Name: タンパク質のユビキチン化の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶタンパク質のユビキチン化検出法。培養細胞とin vitroの両方で有効なプロトコルを用い、免疫沈降とウェスタンブロッティングで修飾タンパク質を可視化します。パーキンなどのユビキチンリガーゼと基質の研究に応用可能です。

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再生医療助成RS1 - 00331から1のためのカリフォルニア工科大学とRL1 - 00682から1（Z.チャンへ）;アメリカのパーキンソンこの作品は、NIHの助成金RO1 DC006497、RO1 NS057289、及びPO1 ES016738（Z.チャンへ）によってサポートされていました疾患協会（Z. ZhangとYSチューチューへ）、およびパーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団（Z.チャン）。

培養細胞におけるタンパク質のユビキチン化の検出<ol><li>ユビキチン目的のタンパク質を発現するプラスミドを培養細胞をトランスフェクトし、（のエピトープタグ付きバージョン）。 </li><li> 2mMのナトリウムオルトバナジン、50mMのフッ化ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤との完全な細胞溶解緩衝液（2％SDS、150mMのNaCl、10mMトリス- HCl、pH 8.0）を行う。 </li><li>プレート当たり100μlの細胞溶解緩衝液（6 cmのシャーレ）で細胞を溶解する。大きな皿が使用されている場合は、それに応じて音量を調整します。スワール溶解バッファーは、培養した細胞の全領域をカバーするように慎重に料理を。 </li><li>セルスクレーパーで細胞を回収し、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに細胞ライセートを転送する。 10分間沸騰し、すぐにホットプレートの上にチューブを置きます。 </li><li>超音波処理装置とせん断は、細胞。 </li><li>希釈バッファーの900ul（10mMトリス- HCl、pH8.0の、150mMのNaCl、2mMのEDTA、1％のトリトン）を追加します。回転で30〜60分間4℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 30分、20,000 × gで希釈した試料を回転させる。新しいエッペンドルフチュー​​ブに得られた上清を移す。ペレットを乱さないように注意してください。 </li><li>タンパク質濃度を測定する。 </li><li>互換性のあるバッファー（50％スラリー）中の標的タンパク質に対してタンパク質またはG -アガロースビーズ標識抗体を準備します。 P - 200ピペットの先端の狭い方の端をカットし、免疫沈降のために準備した細胞ライセートの500-1,500μgのために樹脂の14〜20μlを移す。高いトランスフェクション効率と細胞の場合は、500μgのは十分だろう。低トランスフェクション効率と細胞の場合は、より多くのタンパク質が必要になることがあります。 </li><li>回転と℃で一晩4℃で細胞ライセートをビーズ混合物をインキュベートする。 </li><li> 5分間5000 × gでビーズをスピンダウン。上清を吸引除去する。回洗浄緩衝液（10mMトリス- HCl、pH8.0の、1MのNaCl、1mMのEDTA、1％NP - 40）で樹脂を洗浄します。 </li><li> 30秒間に20,000 xgで最終的な時間のためのビーズを回転させる。残留した洗浄液を吸引除去し、2X SDSローディングバッファーでレジンを煮る。 </li><li>分析をイムノブロッティングのためにSDS - PAGEゲルにサンプルをロードします。 </li><li>それぞれの抗体によるユビキチンと標的蛋白質を検出。免疫ブロッティングのために、我々は通常、最初のユビキチンを検出。膜は、タンパク質の沈殿を検出するために使用されます。 </li></ol> in vitroのユビキチン化アッセイを介して標的タンパク質に対するユビキチン化の検出<ol><li> 5Xユビキチン化バッファー（100mMトリス- HCl、pH7.5の25 mMのMgCl 2、2.5mMのDTT、10mMのATP）を作る。最大6ヶ月間-20℃で小分けに格納します。プロトコルによっては、ATP再生1,2用のバッファにクレアチンリン酸とクレアチンキナーゼを追加。 </li><li>各反応について、以下を含む混合物を準備します。 <table border="1"><tbody><tr><td> μlの8 </td><td> 5Xユビキチン化バッファ</td></tr><tr><td> 250 ngの</td><td>ユビキチンE1 </td></tr><tr><td> 500 ngの</td><td>ユビキチンE2 </td></tr><tr><td> 0.5μgの</td><td>ユビキチン</td></tr><tr><td> 0.5μgの</td><td>目的のタンパク質</td></tr><tr><td></td><td> 40μlの全体積に水</td></tr></tbody></table>対照として、E1、E2、またはユビキチンのどちらかがない場合に同様の反応を準備する。 </li><li> ℃で1時間以上37℃混合物をインキュベートする。 </li><li> SDS - PAGEサンプルバッファーを加え、反応を停止し、10分間サンプルを煮る。 </li><li>分析をイムノブロッティングのためにSDS - PAGEゲルにサンプルをロードします。 </li><li>それぞれの抗体によるユビキチンと標的蛋白質を検出。 </li></ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

