Name: 脳バンキング：あなたの研究の標本のほとんどを作る (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶ脳バンキングの標準プロトコル。クライオスタットによる系統的切片採取と抗原保存液での長期保存手法を解説。神経科学研究における無偏倚ステレオロジー分析の基盤となる技術です。

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著者は、彼の継続的な技術サポートのためにIkiel Ptitoに感謝します。

パート1：組織の前処理<ol><li>組織はよくパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはホルマリンで灌流してください。これは通常、他の臓器を収穫するために使用される標準transcardial灌流によって達成することができます。本研究では被験者は深く、（10 mg / kgを、IM）塩酸ケタミンで鎮静したペントバルビタールナトリウムの過剰投与（25 mg / kgを、IV）を使用して、安楽死させ、完全に放血するまで0.1MのPBSでtranscardially灌流。これは、5分（〜1リットル）のためのPBS中4％パラホルムアルデヒド溶液が続いている。 </li><li>脳は、定位、ブロック頭蓋骨から削除、秤量し、ボリュームは2を決定する必要があります。組織は、その後リン酸緩衝液で30％のショ糖の最終濃度に段階的スクロース溶液で凍結保護されるべきである。組織のブロックがその後-65 ° Cでイソペンタンで凍結し、-80で保存してください° C、スライスする準備が整うまで。 </li></ol>パート2：システマティックサンプリング<ol><li>系統的サンプリングは、前の切片に適切な計画に依存しています。吻側 - 尾と背腹のエクステントの両方に関心の全領域は明確に定義されるべきである。使用中の種の脳地図は、関心領域を定義し、関心領域の長さを決定しておくと便利です。かつて関心領域の長さは、それがサンプリング間隔を確立する必要がある決定されます。例えば、脳地図からあなたは、冠状面でのセクショニング時に関心領域の全体rostro -尾程度の長さが約3mmであると判断する。次に、50μmの時にセクションにクライオスタットを設定するには、このレートでは関心領域の吻側 - 尾程度をカバーする60のセクションを持って決める。典型的な立体的研究のために60から10まで体系的にサンプリングされたセクションは、信頼できる結果を得るために必要とされています。この例では10のセクションでは、均等に6分の1のセクションのサンプリング間隔でrostro -尾程度の結果全体に等間隔。 </li></ol>パート3：脳バンクの作成<ol><li>節のサンプリング周波数が決定されると、次のステップは汚れがすぐに実行されるかを決定することです。たとえば、クレシルバイオレットで染色している​​場合には、スライドの1 / 6つのセクションをキャプチャします。これはシリーズ1になります。あなたはそこにあなたが実行したいが、どちらをプライマリ染み提供するデータを参照するか、単に免疫組織化学を実行する時間を持っていない、彼らはその順序でセクションの残りの5シリーズを配置することかもしれないいくつかの潜在的な抗体を知っていれば抗原保護区域 （1％ポリビニルピロリドン、o.1M PBS、pH7.4中50％エチレングリコール）を含むウェルにスライスされた。下の表は、1スライドと脳バンク（表1）の一環として、セクションの1枚（標準48ウェルプレート）で構成されるサンプリング方式を提供します。 <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="表1" /> 表1ここにセクションのサンプリング周波数は1 / 6です。最初のセクションは、クレシルバイオレット染色用スライド上に配置され、次の5つのセクションが保持する抗原に配置されます。セクションの番号7は、スライド上に捕獲され、セクションは、9月12日維持抗原に配置されます。組織の利益またはブロックの領域が網羅的に区分されるまで、このサイクルが繰り返されます。 </li><li>次のステップは、徹底的にセクションに組織のブロックです。チャックでメディアを埋め込むの少量を置き、それがフリーズしましょう​​。ミクロトーム頭にチャックを配置し、平坦な表面を持つように凍結培地を十分に剃り落とす。ミクロトームヘッドとクライオスタット内で平坦な場所からチャックを削除します。チャックでメディアを埋め込む注ぎ、しっかりとチャックを平らに置か定位カット側で脳のブロックを設置。ゆっくりと完全に培地をマウントするに脳を埋め込みます。ミクロトームヘッドと節のサンプリング周波数のためにあらかじめ決められたパラメータを使用してセクションに脳でチャックを置きます。 </li><li>組織のブロックが徹底的に区分されていると節をウェルに配置されると、、蓋でカバープレートをパラフィルムで蓋をラップし、-20℃の冷凍庫内の場所。各シリーズ、セクション、サンプリング間隔、およびそれぞれの動物のための一連の数に要したセクションの合計数をログに記録します。このログは、将来の免疫組織化学のために脳の銀行からセクションのその後の除去を追跡することが重要になります。 </li></ol>パート4：代表的な結果： この方法で体系的なサンプリングは、過去3年間、私たちの研究室で標準的となっています。我々は、それが信号の劣化（図1）することなくスライスした後三年を維持する抗原に格納されている材料に関する免疫組織化学を行う大きな成功があった。さらに、私たちの脳の銀行の一部として我々は非人間の近い〜20,000体系的セクションを記録している霊長類の脳（図2）当社の長期的な研究計画の一環として。 <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> 図1。NeuNは層VIと間質性白質のニューロンの両方を表示するための免疫染色これは、非ヒト霊長類の後頭極からセクションです。この特定のセクションは、2年間の期間は-20℃で保存する抗原に格納されていました。スケールバー=100μmの。 <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="図2" /> 図2我 々のベルベット脳の銀行は現在30以上のサルから近いから20,000の体系のセクションで構成されています。

