ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

この手順により、ゼブラフィッシュ胚における遺伝子発現パターンを高解像度で決定することが可能です。アンチセンスリボプローブを相補的な標的mRNAにハイブリダイズさせます。標識されたリボプローブは、ペルオキシダーゼ酵素が結合した抗体によって認識されます。胚にアラミド結合フルオロフォーを添加すると、ペルオキシダーゼがIDEを高度に反応性のある化合物に変換します。これにより、フルオロフォーが安定的に沈着します。未結合のIDEを洗浄して除去することで、mRNA分布の詳細な細胞内パターンが明らかになります。

明確にラベル付けされたプローブと異なるタイロム・フルオロ（tyrom fluoro）を用いることで、2つ目の遺伝子の発現を観察でき、発現の詳細な比較が可能になります。こんにちは、イェール大学分子・細胞・発生生物学部のスコット・ホリー（Scott Holly）研究室のティム・ブレント（Tim Brent）です。本日は、ゼブラフィッシュ胚を用いたホールマウント高解像度二重蛍光in situハイブリダイゼーションの手順をご紹介します。

この手順を用いて、ゼブラフィッシュの分節化について研究します。それでは、始めていきましょう。まず、パラホルムアルデヒドを用いて冷所で一晩固定した胚を用意し、手順を開始します。

今回の固定においては、解凍したばかりのパラホルムアルデヒドストック溶液を使用することが、染色を成功させるための重要なポイントとなります。固定液を除去し、室温のPBSで胚を5分間ずつ2回洗浄します。次に、胚の絨毛膜を除去します。

胚をガラス製ディプレッションプレートに置きます。ここからは時計職人用ピンセットを使用して、絨毛膜を取り除いてください。胚の移動には、火炎滅菌して先端を丸めたガラス製パストゥールピペットを使用します。

そうしないと、胚が通常のポリプロピレン製チップに付着してしまいます。脱塩素化された胚は、メタノール濃度を段階的に上げていく一連の洗浄工程を経て移送されます。最後の洗浄は100% methanolで行います。

最後に、胚を新鮮なメタノールに入れ、-20°Cで一晩保存します。翌日、メタノール濃度を段階的に下げた一連の洗浄を行い、その後PBSTバッファーで5分間ずつ2回洗浄して胚を移行させます。次に、パラホルムアルデヒドを用いて胚を20分間固定します。

PBSTで5分間の洗浄を2回行い、短時間の固定を終了します。これで胚の透過処理を行う準備が整いました。固定した胚をProteinase Kと共にインキュベートすることで、透過処理を行います。この際、マイクロ遠心チューブを横向きに寝かせて置いてください。

消化ステップの時間は、胚の齢によって異なります。例えば、体節形成期（somato agenesis stage）の胚は3〜4分間インキュベートします。PBSTで短時間すすぎ、その後、PBSTで1回、5分間洗浄します。

胚をパラホルムアルデヒドで固定します。最後に、PBSTで5分間、胚を2回洗浄します。これで、RNAプローブを用いたハイブリダイゼーションの準備が整いました。

胚の固定と透過処理が完了しましたので、65 °Cで5分間のHigh Minusインキュベーションを行い、ハイブリダイゼーション工程を開始します。使用前にHIIN溶液を予熱させておくことを忘れないでください。次に、胚をHigh Plusの中で1時間インキュベートします。

繰り返しになりますが、ハイプラス溶液をあらかじめ予熱しておくことを忘れないでください。次に、ハイプラス溶液の大部分を除去しますが、胚が完全に浸っていることを確認しながら50 µL分は残しておきます。各プローブを1 µLずつ加え、チューブを軽く指で弾いて混ぜ合わせます。

これ以降、チューブをアルミホイルで覆ってください。フルオレセインは光に敏感であるためです。65°Cで一晩インキュベートし、ハイブリダイゼーションを完了させます。それでは、ここから過剰なプローブを除去しましょう。

染色の質を向上させるため、界面活性剤を除去します。ただし、界面活性剤がない状態では胚が粘着質になることに注意してください。50%ホルムアミド含有2X SSC溶液で、1回30分間の洗浄を2回行います。

1回洗浄し、その後2x SSC溶液で15分間洗浄します。最後に、0.2x SSCで30分ずつ2回洗浄します。次に、各プローブを可視化します。

これで、ハイブリダイズしたプローブの検出を開始できます。フルオレセインプローブはジゴキシゲニン（dig oxygen）プローブよりも安定性が低く、シグナルが弱いため、先に検出します。まず、マレイン酸緩衝液で調製した2%ブロッキング試薬500 µLを用いて、室温で1時間ブロッキングを行います。