このプレゼンテーションでは、まず、培養哺乳動物細胞で目的のタンパク質にユビキチン修飾を検出可能にする手順を説明した。特に興味の蛋白質ではなく、非共有結合的に相互作用するタンパク質のユビキチン化を検出するために、我々は、細胞溶解、免疫沈降および1,3を洗浄するための厳しい条件を使用していました。抗ユビキチンブロッティングが続くような過酷な条件で標的タンパク質の免疫沈降で検出されたユビキチン化は、したがって、標的タンパク質に特異的である可能性が高いです。実験手順の間にタンパク質の脱ユビキチン化を防ぐために、例えば、N -エチルマレイミドおよびユビキチンアルデヒドなどの脱ユビキチン化酵素阻害剤はすべてのバッファ4に追加される可能性があります。しかし、それは脱ユビキチン化酵素は、10分煮沸手順後にアクティブのままになることはほとんどありません。高い分子種の強いスミアやはしごは、通常、ユビキチン化の結果です。目的のタンパク質のユビキチン化の程度は、いくつかの実験条件でユビキチン化/無修正の標的タンパク質の比率を比較することにより評価することができる。標的タンパク質のユビキチン化を増加さ...

タンパク質のユビキチン化の検出

Detection of Protein Ubiquitination

ユビキチン化、タンパク質を標的とするペプチドユビキチンの共有結合は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。彼らは、ユビキチン活性化酵素E1、ユビキチン結合酵素E2、およびユビキチンリガーゼE3が含まれています。 E1とE2のとは違って、E3ユビキチンリガーゼの基質特異性を表示します。一方、多数のdeubiquitylating酵素はポリユビキチン化タンパク質を処理するの役割を担っている。ユビキチンは、タンパク質の安定性、細胞内局在、及び生物学的活性の変化をもたらすことができる。ユビキチン化/脱ユビキチン化経路または変更されたユビキチンシステムの機能に関与する遺伝子の変異は、癌、神経変性、および代謝性疾患の様々なタイプなど、さまざまなヒト疾患に関連付けられています。標的タンパク質の改変されたか、通常のユビキチン化の検出は、これらの疾患の病因に関するより良い理解を提供することがあります。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明<em&gt; in vivoで</em&gt;と試験管<em&gt; in vitroで</em&gt;。これらのプロトコルはまた、sumolyationとneddylationなどの他のユビキチン様小分子の改変を検出するのに有用です。

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明<em&gt; in vivoで</em&gt;と試験管<em&gt; in vitroで</em&gt;。

