）から：歪みの背景には、BY7043（STE2pr - lue2lyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0：MATアルファcan1Δ）であった。 </li><li>欠失変異体の配列（DMA）（XXX：：KanR）：それは、非必須遺伝子の約5,000の欠失変異体の配列です。これらの非必須遺伝子のすべては、G418にノックアウトされました。配列の歪みの背景には、BY4741（MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0）です。私たちのDMAは、もともとブーンラボからだ。 </li></ul></li><li> DMAでAcp1 - GFPを組み込む： GFPの配列を作るための以下のプロトコルは、修正を加えた合成遺伝子解析（SGA）技術（トンとブーン、2006）を改作したものです。レプリカピニングのすべての手順は、シンガーローター高密度アレイ化ロボットシステムを使用することによって行われます。また、マニュアルのピン配置または液体ベースの高密度アレイ化ロボットを使用することができます。 略語：YPD、酵母エキス - ペプトン - デキストロース、SD、合成ドロップアウト、LRK、ルー/アルギニン/リジンドロップアウトメディア、LHRK、ルー/彼/アルギニン/リジンドロップアウトメディア 準備 <ol><li> YPDプレートに一晩Acp1 - GFPの培養5 mlを注いでAcp1 - GFPの細胞の芝生を育てる。板は炎によって、または生物学的なドラフト内で十分に乾燥することができます。 </li><li> 30˚Cで一晩インキュベートする。 </li><li>プレート当たり1536コロニーにロボット、配列Acp1 - GFP株を使用した。同時に、レプリカはYPD + G418プレートに固定することによって、DMAの新しいコピーを準備する。 </li><li> 30˚Cで一晩培養する。 交配と二倍体の選択 </li><li>レプリカのピン配置やYPDプレート上のコロニーを上に敷設によるDMAとAcp1 - GFP株をかん。 </li><li> 30˚Cで一晩培養する。 </li><li>二倍体細胞を（MATA / MATalpha）を選択するために彼の+ G418プレート - SD上にレプリカプレートコロニー。 </li><li> 30˚Cで一晩培養する。 Sporulationgと発芽 </li><li>減数分裂胞子の形成を誘導する炭素源および窒素源の削減レベルを含む強化された胞子形成のメディア上にレプリカプレート二倍体コロニー、。 </li><li> 25˚C 5日間の最小のプレートをインキュベートする。 </li><li> LRKメディアにレプリカプレーティングしたコロニーでMATA減数分裂の子孫を発芽し、二日間、30˚Cで培養する。 </li><li>このメディアは、胞子からの半数体細胞の発芽を誘発する。 LUE2オープニングリーディングフレーム（ORF）はMATA -特異的STE2プロモーターに統合されているため、発芽すべての半数はMATAになります。 両方の対立遺伝子の選択 </li><li>それは今でGFPの対立遺伝子と、単一の変異型対立遺伝子の両方を選択する必要があります。これを達成するために、マタ細胞は、遺伝子の欠失（：：kanR XXX）を運ぶ半数体細胞のために選択LRK + G418メディア 、上にレプリカメッキされています。 </li><li> 30˚Cで一晩培養する。 </li><li>またAcp1 - GFPを（：：彼のGFP）保有：最後に、MATA減数分裂子孫は、単一の変異株の増殖を選択するためにLHRK + G418メディア （：kanR XXX）上にレプリカメッキです。これらのプレートは˚Cまでの3ヶ月間4℃保存することができます。 </li></ol> GFPの配列を作るための以下のプロトコルは、修正を加えた合成遺伝子解析（SGA）技術（トンとブーン、2006）を改作したものです。レプリカピニングのすべての手順は、シンガーローター高密度アレイ化ロボットシステムを使用することによって行われます。また、マニュアルのピン配置または液体ベースの高密度アレイ化ロボットを使用することができます。 略語：YPD、酵母エキス - ペプトン - デキストロース、SD、合成ドロップアウト、LRK、ルー/アルギニン/リジンドロップアウトメディア、LHRK、ルー/彼/アルギニン/リジンドロップアウトメディア 準備 </li><li>顕微鏡： <ol><li>プレートから直接Acp1 - GFPを発現し、目的の変異体（s）を選ぶ。 </li><li> 30℃で細胞を成長° YPDまたはSDのC - 初期対数増殖期に彼のメディア。 </li><li> GFPのfiltersetを使用して共焦点顕微鏡により視覚化する。期待される結果の例は、図1に示します。 </li></ol></li></ol> SGAメディア： このプロトコルで使用されている増殖培地（YPD）と選択培地（SD）は、日常的に酵母分子生物学で使用されています。詳しい説明については、 酵母のメソッド （アンベルクら、2005）を参照してください。 LRK、LHRKメディア（400mlの合計） <table border="0"><tbody><tr><td>順番に追加</td><td>量は</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウムと酵母窒素塩基</td><td> 2.7グラム</td></tr><tr><td>アミノ酸ミックス</td><td> 0.8グラム</td></tr><tr><td>寒天</td><td> 8グラム</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 360 mLの</td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ</td></tr><tr><td> 20％ブドウ糖</td><td> 40ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2"> 65˚Cに冷却</td></tr><tr><td> 100 mg / mLのカナバニン</td><td> 0.2ミリリットル</td></tr><tr><td> 100 mg / mLのthialysine </td><td> 0.2ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2">プレート当たり50mlを注ぎ、混ぜる</td></tr></tbody></table> LRK、LHRK + G418メディア​​（400mlの合計） <table border="0"><tbody><tr><td>順番に追加</td><td>量は</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウムなし酵母窒素塩基</td><td> 0.7グラム</td></tr><tr><td>アミノ酸ミックス</td><td> 0.8グラム</td></tr><tr><td>グルタミン酸1ナトリウム</td><td> 0.4 </td></tr><tr><td>寒天</td><td> 8グラム</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 360 mLの</td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ</td></tr><tr><td> 20％ブドウ糖</td><td> 40ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2"> 65˚Cに冷却</td></tr><tr><td> 100 mg / mLのカナバニン</td><td> 0.2ミリリットル</td></tr><tr><td> 100 mg / mLのthialysine </td><td> 0.2ミリリットル</td></tr><tr><td> 200 mg / mlのG418 </td><td> 0.4ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2">プレート当たり50mlを注ぎ、混ぜる</td></tr></tbody></table>濃縮された胞子形成培地（400mlの合計） <table border="0"><tbody><tr><td>順番に追加</td><td>量は</td></tr><tr><td>カリウム酢酸</td><td> 4グラム</td></tr><tr><td>酵母の抽出</td><td> 0.4グラム</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td> 0.2グラム</td></tr><tr><td>胞子形成アミノ酸ミックス</td><td> 0.04グラム</td></tr><tr><td>寒天</td><td> 8グラム</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 360 mLの</td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ</td></tr><tr><td colspan="2"> 65˚Cに冷却</td></tr><tr><td> 200 mg / mlのG418 </td><td> 0.4ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2">プレート当たり50mlを注ぎ、混ぜる</td></tr></tbody></table>

