Name: ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ胚における高分解能二重蛍光インプローブハイブリダイゼーション法を用いた遺伝子発現パターン解析。この手法により、2つの遺伝子の発現ドメインの重なりを可視化し、発生生物学研究に有用です。

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我々は、このプロトコルの開発にDörtheユーリッヒ、ジェニファーラウンドとアンドリューマーラの貢献を感謝したい。 NICHD、米国癌学会とマーチオブダイムスが提供する研究支援。

1。固定<ol><li>一晩4胚℃でPBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を持つ。を修正</li><li>削除修正と室温（RT）で2 × PBS、5分ごとに洗う。 </li><li>時計職人の鉗子を使用してガラスのうつ病のプレートにPBSで手動でdechorionate胚。 dechorionationした後、胚は彼らがポリプロピレンのピペットに付着可能性があるため、ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて転送されます。 </li><li> 25％、50％と各5分間、PBS中の75％メタノール、一連の胚を移す。 </li><li>新鮮なメタノールで交換して、100％メタノールで液を交換して5分間インキュベートし。 </li><li>一時間の最小値まで-20℃で場所は胚。 （私たちは、通常は一晩胚をインキュベートする。situハイブリダイゼーションの標準1年以上保存されている胚で動作しますが、我々はin situハイブリダイゼーション蛍光灯の高解像度が長期保管によって失われているかどうかを検討していない。） </li><li> 75％、50％、室温でPBSTで25％メタノールで5分間ごとに胚を洗浄してください。室温で5分間PBSTで各2回洗浄する。 </li><li>室温でPBS中4％PFAで20分間再修正。 </li><li>室温で5分間PBSTで各2回洗浄する。 </li></ol> PFAに関する注意： 我々は（試薬の表を参照）-20℃でアリコートで4％PFAを格納する。初期固定のために、我々は以前に解凍されたことがないPFAを使用してください。その後の注視のために、我々は多くの場合、それ以前に解凍されたPFAを使用してください。初期固定は、このプロトコルで成功する染色ために重要であると表示されます。 2。プロテイナーゼとかん流後<ol><li>胚を透過性に3〜12分間室温でプロテイナーゼK（PBSTで5μg/ml）とダイジェスト。 （インキュベーション時間は、若い段階ではより敏感であるため、胚の年齢に依存する。また、酵素のバッチ処理に依存する。）体節形成期胚では、我々は通常、3〜4分のために透過性。このインキュベーションの間、我々は、その側のマイクロ遠心チューブを置く。 </li><li> PBSTで簡単にすすぎ、PBSTで5分間一回洗浄。 </li><li>室温でPBS中4％PFAで20分間再修正。 </li><li>室温でPBSTで、各5分間、2回洗浄する。 </li></ol> 3。プレハイブリダイゼーション<ol><li>で65℃で5分間胚をインキュベートHYB -。 </li><li> HYBで少なくとも1時間、65℃でプレハイブリダイゼーション+。 </li></ol> 4。ハイブリダイゼーション<ol><li> preHYBのすべてが、50μlを削除するが、完全に水没胚を維持することを確認してください。 </li><li>軽くチューブをタッピングし胚と混合する各リボプローブの1〜2μL（ジゴキシゲニン-およびフルオレセイン標識リボプローブ）を追加します。プローブの量は、典型的には20μlのプローブの合成反応から1 -2μlのです。 </li><li>フルオレセインが光に敏感であることを考えると、チューブがアルミホイルに包まれたり、そうでなければこれ以降、最小限の光にさらされるべきである。 </li><li> 65 º Cで一晩胚をインキュベート</li></ol> 5。プローブの取外しこの時点で前方に不足の洗剤からソリューションがあることに注意してください。洗剤の除去は、染色反応を助けるように見えますが、胚はかなり粘着性になることがありません。 <ol><li>リボプローブを取り外します。 </li><li> 50％のformamide/2xSSCで65℃で2 × 30分間洗浄します。 </li><li> 2 × SSCで65℃で15分間洗浄する。 </li><li> 0.2 × SSCで65℃30分間洗浄する。 </li></ol> 6。抗フルオレセイン抗体のインキュベーション<ol><li>ブロッキング試薬1Xマレイン酸緩衝液を加えた2％溶液を500μLで室温にて少なくとも1時間ブロック（試薬の表を参照）。 </li><li>ブロッキング溶液で1:500に希釈したとしてロシュから提供される抗フルオレセイン- POD抗体を、追加します。 </li><li> 4℃で一晩インキュベートするこのインキュベーションの間、我々は、その側のマイクロ遠心チューブを置く。 </li><li> 1Xマレイン酸緩衝液で4 × 20分間洗浄します。 PBSで2回（各5分間）洗浄する。 </li></ol> 7。フルオレセインラベル付きプローブの検出<ol><li> TSA Plusのフルオレセイン溶液で30〜60分インキュベートする。 （染色液を作る前に、TSAの基板にスピンダウン。反応は、パーキンエルマーの増幅の希釈バッファーでチラミド試薬1:50に希釈が。）このインキュベーションの間、我々は、マイクロ遠心チューブは横に置く。反応時間は、各プローブに対して経験的に決定する必要があります。残念ながら、染色反応は基質が蛍光であるとして視覚的に監視することができない、と一染色反応を通してユビキタス緑色蛍光が表示されます。 </li><li> 30％、50％、75％、PBSで100％メタノールで10分間ずつ洗浄する。 </li><li>第一ペルオキシダーゼを不活性化するために30分間、メタノールで1％の溶液H 2 0 2でインキュベートする。 </li><li> 10分各75％、50％、PBSで30％のメタノールを洗ってください。その後、PBSで10分間ずつ2回洗浄する。 METのそのすべてが重要です。hanolは削除される。 </li></ol>チラミドシグナル増幅について​​の注意： 我々は、パーキンエルマーTSAキットを使用している。我々はAlexa -チラミド基質がパーキンエルマーの増幅の希釈バッファーを使用しても汚れがわかりますが、我々はInvitrogen社/ Molecular Probes社のキットに付属の染色バッファーを使用して成功を収めていない。最後に、我々は、フルオレセインとAlexa - 647は影響を受けないままCy5蛍光は、その後のメタノール/ H 2 O 2処理によって除去されることを見出した。 Cy3にも悪影響を、それが構造的にCy5標識に関連しているとして、メタノール/ H 2 O 2処理によって影響を受ける可能性があります。このような理由から、Cy3およびCy5 TSA反応は、その場のプロトコルで二重蛍光第二染色反応に使用する必要があります。 8。 ANTI -ジゴキシゲニン抗体インキュベーション<ol><li> 1Xマレイン酸緩衝液を加えた2パーセントのブロッキング試薬の溶液に、室温で少なくとも1時間再び胚をブロックします。 </li><li>上記ブロッキング溶液で1:1000希釈でRoche社によって提供された抗DIG POD抗体を追加</li><li> 4℃で一晩インキュベートするこのインキュベーションの間、我々は、その側のマイクロ遠心チューブを置く。 </li><li> 1Xマレイン酸緩衝液で4 × 20分間洗浄します。 PBSで2回（各5分間）洗浄する。 </li></ol> 9。ジゴキシゲニン-ラベル付きプローブの検出<ol><li>このインキュベーションの間にTSAで30〜60分プラスCy5とソリューションを（染色液を作る前に、TSAの基板にスピンダウン。