Name: タンパク質のユビキチン化の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶタンパク質のユビキチン化検出法。培養細胞とin vitroの両方で有効なプロトコルを用い、免疫沈降とウェスタンブロッティングで修飾タンパク質を可視化します。パーキンなどのユビキチンリガーゼと基質の研究に応用可能です。

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再生医療助成RS1 - 00331から1のためのカリフォルニア工科大学とRL1 - 00682から1（Z.チャンへ）;アメリカのパーキンソンこの作品は、NIHの助成金RO1 DC006497、RO1 NS057289、及びPO1 ES016738（Z.チャンへ）によってサポートされていました疾患協会（Z. ZhangとYSチューチューへ）、およびパーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団（Z.チャン）。

培養細胞におけるタンパク質のユビキチン化の検出<ol><li>ユビキチン目的のタンパク質を発現するプラスミドを培養細胞をトランスフェクトし、（のエピトープタグ付きバージョン）。 </li><li> 2mMのナトリウムオルトバナジン、50mMのフッ化ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤との完全な細胞溶解緩衝液（2％SDS、150mMのNaCl、10mMトリス- HCl、pH 8.0）を行う。 </li><li>プレート当たり100μlの細胞溶解緩衝液（6 cmのシャーレ）で細胞を溶解する。大きな皿が使用されている場合は、それに応じて音量を調整します。スワール溶解バッファーは、培養した細胞の全領域をカバーするように慎重に料理を。 </li><li>セルスクレーパーで細胞を回収し、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに細胞ライセートを転送する。 10分間沸騰し、すぐにホットプレートの上にチューブを置きます。 </li><li>超音波処理装置とせん断は、細胞。 </li><li>希釈バッファーの900ul（10mMトリス- HCl、pH8.0の、150mMのNaCl、2mMのEDTA、1％のトリトン）を追加します。回転で30〜60分間4℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 30分、20,000 × gで希釈した試料を回転させる。新しいエッペンドルフチュー​​ブに得られた上清を移す。ペレットを乱さないように注意してください。 </li><li>タンパク質濃度を測定する。 </li><li>互換性のあるバッファー（50％スラリー）中の標的タンパク質に対してタンパク質またはG -アガロースビーズ標識抗体を準備します。 P - 200ピペットの先端の狭い方の端をカットし、免疫沈降のために準備した細胞ライセートの500-1,500μgのために樹脂の14〜20μlを移す。高いトランスフェクション効率と細胞の場合は、500μgのは十分だろう。低トランスフェクション効率と細胞の場合は、より多くのタンパク質が必要になることがあります。 </li><li>回転と℃で一晩4℃で細胞ライセートをビーズ混合物をインキュベートする。 </li><li> 5分間5000 × gでビーズをスピンダウン。上清を吸引除去する。回洗浄緩衝液（10mMトリス- HCl、pH8.0の、1MのNaCl、1mMのEDTA、1％NP - 40）で樹脂を洗浄します。 </li><li> 30秒間に20,000 xgで最終的な時間のためのビーズを回転させる。残留した洗浄液を吸引除去し、2X SDSローディングバッファーでレジンを煮る。 </li><li>分析をイムノブロッティングのためにSDS - PAGEゲルにサンプルをロードします。 </li><li>それぞれの抗体によるユビキチンと標的蛋白質を検出。免疫ブロッティングのために、我々は通常、最初のユビキチンを検出。膜は、タンパク質の沈殿を検出するために使用されます。 </li></ol> in vitroのユビキチン化アッセイを介して標的タンパク質に対するユビキチン化の検出<ol><li> 5Xユビキチン化バッファー（100mMトリス- HCl、pH7.5の25 mMのMgCl 2、2.5mMのDTT、10mMのATP）を作る。最大6ヶ月間-20℃で小分けに格納します。プロトコルによっては、ATP再生1,2用のバッファにクレアチンリン酸とクレアチンキナーゼを追加。 </li><li>各反応について、以下を含む混合物を準備します。 <table border="1"><tbody><tr><td> μlの8 </td><td> 5Xユビキチン化バッファ</td></tr><tr><td> 250 ngの</td><td>ユビキチンE1 </td></tr><tr><td> 500 ngの</td><td>ユビキチンE2 </td></tr><tr><td> 0.5μgの</td><td>ユビキチン</td></tr><tr><td> 0.5μgの</td><td>目的のタンパク質</td></tr><tr><td></td><td> 40μlの全体積に水</td></tr></tbody></table>対照として、E1、E2、またはユビキチンのどちらかがない場合に同様の反応を準備する。 </li><li> ℃で1時間以上37℃混合物をインキュベートする。 </li><li> SDS - PAGEサンプルバッファーを加え、反応を停止し、10分間サンプルを煮る。 </li><li>分析をイムノブロッティングのためにSDS - PAGEゲルにサンプルをロードします。 </li><li>それぞれの抗体によるユビキチンと標的蛋白質を検出。 </li></ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