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

系統的サンプリングは、研究材料を最大にするため安価な方法です。このサンプリングの戦略は、地域全体の体系的なサンプリングを必要とする公平な立体学の規則を遵守するように設計されています。それは、シリーズごとのセクションの順序が維持されていることが重要です。私たちのラボでは、正常ハムスターとヒト以外の霊長類の脳の両方のセクションをバンキングのこのメソッドを使用している。これまでのところ、我々は近い〜20,000ベルベットモンキー（Chlorocebus aethiops sabeus）脳切片を収集しており、日常的に一年以上保存されているセクションにimmunohistochemistyを実行します。よく特徴脳の銀行のメリットは、資金調達の意思決定、新しい学生が迅速にデータを収集し、それによって研究資金を最大限に新しい動物の使用と治療を最小限に抑えるための能力の間でデータを収集する可能性が含まれます。

<table><tbody><tr><td>エチレングリコール</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Scientific 包埋剤</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

脳バンキング：あなたの研究の標本のほとんどを作る

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

公平な立体学が正確かつ効率的に関心のある一定の領域で合計ニューロンの数を（または他の細胞型）を推定するための方法です。<sup&gt; 1</sup&gt;。 60から10まで体系的なセクションを、この目標を達成するため、構造全体をカバーするプローブする必要があります。通常、これは未処理材のかなりの量を残す5分の1のセクションの処理を伴います。素材を最大にするために、我々は長期保存の研究計画の一環として、固定した組織を維持するための安価な方法を提案する。組織が必要な汚れや抗体、別のセクションのためにスライスして処理される際には、体系的に将来の処理のために-20℃で保存する抗原に配置する必要があります。 24ウェルプレートを使用して、セクションは、将来の検索のための順序で配置することができます。この方法を使用して、組織が保存され、年間の経過、免疫組織化学のために処理することができます。

脳の銀行と生体物質の系統的サンプリングは、公平な立体学の基礎を提供し、各試料から得られる潜在的なデータを最大限に高めることができます。

不偏ステレオロジーは、特定の関心領域における総ニューロン数（またはその他の細胞種）を正確かつ効率的に推定するための手法である1。...