反応は、増幅の希釈バッファーでチラミド試薬1:50に希釈）インキュベート、我々は、マイクロ遠心チューブは横に置く。反応時間は、各プローブに対して経験的に決定する必要があります。 </li><li> PBSTで10分間ずつ3回洗浄する。 </li></ol> 10。ヨウ化プロピジウム染色<ol><li> 2 × SSCで2回（各5分間）洗浄する。 </li><li> 37℃で30分間胚をインキュベートします10μlのRNアーゼ（100μg/mlの最終濃度）と50μlの2 × SSCTでC。 </li><li>室温で2 × SSCで3分間ずつ6回洗浄する。 </li><li> 2 × SSCで330μg/mlのヨウ化プロピジウムの溶液中で8​​分間胚を染色。 </li><li>室温で2 × SSCで3分間ずつ6回洗浄する。 </li><li>室温でPBS中4％PFAで20分間固定する。 </li><li>室温でPBSTで、各5分間、2回洗浄する。 </li></ol> 11。拭き取り方<ol><li> 10分25％それぞれPBSTで50％グリセロールのために胚をインキュベートする。 4℃で75％グリセロール中で一晩クリア</li><li>我々は、胚および顕微鏡スライド上にマウントフラットを細かく分析し、deyolk。卵黄はかなりのバックグラウンド蛍光を生成することができます。解剖では、胚がgylcerolでovenightをクリアした後にはるかに簡単です。 </li></ol>ソリューション： <table border="1"><tbody><tr><td> PBST </td><td> PBS +0.1％のTween </td><td></td></tr><tr><td> SSCT </td><td> SSC +0.1％のTween </td><td></td></tr><tr><td> HYB - </td><td> 50％のホルムアミド 5xSSC 0.1％のTween - 20 </td><td></td></tr><tr><td> HYB + </td><td> HYB - 5mg/mlトルラ（酵母）RNA 50μg/mlヘパリン</td><td style="width: 300px;">トルラRNAは、その後のフェノール、とRNAのプロテイナーゼK消化によって調製されるフェノール - クロロホルム - 、及びクロロホルム- extraction.The RNAを沈殿させ、DEPC処理水に溶解する。 </td></tr><tr><td> 1 ×マレイン酸バッファー</td><td> 150mmのマレイン酸、100mMの塩化ナトリウム液（pH7.5） </td><td></td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1229/Brend_Holley_Fig1.png" alt="図1" width="600" height="688" /> 図1代表的なin situハイブリダイゼーション二重蛍光全体のマウントの結果を。 （AC）。画像は10体節段階で、ゼブラフィッシュ胚の後部領域を介して単一の共焦点セクションを示しています。ビューには、上部に前方と背側です。ヨウ化プロピジウムで染色された核は青色です。 （A）deltaCのmRNAは、ジゴキシゲニン標識リボプローブとTSA - Cy5の試薬 ​​を用いて検出した。 （B）HER1の遺伝子から転写されたmRNAフルオレセイン標識リボプローブとTSA -フルオレセイン試薬で検出された。 （C）緑と赤のチャネルを統合すると、明確に二つの遺伝子の異なるまたは重複する遺伝子発現の領域を識別します。 （D、E）HER1表現の詳細は、この手順の高解像度を実証。 mRNAの細胞内局在を明確に識別できる。矢頭は核内染色のドットによって明らかにアクティブな転写を示す細胞を、示している。矢印は、mRNAの細胞質局在を示す細胞を示している。 （F、G）HER1とdeltaCのための二重染色は、別々に両方の遺伝子（白矢印）、またはいずれかの遺伝子を転写している細胞（赤と緑の矢印）を明らかにする。