ユビキチン化（ポリペプチドであるユビキチンを標的タンパク質に共有結合させること）は、一連の...によって行われる重要な翻訳後修飾である。

こんにちは。バーミンガム医学研究機構のJo研究室のChuです。本日は、タンパク質のユビキチン化を検出する方法について解説します。当研究室では、パーキンソン病に関連するUBI3リガーゼとその基質を研究するために、この手法を用いています。それでは始めましょう。このプロトコルの最初の手順として、標的タンパク質とエピトープタグ付きユビキチンを両方発現するプラスミドを細胞にトランスフェクションします。細胞を約40時間培養した後、実験台に移動して細胞を溶解させます。液状の培地を吸引して取り除き、PBSで細胞を2回洗浄してください。次に、6 cmプレートあたり2% SDSを含む細胞溶解バッファー100 µLを添加して細胞を溶解します。各プレートを旋回させ、バッファーが細胞全体を覆うようにします。続いて、セルスクレイパーを用いて溶解した細胞を回収し、1.5 mLのエッペンドルフチューブに移します。チューブを直ちにヒートブロックにセットし、溶菌した細胞を10分間沸騰させて、タンパク質をさらに変性・溶解させます。沸騰後、超音波破砕機を用いて細胞およびそのDNAを剪断します。この操作により、細胞ライセートの粘性が低下します。超音波処理後、希釈バッファーを900 µL加え、サンプルを4 °Cで30〜60分間回転混和させます。インキュベーション後、可溶性タンパク質を得るために、希釈したサンプルを4 °C、20,000 ×gで30分間遠心分離します。その後、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を新しいエッペンドルフチューブに移します。最後に、ここで使用している修正Lowry法などの方法で、上清中のタンパク質濃度を測定します。これで、免疫沈降法を用いて、上清中の他のタンパク質から目的のタンパク質を単離する準備が整いました。免疫沈降の最初のステップは、目的のタンパク質に対する抗体が結合したビーズを調製することです。市販の抗体結合ビーズを使用するか、クロスリンカーを用いて抗体固定化ビーズを自作することができます。本手順のように、アミノ沈降反応を行うため、適合するバッファー中で抗体固定化ビーズを準備し、50%のスラリーを作成します。P 200 ピペットチップの先端を切り取り、14～20 µL のレジンを 500～1500 µg の調製済み細胞ライセートに分注してください。細胞のトランスフェクション効率に応じて、使用する細胞溶解液の量を調整してください。細胞溶解液とビーズの混合物を4 °Cで一晩回転させます。この間に、ビーズ結合抗体が標的タンパク質に特異的に結合します。翌日、ビーズを 5,000 Gs で 5 分間、4 °C で遠心分離し、タンパク質をペレット化します。タンパク質がビーズに結合した状態で、上清を吸引除去し、5,000 Gs で 5 分間の遠心分離を 2 回繰り返して、高塩濃

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、複雑なペプチド混合物から残留ジグリシンペプチドを含むユビキチン化ペプチドを抽出し精製する方法について説明しています。提示された方法は、タンパク質中の元のユビキチン化部位を同定するのに役立つ可能性があります。...

ユビキチン化ペプチドの免疫親和性ベースの抽出:精製ペプチド画分からユビキチンタグ付きペプチドを選択的に抽出する技術

現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。...

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。...

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。...

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

このプロトコルは、例としてp53腫瘍抑制タンパク質を使用して哺乳動物細胞からユビキチン化タンパク質を精製するための段階的な方法を記載している。ユビキチン化p53タンパク質を、ストリンジェントな非変性および変性条件下で細胞から精製した。...

哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

本プロトコルは、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルムアルデヒドによって誘導されるユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化を含む、DNA-タンパク質架橋(DPC)およびそれらの翻訳後修飾(PTM)を検出および定量するための改変方法を強調し、それによってDPCおよびそのPTMの形成および修復の研究を可能にする。...

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

ここで使用した実験は、分子ドッキングとプローブ技術を組み合わせて、伝統的な漢方薬の低分子とタンパク質標的との間の相互作用を予測および検証する方法を示しています。...

分子ドッキングおよび脱ユビキチン化酵素プローブ技術に基づくUCHL3活性阻害のための漢方薬化合物のスクリーニング

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

学ぶタンパク質のユビキチン化検出法。培養細胞とin vitroの両方で有効なプロトコルを用い、免疫沈降とウェスタンブロッティングで修飾タンパク質を可視化します。パーキンなどのユビキチンリガーゼと基質の研究に応用可能です。

タンパク質のユビキチン化の検出

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