本手順を開始するために、まず脳ブロックをクライオスタット用に準備し、切片のサンプリング頻度を決定します。次に、抗原保存液とスライドグラスを準備します。その後、脳ブロックをクライオスタット内部のチャックに固定します。脳が設定された厚さでチャックセクションにしっかりと埋め込まれたら、第1シリーズをスライドに配置し、それ以降のシリーズを抗原保存液で満たしたウェルに配置するように、系統的な切片作成を行います。ブロックをすべて使い切ったら、プレートを-20 °Cの冷凍庫に入れ、脳バンクの一部として保存します。こんにちは、モントリオール大学視能学部の視覚神経科学研究室のMark Burke博士です。こんにちは、モントリオール大学検眼学校の視覚神経科学研究室のShahin Zur博士です。こんにちは、モントリオール大学検眼学校の視覚神経科学研究室のディレクター、Mo Petto博士です。今日は、抗原保存液を用いて脳組織を系統的に保存（バンキング）する手順をご紹介します。当研究室では、研究材料を最大限に活用し、バイアスのない解析を行うための基礎として本手順を用いています。それでは、始めていきましょう。このプロトコルでは、固定後、立体定位法により厚さ1cmのスライスにブロックされ、凍結保存された脳組織を体系的にサンプリングする方法について説明します。これらの前段階の詳細を確認するには、非ヒト霊長類脳の定位空間における解剖を詳述した最近のJoVE論文をご参照ください。系統的サンプリングの最初のステップは、サンプリング計画を作成し、組織をどのように切片化するか、それらの切片をどのようにシリーズまたはサンプルに分割するか、そしてそれらのサンプルをどのように配置し管理するかを決定することです。まず、必要に応じて定位脳地図を確認します。吻側、尾側、および背腹側の各次元において関心領域を明確に定義し、切断平面を選択してください。次に、切片の厚さを決定し、関心領域からいくつの切片を作成できるか計算します。例えば、立体定位脳地図から、関心領域の吻側・尾側の全範囲がおよそ3 mmであることを確認します。次に、クライオスタットの切片厚を50 µmに設定します。この厚さで切削すると、全領域をカバーする冠状断切片が60枚得られます。ここで、サンプリング間隔を決定します。一般的な非偏倚的な形態学的研究において、信頼性の高い結果を得るには、系統的にサンプリングされた6〜10枚の切片が必要です。この例では、Ros coddleの全範囲に等間隔で10個の切片を配置した結果、6切片に1切片というサンプリング間隔になります。この切片サンプリング頻度を決定したら、次にどの染色を行うか decides してください。直ちに染色したい切片は、組織を薄切すると同時に、直接スライドガラスに貼付します。例えば、クリスタルバイオレットで染色する場合、スライド1枚につき6つの切片のうち1つを回収します。これがシリーズ1となります。残りの切片は、後の免疫組織化学染色のために、抗原保存液を含むプレートに保存します。ここに示すサンプリング計画は、脳バンクの一部として、2枚のスライドと標準的な24ウェルプレート1枚の切片で構成されており、この組織ブロックに対して計6つのシリーズを作成します。次のステップは、クライオスタットマイクロトームを用いて組織ブロックを完全に切断することです。まず、凍結組織サンプルを、マイクロトームのヘッドに装着されサンプルのステージとして機能するチャックと呼ばれる部品に固定する必要があります。まず、少量の包埋剤をチャックに乗せ、凍結させます。チャックをミクロトームヘッドにセットし、サンプルを設置するための平坦な面ができるまで、凍結した包埋剤を削り取ります。チャックをミクロトームヘッドから取り外し、クライオスタット内に水平に設置します。チャックの上に包埋剤を注ぎ、しっかりと定着させます。脳ブロックの切断面を下にして、ゆっくりと完全にチャック上に配置します。脳組織をマウント剤で包埋します。脳を装着したチャックを、あらかじめ設定したサンプリング頻度に基づき、ミクロトームのヘッドセクションにセットします。スライドに貼付するか、抗原保存液を含むプレートの指定されたシリーズに追加して切片を作成した後、切片の順序が乱れないよう十分に注意してください。後で脳バンクに戻り、別の系統的なサンプリングを行えるように切断します。組織の切片作成を完了し、各切片をウェルに配置したら、プレートに蓋をし、パラフィルムで蓋を包んで-20°Cのフリーザーに保管します。各シリーズの総切片数、切片のサンプリング間隔、および動物1匹あたりのシリーズ数を記録してください。この記録は、今後の実験のためにブレインバンクから切片を取り出す際に、切片を追跡するために不可欠となります。このような方法で系統的にサンプリングを行うことは、当研究室における標準的な手法となっています。過去3年間にわたり、抗原保存液（antigen preserve）で3年間保存した試料を用いて免疫組織化学染色を行い、シグナルの劣化なく大きな成果を得てきました。さらに、当研究室のブレインバンクの一部として、非ヒト霊長類脳の系統的切片を20,000枚近く記録しています。私たちの長期的な研究計画の一環として、生物学的標本を系統的にサンプリングし、保存する方法を説明しました。この手順を行う際は、採取したシリーズの総数と、1シリーズあたりの切片の総数を詳細なログに記録しておくことが重要です。また、切片の紛失や損傷が発生した場合は、系統的なサンプリング手順を維持するために、その切片番号をログブックに記録してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っています。

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