<ol><li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li>
<li>Jülich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beamter%2FdeltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation%2C+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li>
<li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming%2C+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li>
<li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
</ol>

ここで紹介するプロトコールは、典型的なアルカリホスファターゼを介した反応で30〜45分のために染色した後、クリーンな強力な信号を与えるプローブでうまく動作します。 in situハイブリダイゼーションのプロトコールで蛍光を実行する前に、我々は常に標準の非蛍光プロトコルを（プローブの合成プロトコルと共に補足資料で提供される）を使用して私たちのプローブをテストします。弱いプローブを使用するときに我々は、in situハイブリダイゼーションのプロトコールで蛍光灯とあまり成功を収めているが、それはいくつかのケースでは可能かもしれない。私たちは正常にβ-カテニン3の免疫局在とin situハイブリダイゼーションのプロトコールで蛍光を組み合わせている。この変化を実行するときに、私たちは行っHYB -、HYB +および55℃のハイブリダイゼーションのインキュベーション° Cではなく、65 ° Cエピトープは、低い温度でよりよい維持される表示される。免疫局在のインキュベーションは、TSAの反応の後に実行されます。 フルオレセイン標識プローブは、同じ遺伝子のジゴキシゲニン標識プ...

<table><tbody><tr><td>パラホルムアルデヒド 16%溶液、EMグレード</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>1.33x PBSで4%に希釈する（最終濃度1x）。2mlずつ分注し&amp;#8211;20&amp;#x00B0;Cで保存する。</td></tr><tr><td>Proteinase K、リコンビナント PCRグレード</td><td>Roche Group</td><td>03115879001</td><td>水を用いて20mg/mlのストック溶液を調製する。1mlずつ分注し&amp;#8211;20&amp;#x00B0;Cで保存する。</td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>1xマレイン酸緩衝液を用いて10%のストック溶液を調製する。50mlずつ分注し&amp;#8211;20&amp;#x00B0;Cで保存する。複数回の凍結融解後も安定である。</td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-POD、Fabフラグメント</td><td>Roche Group</td><td>11426346910</td><td>分注し-20&amp;#x00B0;Cで保存する。使用分を1つ4&amp;#x00B0;Cで保管する。</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-POD、Fabフラグメント</td><td>Roche Group</td><td>11207739910</td><td>上記と同様。</td></tr><tr><td>TSA Plus Fluorescein システム</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL741001KT</td><td>TSA試薬の各バイアルは必要時にのみ調製する。60&amp;#x03BC;lのDMSOに溶解させる。4&amp;#x00B0;Cで保存する。</td></tr><tr><td>TSA Plus Cyanine5 システム</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL745001KT</td><td>上記と同様</td></tr><tr><td>TSA Plus Cyanine3 システム</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT</td><td>上記と同様</td></tr><tr><td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 チラミド（HRP-goat-anti-rabbit IgGを含む）</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>T20926</td><td>チラミド試薬を150&amp;#x03BC;lのDMSOに溶解し、分注して&amp;#8211;20&amp;#x00B0;Cで保存する。</td></tr><tr><td>RNase、DNaseフリー</td><td>Roche Group</td><td>11119915001</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml溶液として供給される</td></tr><tr><td>プロピジウムヨウ化物</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>P-3566</td><td>水に溶解した1mg/ml溶液として供給される。</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

全体のマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、高解像度の二重蛍光を示す<em&gt;その場で</em単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためのと二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するための&gt;ハイブリダイゼーションプロトコル。プロトコルは、標準の修正バージョンです。<em&gt;その場で</emこのようなNBT / BCIPやFast Redなどのアルカリホスファターゼと基板を使用して&gt;ハイブリダイゼーション<sup&gt; 1,2</sup&gt;。このプロトコルは、チラミドシグナル増幅（TSA）と一緒に標準的なジゴキシゲニンおよびフルオレセイン標識プローブを利用<sup&gt; 3</sup&gt;。市販のTSAキットには、緑から遠赤色に蛍光発光のような柔軟な実験計画がこのようなヨウ化プロピジウム、またはタンパク質の蛍光免疫組織化学などの様々な核染色と組み合わせて使用​​することができることができます。 TSAは、迅速に共有結合標識アンチセンスリボプローブのすぐ近くに、部分、通常はチロシン残基に結合する反応性蛍光基質を生成します。結果として得られる染色パターンは、mRNAの細胞内局在性の高分解能であるレーザ走査共焦点顕微鏡を用いて観察することができます。<sup&gt; 3,4</sup&gt;。一つは、染色体の遺伝子座での新生転写物を観察し、核と細胞質染色を区別し、mRNAの皮質局在などの他のパタ​​ーンを視覚化することができます。の研究<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; mRNAの約70％は頻繁にコードされたタンパク質の機能と相関する細胞内局在性の特定のパターンを示すことを示している<sup&gt; 5</sup&gt;。 3D共焦点データセットのコンピュータ支援復興と組み合わせると、我々のプロトコルは、全体の脊椎動物の胚では、サブ携帯の解像度を持つmRNAの分布を詳細に分析することができます。

in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin situハイブリダイゼーションのプロトコールで二重蛍光の高解像度を示す。我々は、組織の組織を強調するためにカウンター染色核のヨウ化プロピジウムを含む。

