ニューロンとグリアの開発研究ラットの脳の集計文化の調製

中枢神経系（CNS）の神経前駆細胞を培養し、それらが成熟したニューロンおよびグリア細胞へと発達・分化する過程を観察するためのシステムを紹介します。手順は、E 16のラット胎児から4つの脳を単離し、プロパンを用いて消化することから始まります。組織は単一細胞懸濁液にされ、ろ過および計数が行われた後、6ウェルプレートに分注されます。

凝集体の形成を促すため、ウェルプレート内の細胞を1日1回、2〜3日間、緩やかに再懸濁させます。その後、凝集体を回収して200 µmのメッシュでろ過し、洗浄によって小さな塊や細胞残渣を除去します。最後に、凝集体の数を数え、Matrigelでコーティングしたカバーガラス上に播種します。

テキサスA&M大学獣医統合生命科学科のJohn L博士の研究室に所属しているCotoです。本日は、脳凝集体培養の手順について説明します。私たちはこの手法を、内胚葉系の細胞分化および細胞間相互作用の研究に活用しています。

それでは始めましょう。開始する前に、滅菌済みの器具、70% ethanol、作業用のディスペンサーパッド、および氷上に置いた解剖用培地入りの10 centimeterシャーレをベンチに準備してください。

クリーンベンチ内で、氷上ステージを備えた解剖顕微鏡と、同じく氷上の10 centimeterディッシュに入れた解剖用培地を数個準備します。最後に、使用する溶液を調製し、播種用培地をウォーターバスで37 degreesに加温します。本プロトコルでは、まずSprague Dawleyラットから胚齢16日（E 16）の胚を採取することから開始します。

まず、所属機関の動物実験委員会によって承認された手順に従い、妊娠した雌ラットを安楽死させます。安楽死させたラットを使い捨てシーツの上に置き、腹部をアルコールでスプレーして洗浄します。次に、ピンセットで腹部の皮膚をつまみ、もう一方の手で皮膚のみをハサミで切開します。皮膚を広げ、別の滅菌済みピンセットとハサミを用いて筋肉層を切開します。

次に、子宮を摘出し、氷冷した解剖培地を入れた10 cmディッシュに移します。次の工程は、クリーンベンチ内でマイクロ解剖用剪刀を用いて行います。子宮から各胚を慎重に摘出してください。

それでは、採取を開始します。胚脳を用いて作業を行います。各胚から脳を採取し、取り出した脳を、氷上に置いた解剖用培地が入った清潔な10 centimeterディッシュに移します。解剖顕微鏡下で、脳の解剖を完了させてください。

中脳および後脳のセクションを取り除きます。精密ピンセットを用いて髄膜を除去し、残った前脳を解剖用培地を入れた50 milliliterのファルコンチューブに移します。これで、組織が次のステップに使用できる状態になります。

酵素消化による細胞の解離。消化を開始する直前に、プロパンおよびトリプシンインヒビターフィルターの新鮮な溶液を調製します。これらを滅菌し、ウォーターバスで37 °Cに加温します。

解剖した脳から過剰な培地を除去します。次に、調製したプロパーゼ消化液4 mLを50 mLチューブに加えます。このチューブを37 °Cの恒温水槽で正確に5分間インキュベートします。

時間が経過したら、ピペットを用いてプロパン溶液を除去します。次に、調製したばかりのトリプシンインヒビター溶液を5 mL加え、チューブを再び37 °Cの恒温水槽に2～3分間戻します。時間が経過したら、トリプシンインヒビター溶液を除去します。

トリプシン阻害剤溶液によるインキュベーションをさらに3回繰り返します。最後にトリプシン阻害剤溶液を除去した後、温めたプレート用培地pmをチューブに20 milliliters加えます。

次に、細胞の分散と洗浄を行います。10 mL ピペットを用いて、細胞の凝集塊がすべて消失するまで、約 20 ～ 30 回ピペッティングします。その後、100 ×g で 7 分間遠心分離します。