このプレゼンテーションでは、まず、培養哺乳動物細胞で目的のタンパク質にユビキチン修飾を検出可能にする手順を説明した。特に興味の蛋白質ではなく、非共有結合的に相互作用するタンパク質のユビキチン化を検出するために、我々は、細胞溶解、免疫沈降および1,3を洗浄するための厳しい条件を使用していました。抗ユビキチンブロッティングが続くような過酷な条件で標的タンパク質の免疫沈降で検出されたユビキチン化は、したがって、標的タンパク質に特異的である可能性が高いです。実験手順の間にタンパク質の脱ユビキチン化を防ぐために、例えば、N -エチルマレイミドおよびユビキチンアルデヒドなどの脱ユビキチン化酵素阻害剤はすべてのバッファ4に追加される可能性があります。しかし、それは脱ユビキチン化酵素は、10分煮沸手順後にアクティブのままになることはほとんどありません。高い分子種の強いスミアやはしごは、通常、ユビキチン化の結果です。目的のタンパク質のユビキチン化の程度は、いくつかの実験条件でユビキチン化/無修正の標的タンパク質の比率を比較することにより評価することができる。標的タンパク質のユビキチン化を増加さ...

タンパク質のユビキチン化の検出

Detection of Protein Ubiquitination

ユビキチン化、タンパク質を標的とするペプチドユビキチンの共有結合は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。彼らは、ユビキチン活性化酵素E1、ユビキチン結合酵素E2、およびユビキチンリガーゼE3が含まれています。 E1とE2のとは違って、E3ユビキチンリガーゼの基質特異性を表示します。一方、多数のdeubiquitylating酵素はポリユビキチン化タンパク質を処理するの役割を担っている。ユビキチンは、タンパク質の安定性、細胞内局在、及び生物学的活性の変化をもたらすことができる。ユビキチン化/脱ユビキチン化経路または変更されたユビキチンシステムの機能に関与する遺伝子の変異は、癌、神経変性、および代謝性疾患の様々なタイプなど、さまざまなヒト疾患に関連付けられています。標的タンパク質の改変されたか、通常のユビキチン化の検出は、これらの疾患の病因に関するより良い理解を提供することがあります。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明<em&gt; in vivoで</em&gt;と試験管<em&gt; in vitroで</em&gt;。これらのプロトコルはまた、sumolyationとneddylationなどの他のユビキチン様小分子の改変を検出するのに有用です。

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明<em&gt; in vivoで</em&gt;と試験管<em&gt; in vitroで</em&gt;。

