グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

この手順は、まず細胞株を育成し、次に新しいプレートにアレイをピンアウトすることで、CP one GFPのアレイを調製することから始まります。同時に、DMAの新しいコピーを調製します。次に、ACP one GFPアレイとDMAを交配させて二倍体を抽出し、それらを胞子形成培地で胞子形成させます。

5日後、Myotic progenyをLRK培地で発芽させます。この培地ではMAT Aのハプロイドのみが増殖します。さらに2回の選択ラウンドを経て、ACP one GFPとカナマイシン耐性遺伝子のノックアウトの両方を持つハプロイド細胞を回収します。最終的に、プレートから個別の株を直接ピックアップし、共焦点顕微鏡を用いてミトコンドリアの形態を観察することができます。

こんにちは。ブリティッシュコロンビア大学ライフサイエンス研究所、細胞・発生生物学部のLoan研究室のChap Tです。同じくLoan研究室のJesse Chaoです。本日は、ロボットシステムを用いて、酵母のさまざまな変異体背景にGFPマーカーを導入するハイスループット法をご紹介します。

当研究室では、D、小胞体、ミトコンドリアなどのオルガネラの形態を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。本プロトコルでは、2種類の異なる酵母株を使用します。

CP one GFPは、プラスミドPKT 1 28を用いたPCR媒介相同組み換えによって作製された、ACP oneのC末端にGFPタグを付加した株である。背景株はBY 7 0 4 3である。また、非必須遺伝子の約5,000種類の欠損変異株からなるDMA株（欠損変異体アレイ）も使用する。

これらの非必須遺伝子はすべてG four 18でノックアウトされました。アレイのストレイン背景はBY 47 41です。まず、5 mLのオーバーナイトACP one GFP培養液をhissプレートに播種し、ACP one GFP細胞のローンを育成します。

プレートを火炎または生物学的安全キャビネット内で十分に乾燥させます。乾燥後、プレートを30 °Cで一晩培養します。培養後、ロボットを用いてA CP one GFP株を1プレートあたり1,536個のコロニーにアレイします。

同時に、レプリカピンを用いてDMAからYPDGプレート4枚に新鮮なコピーを調製します。その後、菌株が生育するまで、プレートを30 °Cで一晩インキュベートします。DMAからレプリカピンを用いてGFP発現株を作成し、コロニーをYPDプレート上にオーバーレイして、プレートを30 °Cで一晩インキュベートします。

レプリカプレートをインキュベーションした後、二倍体細胞を選別するため、コロニーをSD-His-Gly 418プレートにレプリカ移植し、30°Cで一晩インキュベートします。胞子形成と発芽を開始させるため、まず二倍体をYPD-Gly 418プレートにレプリカ移植し、次ステップにおける胞子形成の効率を高めます。30°Cで1日間インキュベートした後、二倍体を、減数分裂による胞子形成を誘導するために炭素源と窒素源のレベルを低減させた胞子形成促進培地（enhanced Sporulation media）にレプリカ移植します。

次に、プレートを25°Cで最低5日間インキュベートします。インキュベーション後、コロニーをLRK培地にレプリカプレーティングし、減数分裂の後代であるマットを発芽させます。この培地は胞子からの接合細胞の発芽を誘導します。プレートを30°Cで2日間インキュベートし、GFPアレルと単一変異アレルの両方を保持する細胞を選別します。

Matt A細胞をlade G four 18培地でレプリカプレートし、遺伝子欠損を持つハプロ細胞を選択します。これらのプレートを30 °Cで一晩インキュベートします。次に、mat a減数分裂後代をL-H-R-K-G four 18培地でレプリカプレートし、ACP one GFPも保持している単一変異体の増殖を選択します。30 °Cで一晩インキュベートします。

その後、プレートを4°Cで最大3か月間保存できます。プレートからCP one GFPを発現している目的の変異体を直接視覚化するには、まずプレートから目的のコロニーをピックアップします。細胞を30°C、YPDまたはSD hiss培地で対数増殖初期まで培養します。

最後に、共焦点顕微鏡のGFPフィルターセットを用いて変異体を可視化します。この共焦点画像では、ミトコンドリアの形態を調べるために、ACP1-GFPマーカーを持つ変異体と野生型を共焦点顕微鏡で可視化しました。この特定の変異体はミトコンドリアの表現型が破壊されており、さらなる調査の適切な候補となります。本動画では、ロボットシステムを使用して、マルチクローナルマーカーであるACP1-GFPを欠失変異体アレイに効率的に組み込む方法を示しました。

この手順を行う際は、培地を新しく調製し、プレートを十分に乾燥させることが重要です。水分が多すぎると結露が生じ、コンタミネーションのリスクが高まります。また、選択培地は本プロトコルにおいて極めて重要であるため、すべて正しく調製されているか再確認してください。

この手順は、他の種類のマーカーにも適用可能です。例えば、ERを可視化するために、私たちは通常、マーカーair 11およびGSPを使用しています。以上で完了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。