この時点で、細胞は互いに十分に分離しているはずです。7分後、上清を除去し、細胞ペレットを10 mLのプレート用培地で再懸濁して、細胞を洗浄します。

その後、再び遠心分離して沈殿させます。上清を除去し、洗浄と遠心分離を繰り返します。2回目の洗浄後の工程です。

ペレットを10 millilitersの凝集培養培地で再懸濁し、細胞を70 micrometerのセルシーブでろ過します。最後に、血球計数計を用いて生存細胞数をカウントします。

これで、解離させた脳細胞に凝集塊を形成させる準備が整いました。細胞数をカウントした後、解離細胞を凝集培養液に懸濁し、細胞密度を2×10⁶ cells/mLに調整します。この細胞懸濁液を2 mLずつ、コート処理されていない6ウェルプレートの各ウェルに分注してください。

3晩の間、毎日細胞を穏やかに再懸濁させます。P 1000 ピペットを使用して、凝集体の播種日に細胞が凝集し始めるまで行います。細胞を3晩培養した後、再び細胞を穏やかに再懸濁し、200 µm メッシュでろ過して 50 mL ファルコンチューブに回収します。

凝集塊をチューブの底に沈殿させるため、約3〜5分間静置します。その後、上清を慎重に除いて培地を加え、凝集塊を穏やかに再懸濁させてから、再び沈殿させます。この操作を数回繰り返します。

死細胞、単一細胞、およびデブリを除去するため、顕微鏡を用いて上清に未凝集の細胞やデブリがまだ含まれていないかを確認します。凝集塊を十分に洗浄した後、同じ培地で穏やかに再懸濁し、凝集塊をカウントして濃度を決定します。その後、凝集塊の密度を50 µLあたり約25～30個になるように調整します。

次に、カバーガラスに凝集塊を播種します。凝集塊はチューブの底に沈殿しやすいため、播種用に凝集塊懸濁液を複数のチューブに分けて準備することが重要です。凝集塊懸濁液を1000 µLずつ、2 mLのエッペンドルフチューブに移します。このステップで使用するカバーガラスは、37 °Cで一晩インキュベートし、細胞培養基質のMatrigelでコーティングしたものです。

凝集懸濁液の分注が完了したら、Matrigelコーティング済みのカバーガラスが入った培養プレートをインキュベーターから取り出します。各ウェルから溶液を除去します。カバーガラスを温めたPBSで洗浄し、続いてDD H2Oで洗浄します。

これで、カバーガラスに凝集体を播種するための凝集体播種準備が整いました。凝集体懸濁液のチューブを転倒混和し、凝集体を均一に分散させます。次に、各カバーガラスの中央に凝集体懸濁液を50 µLずつ分注します。

凝集塊をカバーガラスに均一に付着させるため、それ以上刺激を与えないよう、プレートを慎重にインキュベーターに戻します。凝集塊の密度は非常に重要です。凝集塊同士が近すぎたり、播種密度が高すぎたりすると、初期播種から4〜6時間後に成長するにつれて融合する傾向があります。各ウェルに500 µLの培地を加えます。

凝集塊培養を維持するために、3〜4日ごとに培地を半分交換します。培地を交換する際は、凝集塊を乱さないよう、ウェルの壁面に沿って加えてください。凝集塊がカバーガラスに接着してから数時間後には、凝集塊からのアウトグロースが観察されます。

軸索は最初の2週間で急速に伸長し、凝集塊間に豊富な接続を形成します。Ggl前駆細胞は凝集塊から放射状に遊走し、時間をかけてアストロサイトおよび成熟オリゴデンドロサイトへと分化します。以上で、CS凝集塊の培養方法を説明しました。

この手順を行う際は、容量を適切に量り取り、凝集物を均一に混ぜ合わせることが重要です。以上です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。