ユビキチン化（ポリペプチドであるユビキチンを標的タンパク質に共有結合させること）は、一連の...によって行われる重要な翻訳後修飾である。

こんにちは。バーミンガム医学研究機構のJo研究室のChuです。本日は、タンパク質のユビキチン化を検出する方法について解説します。当研究室では、パーキンソン病に関連するUBI3リガーゼとその基質を研究するために、この手法を用いています。それでは始めましょう。このプロトコルの最初の手順として、標的タンパク質とエピトープタグ付きユビキチンを両方発現するプラスミドを細胞にトランスフェクションします。細胞を約40時間培養した後、実験台に移動して細胞を溶解させます。液状の培地を吸引して取り除き、PBSで細胞を2回洗浄してください。次に、6 cmプレートあたり2% SDSを含む細胞溶解バッファー100 µLを添加して細胞を溶解します。各プレートを旋回させ、バッファーが細胞全体を覆うようにします。続いて、セルスクレイパーを用いて溶解した細胞を回収し、1.5 mLのエッペンドルフチューブに移します。チューブを直ちにヒートブロックにセットし、溶菌した細胞を10分間沸騰させて、タンパク質をさらに変性・溶解させます。沸騰後、超音波破砕機を用いて細胞およびそのDNAを剪断します。この操作により、細胞ライセートの粘性が低下します。超音波処理後、希釈バッファーを900 µL加え、サンプルを4 °Cで30〜60分間回転混和させます。インキュベーション後、可溶性タンパク質を得るために、希釈したサンプルを4 °C、20,000 ×gで30分間遠心分離します。その後、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を新しいエッペンドルフチューブに移します。最後に、ここで使用している修正Lowry法などの方法で、上清中のタンパク質濃度を測定します。これで、免疫沈降法を用いて、上清中の他のタンパク質から目的のタンパク質を単離する準備が整いました。免疫沈降の最初のステップは、目的のタンパク質に対する抗体が結合したビーズを調製することです。市販の抗体結合ビーズを使用するか、クロスリンカーを用いて抗体固定化ビーズを自作することができます。本手順のように、アミノ沈降反応を行うため、適合するバッファー中で抗体固定化ビーズを準備し、50%のスラリーを作成します。P 200 ピペットチップの先端を切り取り、14～20 µL のレジンを 500～1500 µg の調製済み細胞ライセートに分注してください。細胞のトランスフェクション効率に応じて、使用する細胞溶解液の量を調整してください。細胞溶解液とビーズの混合物を4 °Cで一晩回転させます。この間に、ビーズ結合抗体が標的タンパク質に特異的に結合します。翌日、ビーズを 5,000 Gs で 5 分間、4 °C で遠心分離し、タンパク質をペレット化します。タンパク質がビーズに結合した状態で、上清を吸引除去し、5,000 Gs で 5 分間の遠心分離を 2 回繰り返して、高塩濃度洗浄バッファーでレジンを洗浄します。最後に、4 °C でビーズを 20,000 Gs で 30 秒間遠心分離し、残った洗浄バッファーを吸引除去します。目的タンパク質の精製が完了したので、次はSDS-PAGEゲルでタンパク質を電気泳動します。まず、ビーズ樹脂に2倍濃度のSDSローディングバッファーを加え、加熱して沸騰させることで、タンパク質を変性させ、負電荷を付与します。調製したサンプルをSDS-PAGEにロードしてください。研究室のウェスタンブロッティングのプロトコルに従って、ゲルからメンブレンにタンパク質を転写します。次に、ユビキチンまたは標的タンパク質に対する抗体でブロットをプローブし、メンブレンをフィルムで現像してユビキチン化タンパク質を可視化します。以上で、培養細胞におけるタンパク質のユビキチン化を検出する方法について解説しました。この同様の実験は、試験管を用いてin vitroで実施することも可能です。この反応の全量は40 µLであり、PCRチューブで行うことができます。各反応を次のように調製してください。まず、TPおよび還元剤であるDIO three etol、DTTを含むUBIQUITINATIONバッファーを5倍量加えます。次に、ユビキチン化酵素E oneおよびE twoを加えます。続いて、基質であるubiquitinおよび標的タンパク質を加えます。コントロールとして、水を加えて全反応量を40 µLにします。ubiquitin E1、E2、または標的タンパク質のいずれかを欠いた同様の反応系を調製します。混合液を37 °Cで1時間以上インキュベートします。SDS-PAGE用サンプルバッファーを添加して反応を停止させます。サンプルを10分間煮沸します。サンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、in vivo実験と同様にイムノブロッティング解析を行います。本プロトコルの結果例を以下に示します。Parkinson。ここではパーキンソン病関連タンパク質を目的タンパク質としています。また、レーン4はユビキチン化されたparinを示しています。典型的な強いスミアまたはラダーが、未修飾parinの分子量より上に示されています。これにより、いくつかの実験条件、未修飾の標的タンパク質の細胞内発現レベル、および各条件で考慮すべきparinとubiquitinを比較できます。これはin vitroにおけるparinのユビキチン化の例です。アフィニティー精製したparinを用い、リコンビナントE1、E2、およびビオチンタグ付きubiquitinの存在下でin vitroユビキチン化アッセイを行いました。ビオチン化されたubiquitinated parinは、streptavidin HRPによって検出されました。ubiquitinated Parinは、未修飾parinの分子量より上のラダーとして現れます。レーン1、2、および4は、それぞれubiquitin、E1、E2、およびparkinを含まないコントロールです。以上で、培養細胞におけるタンパク質vaccination（ワクチン接種）の検出方法について解説しました。この手順を行う際は、細胞溶解物を高度に洗浄した条件下で調製することと、標識抗体を加える前に細胞溶解物を希釈することを忘れないでください。これで完了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

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ここで使用した実験は、分子ドッキングとプローブ技術を組み合わせて、伝統的な漢方薬の低分子とタンパク質標的との間の相互作用を予測および検証する方法を示しています。...

分子ドッキングおよび脱ユビキチン化酵素プローブ技術に基づくUCHL3活性阻害のための漢方薬化合物のスクリーニング

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SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

学ぶタンパク質のユビキチン化検出法。培養細胞とin vitroの両方で有効なプロトコルを用い、免疫沈降とウェスタンブロッティングで修飾タンパク質を可視化します。パーキンなどのユビキチンリガーゼと基質の研究に応用可能です。

タンパク質のユビキチン化の検出

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