<ol><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Tong, A. H., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).</li>
</ol>

このメソッドは、様々な変異体背景にミトコンドリアマーカー、Acp1 - GFPを組み込む効率的に助けることができる。それは、ロボットシステムの使用に依存しており、簡単にロボットシステムで使用するために採用することができます。この手順は、マーカーの他のタイプを組み込むために使用することができます。例えば、ERを視覚化するために、我々は日常的にマーカーErg11 - GFPを使う。私たちの代表的な画像では、変異体とAcp1 - GFPのメーカーと野生型のミトコンドリアの形態を研究するために共焦点顕微鏡によりvisualiz EDでした。変異体は、中断ミトコンドリアの表現型を示したので、さらなる調査のための良い候補です。

<table><tbody><tr><td>SGA培地</td><td></td><td></td><td>本プロトコルで使用する増殖培地（YPD）およびLRKおよびLHRKを含む合成ドロップアウト培地（SD）、ならびに濃縮胞子形成培地は、酵母分子生物学で日常的に使用されています。詳細な説明については、『Methods in Yeast』（Amberg et al., 2005）をご参照ください。</td></tr></tbody></table>

グローバルs. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

タンパク質の局在や細胞小器官の形態を調べるためにハイスループット法は、タンパク質相互作用を研究するための効果的なツールであり、分子経路の包括的な理解を達成するの​​に役立ちます。出芽酵母では、非必須遺伝子の欠失配列の発展とともに、我々は世界的に小胞体（ER）およびミトコンドリアを使用してGFP（または変異型）マーカー異なる遺伝子背景のようなさまざまな細胞小器官の形態を学ぶことができます。しかし、それぞれの単一変異に組み込んだGFPマーカーは、個別に労働集約的なプロセスです。ここで、我々は日常的に我々の研究室で使用されている手順を説明します。高密度の酵母アレイと薬剤選択のテクニックを処理するためのロボットシステムを使用することによって、我々は、大幅に必要な時間を短縮し、再現性を向上させることができます。簡単に言えば、我々はロボットレプリカ確保することにより、4672非必須遺伝子の欠失変異体の高密度配列にGFP -タグ付きミトコンドリアマーカー（Apc1 - GFP）を渡ります。二倍体の選択、胞子形成、発芽およびデュアルマーカーの選択を通じ、我々は両方の対立遺伝子を回復する。その結果、それぞれの半数体の単一変異体は、そのゲノム遺伝子座に組み込まApc1 - GFPが含まれています。今、我々はすべての非本質的な変異体バックグラウンドにおけるミトコンドリアの形態を学ぶことができます。このハイスループットアプローチを使用して、私たちは便利な研究とゲノム全体の設定の継承と細胞小器官の形成に関与する経路と遺伝子を描くことができる。

GFP融合タンパク質は、広く共焦点顕微鏡による細胞小器官を可視化するために使用されます。しかし、細胞小器官の形態に影響を与える変異のスクリーニングは通常、個々の変異誘発を必要とし、時間のかかる作業です。ここで、我々は同時に、酵母のほぼ5000の非必須遺伝子のオルガネラ- GFPマーカーを組み込む方法を示しています。