ホールマウントin situハイブリダイゼーションは、発生生物学において最も広く用いられている手法の一つです。本稿では、高解像度のダブル...

この手順により、ゼブラフィッシュ胚における遺伝子発現パターンを高解像度で決定することが可能です。アンチセンスリボプローブを相補的な標的mRNAにハイブリダイズさせます。標識されたリボプローブは、ペルオキシダーゼ酵素が結合した抗体によって認識されます。胚にアラミド結合フルオロフォーを添加すると、ペルオキシダーゼがIDEを高度に反応性のある化合物に変換します。これにより、フルオロフォーが安定的に沈着します。未結合のIDEを洗浄して除去することで、mRNA分布の詳細な細胞内パターンが明らかになります。明確にラベル付けされたプローブと異なるタイロム・フルオロ（tyrom fluoro）を用いることで、2つ目の遺伝子の発現を観察でき、発現の詳細な比較が可能になります。こんにちは、イェール大学分子・細胞・発生生物学部のスコット・ホリー（Scott Holly）研究室のティム・ブレント（Tim Brent）です。本日は、ゼブラフィッシュ胚を用いたホールマウント高解像度二重蛍光in situハイブリダイゼーションの手順をご紹介します。この手順を用いて、ゼブラフィッシュの分節化について研究します。それでは、始めていきましょう。まず、パラホルムアルデヒドを用いて冷所で一晩固定した胚を用意し、手順を開始します。今回の固定においては、解凍したばかりのパラホルムアルデヒドストック溶液を使用することが、染色を成功させるための重要なポイントとなります。固定液を除去し、室温のPBSで胚を5分間ずつ2回洗浄します。次に、胚の絨毛膜を除去します。胚をガラス製ディプレッションプレートに置きます。ここからは時計職人用ピンセットを使用して、絨毛膜を取り除いてください。胚の移動には、火炎滅菌して先端を丸めたガラス製パストゥールピペットを使用します。そうしないと、胚が通常のポリプロピレン製チップに付着してしまいます。脱塩素化された胚は、メタノール濃度を段階的に上げていく一連の洗浄工程を経て移送されます。最後の洗浄は100% methanolで行います。最後に、胚を新鮮なメタノールに入れ、-20°Cで一晩保存します。翌日、メタノール濃度を段階的に下げた一連の洗浄を行い、その後PBSTバッファーで5分間ずつ2回洗浄して胚を移行させます。次に、パラホルムアルデヒドを用いて胚を20分間固定します。PBSTで5分間の洗浄を2回行い、短時間の固定を終了します。これで胚の透過処理を行う準備が整いました。固定した胚をProteinase Kと共にインキュベートすることで、透過処理を行います。この際、マイクロ遠心チューブを横向きに寝かせて置いてください。消化ステップの時間は、胚の齢によって異なります。例えば、体節形成期（somato agenesis stage）の胚は3〜4分間インキュベートします。PBSTで短時間すすぎ、その後、PBSTで1回、5分間洗浄します。胚をパラホルムアルデヒドで固定します。最後に、PBSTで5分間、胚を2回洗浄します。これで、RNAプローブを用いたハイブリダイゼーションの準備が整いました。胚の固定と透過処理が完了しましたので、65 °Cで5分間のHigh Minusインキュベーションを行い、ハイブリダイゼーション工程を開始します。使用前にHIIN溶液を予熱させておくことを忘れないでください。次に、胚をHigh Plusの中で1時間インキュベートします。繰り返しになりますが、ハイプラス溶液をあらかじめ予熱しておくことを忘れないでください。次に、ハイプラス溶液の大部分を除去しますが、胚が完全に浸っていることを確認しながら50 µL分は残しておきます。各プローブを1 µLずつ加え、チューブを軽く指で弾いて混ぜ合わせます。これ以降、チューブをアルミホイルで覆ってください。フルオレセインは光に敏感であるためです。65°Cで一晩インキュベートし、ハイブリダイゼーションを完了させます。それでは、ここから過剰なプローブを除去しましょう。染色の質を向上させるため、界面活性剤を除去します。ただし、界面活性剤がない状態では胚が粘着質になることに注意してください。50%ホルムアミド含有2X SSC溶液で、1回30分間の洗浄を2回行います。1回洗浄し、その後2x SSC溶液で15分間洗浄します。最後に、0.2x SSCで30分ずつ2回洗浄します。次に、各プローブを可視化します。これで、ハイブリダイズしたプローブの検出を開始できます。フルオレセインプローブはジゴキシゲニン（dig oxygen）プローブよりも安定性が低く、シグナルが弱いため、先に検出します。まず、マレイン酸緩衝液で調製した2%ブロッキング試薬500 µLを用いて、室温で1時間ブロッキングを行います。次に、ペルオキシダーゼ標識抗フルオレセイン抗体をブロッキング溶液で1:500に希釈して加えます。