次に、ペルオキシダーゼ標識抗フルオレセイン抗体をブロッキング溶液で1:500に希釈して加えます。4 °Cで一晩インキュベートします。その際、マイクロ遠心チューブを横にして置いてください。

次に、tyrom信号増幅システムを用いて検出を開始します。TSA TYROM IDEはフルオロフォアに結合しています。抗体上の西洋わさびペルオキシダーゼがTY IDEを反応性の高い中間体へと変換します。この反応性TY IDEが抗体の近接にある残基と共有結合を形成し、その結果、フルオロフォアが局所的に沈着します。

室温で1×マレイン酸緩衝液を用いて20分間の洗浄を4回行い、その後PBSで2回洗浄します。フルオレセインTY IDEは、保存のためにあらかじめDMSOに溶解させておきます。このTSA基質を短時間遠心して液を回収します。

次に、TSA基質を増幅希釈バッファーで50倍に希釈します。この溶液を胚に加え、45分間インキュベートします。マイクロ遠心チューブを横向きに置きます。

このインキュベーションステップの間、メタノール濃度を徐々に上げて、10分間ずつの洗浄を繰り返して胚を移行させます。最後の洗浄は100%メタノールで10分間行います。その後、抗体のペルオキシダーゼを不活性化するため、1%過酸化水素溶液中で30分間インキュベートします。これを行わないと、dig oxygen inの検出を妨げる可能性があります。

胚を、段階的に濃度を下げた一連のメタノール洗浄と、10分間のPBSバッファーによる2回の洗浄にかけ、プローブを転移させます。これにより、すべてのメタノールが除去されます。dig xigenおよびプローブの抗体標識は、前回の抗体と同様にブロッキングから開始します。

次に、抗dig oxygenin抗体を1/1000に希釈して加えます。マイクロ遠心チューブを横に寝かせ、低温下で一晩インキュベートし、翌日に取り出します。室温でマレイン酸緩衝液を用いて洗浄します。

次に、PBSで洗浄し、SCI five tyrom基質を調製します。これを1:50に希釈して胚に添加します。チューブを横にした状態で45分間インキュベートします。

最後に、PBSTで3回洗浄します。プロピジウムヨウライドを用いた最終染色ステップで核を標識します。まず、2 XSSCで5分間の洗浄を2回行います。

次に、37°Cで30分間、RNAで処理します。室温で2XSSCを用いて6回洗浄し、プロピジウムヨード溶液を加えて8分間染色します。2XSSCで6回洗浄します。

胚をパラホルムアルデヒドで20分間固定します。最後に、PBSTで5分間の洗浄を2回行います。観察のための胚の封入は、25%および50%グリセロールでそれぞれ10分間、計2回のインキュベーションから開始します。

次に、サンプルを75% glycerolに入れ、4 °Cで一晩インキュベートします。この一晩の透明化ステップにより、胚の解剖が容易になります。最後に、胚から卵黄を解剖して除去します。

バックグラウンド蛍光を低減するため、胚を顕微鏡スライドガラス上にフラットマウントし、顕微鏡下で観察します。これらの画像は、10 somite期のゼブラフィッシュ胚の後端を通る単一の共焦点断面を示しています。赤色の染色は、digoxigenin標識プローブとTSA試薬を用いて検出されたdelta C mRNAを示しています。

緑色の染色は、フルオレセイン標識プローブによって検出されたher 1 mRNAを示しています。また、TSAフルオレセイン試薬と、プロピジウムヨードで染色された核が、二重染色された胚において青色に色付けされています。

発現領域が明確に分かれているか、あるいは重複しているかを曖昧さなく判定することが可能です。また、この手順により、これらの拡大図に示されるHER1染色の結果のように、mRNAの細胞内局在が明らかになります。核内に見られる点状の染色は、遺伝子の活発な転写を示しています。

他の細胞では、mRNAが細胞質に局在しています。二重染色した胚では、両方の遺伝子を転写している細胞、またはどちらか一方の遺伝子のみを転写している細胞が観察できます。

別途、ゼブラフィッシュ胚におけるホールマウント高解像度二重蛍光in situハイブリダイゼーションの手法を説明しました。この手順を行う際は、まず標準的なアルカリホスファターゼを用いた染色でプローブをテストすることが重要である点に留意してください。クリーンで強いシグナルが得られるプローブは、蛍光in situハイブリダイゼーションにおいても良好に機能します。

また、プロピジウムヨード染色に代わり、β-カテニンの免疫局在法を正常に使用することができました。このバリエーションを行う際は、ハイブリダイゼーション反応を65°Cではなく55°Cで実施します。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。