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

タンパク質の局在やオルガネラの形態を解析するハイスループット手法は、タンパク質間相互作用を研究するための効果的なツールであり、...に役立ちます。

この手順は、まず細胞株を育成し、次に新しいプレートにアレイをピンアウトすることで、CP one GFPのアレイを調製することから始まります。同時に、DMAの新しいコピーを調製します。次に、ACP one GFPアレイとDMAを交配させて二倍体を抽出し、それらを胞子形成培地で胞子形成させます。5日後、Myotic progenyをLRK培地で発芽させます。この培地ではMAT Aのハプロイドのみが増殖します。さらに2回の選択ラウンドを経て、ACP one GFPとカナマイシン耐性遺伝子のノックアウトの両方を持つハプロイド細胞を回収します。最終的に、プレートから個別の株を直接ピックアップし、共焦点顕微鏡を用いてミトコンドリアの形態を観察することができます。こんにちは。ブリティッシュコロンビア大学ライフサイエンス研究所、細胞・発生生物学部のLoan研究室のChap Tです。同じくLoan研究室のJesse Chaoです。本日は、ロボットシステムを用いて、酵母のさまざまな変異体背景にGFPマーカーを導入するハイスループット法をご紹介します。当研究室では、D、小胞体、ミトコンドリアなどのオルガネラの形態を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。本プロトコルでは、2種類の異なる酵母株を使用します。CP one GFPは、プラスミドPKT 1 28を用いたPCR媒介相同組み換えによって作製された、ACP oneのC末端にGFPタグを付加した株である。背景株はBY 7 0 4 3である。また、非必須遺伝子の約5,000種類の欠損変異株からなるDMA株（欠損変異体アレイ）も使用する。これらの非必須遺伝子はすべてG four 18でノックアウトされました。アレイのストレイン背景はBY 47 41です。まず、5 mLのオーバーナイトACP one GFP培養液をhissプレートに播種し、ACP one GFP細胞のローンを育成します。プレートを火炎または生物学的安全キャビネット内で十分に乾燥させます。乾燥後、プレートを30 °Cで一晩培養します。培養後、ロボットを用いてA CP one GFP株を1プレートあたり1,536個のコロニーにアレイします。同時に、レプリカピンを用いてDMAからYPDGプレート4枚に新鮮なコピーを調製します。その後、菌株が生育するまで、プレートを30 °Cで一晩インキュベートします。DMAからレプリカピンを用いてGFP発現株を作成し、コロニーをYPDプレート上にオーバーレイして、プレートを30 °Cで一晩インキュベートします。レプリカプレートをインキュベーションした後、二倍体細胞を選別するため、コロニーをSD-His-Gly 418プレートにレプリカ移植し、30°Cで一晩インキュベートします。胞子形成と発芽を開始させるため、まず二倍体をYPD-Gly 418プレートにレプリカ移植し、次ステップにおける胞子形成の効率を高めます。30°Cで1日間インキュベートした後、二倍体を、減数分裂による胞子形成を誘導するために炭素源と窒素源のレベルを低減させた胞子形成促進培地（enhanced Sporulation media）にレプリカ移植します。次に、プレートを25°Cで最低5日間インキュベートします。インキュベーション後、コロニーをLRK培地にレプリカプレーティングし、減数分裂の後代であるマットを発芽させます。この培地は胞子からの接合細胞の発芽を誘導します。プレートを30°Cで2日間インキュベートし、GFPアレルと単一変異アレルの両方を保持する細胞を選別します。Matt A細胞をlade G four 18培地でレプリカプレートし、遺伝子欠損を持つハプロ細胞を選択します。これらのプレートを30 °Cで一晩インキュベートします。次に、mat a減数分裂後代をL-H-R-K-G four 18培地でレプリカプレートし、ACP one GFPも保持している単一変異体の増殖を選択します。30 °Cで一晩インキュベートします。その後、プレートを4°Cで最大3か月間保存できます。プレートからCP one GFPを発現している目的の変異体を直接視覚化するには、まずプレートから目的のコロニーをピックアップします。細胞を30°C、YPDまたはSD hiss培地で対数増殖初期まで培養します。最後に、共焦点顕微鏡のGFPフィルターセットを用いて変異体を可視化します。この共焦点画像では、ミトコンドリアの形態を調べるために、ACP1-GFPマーカーを持つ変異体と野生型を共焦点顕微鏡で可視化しました。この特定の変異体はミトコンドリアの表現型が破壊されており、さらなる調査の適切な候補となります。本動画では、ロボットシステムを使用して、マルチクローナルマーカーであるACP1-GFPを欠失変異体アレイに効率的に組み込む方法を示しました。この手順を行う際は、培地を新しく調製し、プレートを十分に乾燥させることが重要です。水分が多すぎると結露が生じ、コンタミネーションのリスクが高まります。また、選択培地は本プロトコルにおいて極めて重要であるため、すべて正しく調製されているか再確認してください。この手順は、他の種類のマーカーにも適用可能です。例えば、ERを可視化するために、私たちは通常、マーカーair 11およびGSPを使用しています。以上で完了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

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