4 °Cで一晩インキュベートします。その際、マイクロ遠心チューブを横にして置いてください。次に、tyrom信号増幅システムを用いて検出を開始します。TSA TYROM IDEはフルオロフォアに結合しています。抗体上の西洋わさびペルオキシダーゼがTY IDEを反応性の高い中間体へと変換します。この反応性TY IDEが抗体の近接にある残基と共有結合を形成し、その結果、フルオロフォアが局所的に沈着します。室温で1×マレイン酸緩衝液を用いて20分間の洗浄を4回行い、その後PBSで2回洗浄します。フルオレセインTY IDEは、保存のためにあらかじめDMSOに溶解させておきます。このTSA基質を短時間遠心して液を回収します。次に、TSA基質を増幅希釈バッファーで50倍に希釈します。この溶液を胚に加え、45分間インキュベートします。マイクロ遠心チューブを横向きに置きます。このインキュベーションステップの間、メタノール濃度を徐々に上げて、10分間ずつの洗浄を繰り返して胚を移行させます。最後の洗浄は100%メタノールで10分間行います。その後、抗体のペルオキシダーゼを不活性化するため、1%過酸化水素溶液中で30分間インキュベートします。これを行わないと、dig oxygen inの検出を妨げる可能性があります。胚を、段階的に濃度を下げた一連のメタノール洗浄と、10分間のPBSバッファーによる2回の洗浄にかけ、プローブを転移させます。これにより、すべてのメタノールが除去されます。dig xigenおよびプローブの抗体標識は、前回の抗体と同様にブロッキングから開始します。次に、抗dig oxygenin抗体を1/1000に希釈して加えます。マイクロ遠心チューブを横に寝かせ、低温下で一晩インキュベートし、翌日に取り出します。室温でマレイン酸緩衝液を用いて洗浄します。次に、PBSで洗浄し、SCI five tyrom基質を調製します。これを1:50に希釈して胚に添加します。チューブを横にした状態で45分間インキュベートします。最後に、PBSTで3回洗浄します。プロピジウムヨウライドを用いた最終染色ステップで核を標識します。まず、2 XSSCで5分間の洗浄を2回行います。次に、37°Cで30分間、RNAで処理します。室温で2XSSCを用いて6回洗浄し、プロピジウムヨード溶液を加えて8分間染色します。2XSSCで6回洗浄します。胚をパラホルムアルデヒドで20分間固定します。最後に、PBSTで5分間の洗浄を2回行います。観察のための胚の封入は、25%および50%グリセロールでそれぞれ10分間、計2回のインキュベーションから開始します。次に、サンプルを75% glycerolに入れ、4 °Cで一晩インキュベートします。この一晩の透明化ステップにより、胚の解剖が容易になります。最後に、胚から卵黄を解剖して除去します。バックグラウンド蛍光を低減するため、胚を顕微鏡スライドガラス上にフラットマウントし、顕微鏡下で観察します。これらの画像は、10 somite期のゼブラフィッシュ胚の後端を通る単一の共焦点断面を示しています。赤色の染色は、digoxigenin標識プローブとTSA試薬を用いて検出されたdelta C mRNAを示しています。緑色の染色は、フルオレセイン標識プローブによって検出されたher 1 mRNAを示しています。また、TSAフルオレセイン試薬と、プロピジウムヨードで染色された核が、二重染色された胚において青色に色付けされています。発現領域が明確に分かれているか、あるいは重複しているかを曖昧さなく判定することが可能です。また、この手順により、これらの拡大図に示されるHER1染色の結果のように、mRNAの細胞内局在が明らかになります。核内に見られる点状の染色は、遺伝子の活発な転写を示しています。他の細胞では、mRNAが細胞質に局在しています。二重染色した胚では、両方の遺伝子を転写している細胞、またはどちらか一方の遺伝子のみを転写している細胞が観察できます。別途、ゼブラフィッシュ胚におけるホールマウント高解像度二重蛍光in situハイブリダイゼーションの手法を説明しました。この手順を行う際は、まず標準的なアルカリホスファターゼを用いた染色でプローブをテストすることが重要である点に留意してください。クリーンで強いシグナルが得られるプローブは、蛍光in situハイブリダイゼーションにおいても良好に機能します。また、プロピジウムヨード染色に代わり、β-カテニンの免疫局在法を正常に使用することができました。このバリエーションを行う際は、ハイブリダイゼーション反応を65°Cではなく55°Cで実施します。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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多層はゼブラフィッシュの長期シート光顕微鏡用に取り付け

ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。...

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

ゼブラフィッシュ胚は、発生生物学の研究のための優れたモデルである。胚発生の間に、ゼブラフィッシュは、試料観察および分析のための3次元の課題が卵黄塊で開発しています。このプロトコルは、その場でホールマウントの準備を取り付ける2次元の平面を作成する方法について説明します（WISH）は、ゼブラフィッシュ胚の標本を染色した。...

ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

ゼブラフィッシュにおける間腎腺は、哺乳動物の副腎の硬骨魚類の対応です。酵素活性アッセイ、開発ゼブラフィッシュでは、分化ステロイド産生細胞を検出し、このプロトコルは、3-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（3β-HSDΔ5-4イソメラーゼ）を実行する方法を紹介します。...

腎間のステロイド合成組織とゼブラフィッシュにおけるその血管微小環境の可視化

繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。...

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

ここでは、ゼブラフィッシュ胚および幼虫の全製剤におけるタンパク質の蛍光抗体媒介検出に関するプロトコルを提示する。...

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ...

その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

ライトシート顕微鏡を使用して、無傷の絨毛膜内の初期のゼブラフィッシュ胚をイメージングするためのサンプル調製戦略について説明します。これは、70%エピボリーおよび芽の段階で胚が絨毛膜内で獲得するさまざまな向きを分析し、ライトシートシステムを使用して胚全体で細胞スケールの分解能を得るためのイメージング戦略を詳しく説明します。...

初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

ここでは、ゼブラフィッシュの低存在量タンパク質の可視化に特に有用な、新たに開発および改変された in vivo...

ゼブラフィッシュの低発現タンパク質を可視化するための蛍光標識

学ぶ ゼブラフィッシュ胚における高分解能二重蛍光インプローブハイブリダイゼーション法を用いた遺伝子発現パターン解析。この手法により、2つの遺伝子の発現ドメインの重なりを可視化し、発生生物学研究に有用です。

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

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