Name: ニューロンとグリアの開発研究ラットの脳の集計文化の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-30T23:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶラット胎児脳の集団培養法。E16胚から脳を分離し、神経前駆細胞を培養してニューロンとグリア細胞に分化させる手法です。発生神経科学の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、テキサスA＆M大学からスタートアップ資金の一部で賄われていた

解剖前の準備 手術器具：オートクレーブによるすべての解剖はさみや鉗子を滅菌 カバーのクリーニング： <ol><li>少なくとも24時間、33％塩酸で1L草のビーカー内のすべてのカバースリップを（24ウェルプレート用の直径15mm）をソーク</li><li>すべての残留HClを除去するために時折揺れで10分間流水で洗う</li><li>ミリポア水で洗い流してください</li><li>水を切る</li><li> 95から98パーセントのエタノールでカバーガラスを浸し</li><li>平板と空気のきれいなティッシュにカバースリップを転送するには、カバースリップを乾燥させる</li><li> 、ガラス製ビーカーにアルミ箔とオートクレーブでカバーをカバースリップを転送する 注：カバースリップをこの段階で保存することができます。 </li><li>培養プレートに、個々のカバースリップを配置。コー​​ティングのための準備</li></ol> カバースリップコーティング： <ol><li> PBSとポリ- D -リジン（-20アリコート° Cとして格納されているPBS、0.5％のPDL、10 mg / mlのウシ血清アルブミン）の100 ×ストックを希釈し、フィルター滅菌（0.22μm）で</li><li> 37℃2時間× 1：PDLソリューション（〜0.15ミリリットル/ cm 2で ）°インキュベーターでCとコートのカバースリップ</li><li> PDLソリューションを取り外して、完全無菌のddH 2 Oと、乾燥カバーグラスで3回洗浄</li></ol> 注：各節郭清のためのコート十分なカバーグラス/プレート。 PDLでコーティングされたカバースリップは4℃で数週間保存することができるメディアとソリューション 解剖の培地（DM）は：10mMのHEPES（インビトロジェン15630）を添加した滅菌、氷冷ハンクス平衡塩溶液（W / OのCa 2 +、Mg 2 +を ）（HBSS、インビトロジェン14175）を使用してください。 集計培地：2％B27、1 ×佐藤、0.5mMのピルビン酸ナトリウム、0.75mmのグルタミン、60μg/mlN -アセチルシステイン、5μg/ mlの：DMEM/NBB27培地はDMEM / Neurobasal（巻1時01巻）が含まれているインスリン、10nmのd -ビオチンおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン。凝集培養培地100mlを作るために、50 mlのDMEM（W / Oピルビン酸/グルタミン、インビトロジェン11960）、50 mlのNeurobasal培地（Invitrogen 211034）、375μlのグルタミン（100 ×、インビトロジェン35050）、5.5 mgのピルビン酸ナトリウムを混合（シグマP2256）、2 mlのB27（インビトロジェン17504）、6.3 mgのN -アセチルシステイン（シグマA8199）、佐藤株式を1 ml（100 ×ストック、下記参照）、d -ビオチン株式25μlの（4000 ×ストック、40 -20分注して保存されているPBSでμM℃のシグマB4639）、インスリン100μlの（1000 ×株式、-20分注し° C、シグマ16634として保存されている0.01N塩酸で5 mg / ml）を、1 mlのペニシリン/ストレプトマイシン（100 ×株式、インビトロジェン15140）は、ろ過滅菌し、4℃で保存します。 佐藤100 ×ストック溶液：株式の40mlを行うには：400mgのアポトランスフェリン（シグマT2252）、400 mgのBSA（シグマA9647）、として保存されているプロゲステロンの10μlの（25 mg / mlのエタノールとの混合40mlのNeurobasal -20分注し℃のシグマP8783）、64 mgのプトレシン（シグマP7505）、および亜セレン酸ナトリウム40μlの（-20アリコートとして保存されているPBSで30μM、° C、シグマS5261）。 -20℃でアリコートとして佐藤ストック溶液、および店舗を消毒フィルタリング ニューロンのメッキ培地（PM）：Neurobasal培地、2％B27、2mMグルタミン（100株、-20℃、Invitrogen社製25030に格納されているアリコート）、25μmのグルタミン酸（100株、-20℃で保存したアリコート）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン。 ニューロン培養培地（CM）：Neurobasal培地、2％B27、2mMグルタミン（100株、-20℃で保存したアリコート）及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン。 5 - FDU株式：Neurobasal培地で100倍の株式、1mMの5 -フルオロ-2&#39; -デオキシウリジン（Sigma社F0503）and1mMウリジン（Sigma社U3003）。フィルタは、-20℃で滅菌してアリコートとして保存 パパインの消化液（前の節郭清に新鮮なように）： <ol><li> 4ミリリットルDMで3.2 mgのL -システイン（シグマC - 7352）を溶かす</li><li> 37℃で1NのNaOH（pH試験ストリップのテスト）と水浴の場所で約7.4にpHを調整する° C 注意：（下記参照）、右組織消化する前に次のステップを実行します。 </li><li> 20単位/ mlの最終濃度にパパインを追加</li><li> （0.22ミリメートル）滅菌フィルター処理、および37℃の水浴中で場所° C </li></ol> トリプシン阻害剤溶液（前の節郭清に新鮮なように）： <ol><li> 20ミリリットルDMで0.2グラムトリプシンインヒビター（Sigma社T7295）を溶かす</li><li> pHをチェックし、1 N NaOHで〜7.4にpHを調整する</li><li>滅菌フィルター処理、および37℃の水浴中で場所° C </li></ol>脳の解剖 セットアップ： <ul><li>滅菌鉗子とはさみ</li><li> 70％エタノール</li><li>クリーンティッシュペーパーとdiapベンチで二パッド</li><li>ベンチで子宮や胎児のための氷冷DMと10cmのペトリ皿</li><li>解剖顕微鏡で氷のプラットフォーム</li><li>氷の上にDMを2〜3 6センチメートル料理</li><li> 37℃の水浴中で暖かいPM </li></ul><ol><li>あなたの動物実験によって承認された手順と連絡委員会（IACUC）によると妊娠したSprague - Dawleyラット（E16）を安楽死させる</li><li>腹部領域の上におむつパッドと去勢のアルコールのラットレイ</li><li>皮膚のみをカットするV字型の切開を行うために腹部の皮膚とはさみのペアを保持するためにピンセットを使用して、 </li><li>皮膚を広げますと筋肉層を介してカットして別の滅菌ピンセットやハサミを使う</li><li>胚嚢の連鎖を抽出し、氷冷DMを含む10cmの皿にそれらを転送する</li><li>マイクロダイセクションのはさみを使用して、慎重に氷のプラットフォーム上でDMときれいな10cmの皿に嚢と各胚から脳、そして場所解放脳から各胚を削除</li><li>層流フード内や解剖顕微鏡下で、中脳/後脳のセクションを削除し、髄膜を除去するために微細な鉗子を使用し、氷のパックにDMで新しい6 cmディッシュに洗浄皮質/海馬を転送 注：この段階で、組織は酵素消化の準備ができている。 </li><li>パパインとトリプシンの阻害剤溶液およびフィルター滅菌を行う</li><li>皮質/海馬からDM過剰を取り除く</li><li>準備パパイン消化溶液の4ミリリットルを追加します。 </li><li> 50ミリリットルチューブに、すべてのコンテンツを転送し、37℃の水浴中にファルコンチューブを配置° Cを正確に5分間</li><li>ピペットでパパイン溶液を除去</li><li> 2〜3分間5ミリリットルトリプシン阻害剤溶液、渦巻管、および37℃の水浴中で行わ° ​​Cを追加</li><li>トリプシンインヒビターの溶液を除去</li><li>ステップ13と14を3回繰り返します</li><li> 20ミリリットル暖かいPMを追加</li><li>すべての塊が消失するまでひいて粉にする（〜20〜30倍） </li><li> 7分のために100xgで遠心分離</li><li> 10ミリリットルPMでペレットを再懸濁し、遠心分離により2回洗浄する</li><li>定期的なニューロンの培養のためにまたは集約培養用のNBB27/DMEMで10ミリリットルPMでペレットを再懸濁します</li><li> 70μmセルふるいを介して細胞を渡す</li><li>生細胞を数える</li><li>定期的なニューロンの培養用細胞を以下に記載または板として集約文化に進みます 注：このステップでは、高濃縮ニューロンの培養は、実験の目的に応じて2 200〜640細胞/ mmの密度で、PDLコーティングプレート上に解離細胞を播種することによって達成することができます。細胞は（〜2 - 4H）接続した後は、暖かい日に培地を交換してください。長時間培養した場合、4日目に、暖かいCMで培地の半分を交換してください。非常に神経細胞の培養、精製するため、有糸分裂阻害剤5 - FDUは（最終濃度10μM）の非神経細胞の増殖を（すなわち、DIV2 - 3の間）を阻害するDIV2で追加することができます。 2日間のCMで回復した後、細胞は、パルスは完全培地の変化に続いて別の2日間（DIV 6-7）のために5 - FDUで再び処理されます。その後、3〜4日ごとに新鮮な、温かみのあるCMで培地の半分を交換してください。 4週間までのニューロンは、実行可能です。 </li></ol>凝集体の調製およびメッキ<ol><li> 2 × 10 6細胞/ mlの密度で1 ×佐藤、10ng/ml CNTFおよび10μMフォルスコリンを含むNBB27/DMEM培地で解離細胞をサスペンド</li><li>コー​​ティングされていない6ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液の2ミリリットルを転送する</li><li> 3泊の培養。毎日、穏やかに一度P1000 Pipetmanを用いて細胞を再懸濁 注：セルの集合体（図1）を形成し始める。 </li><li>マトリゲルと集約メッキ、コートプレート/カバースリップの前日： <ul><li>株式マトリゲル（成長因子が減少し、BD Biosciences社354230）氷の上に冷たいDMEMで1:20に希釈する 注：マトリゲルアリコートを、製造業者のプロトコルごとに用意する必要があります。すべてのヒントを、エッペンドルフチュー​​ブとストックのアリコートを作るためのソリューションは、マトリゲル重合を避けるために、寒いはずです。マトリゲルのアリコートを-80℃に維持し、4℃で解凍されています</li><li> 37℃インキュベーターで一晩希釈マトリゲル溶液を300μl/wellでコートは、以前にPDLコートしたカバースリップ</li><li>温かいPBSで洗い、その後暖かい滅菌のddH 2 Oでプレートを洗浄し、インキュベーターでプレートを残す。 </li></ul></li><li>凝集体形成後の3日間、再び静かに細胞を再懸濁し、ふるい50ミリリットルファルコンチューブに200μmのメッシュを介してサスペンション。凝集体は重力（〜3 - 5分）でチューブの底に沈降することができます</li><li>注意深く上清を除去</li><li>培地を加え、穏やか凝集体を再懸濁し、それらを再び沈殿ができます。死んだ細胞、個々の細胞および残骸を削除する場合は、この手順を数回繰り返します。上清はまだ非凝集細胞とdebriが含まれているかどうかを確認するために顕微鏡を使用して、の</li><li>ゆっくりと同じNBB27/DMEM媒体（図1）、カウントの集計に集計を再懸濁します。 </li><li> 25から30の周りaggreggats/50ulに凝集体の密度を調整する</li><li>メッキのための2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに集約サスペンションの転送アリコート（500 -1000μl） 注：集合体は、チューブの底に落ち着く傾向があるので、それはメッキのために集約サスペンションの複数のチューブを作ることが重要です。ゆっくりと各カバースリップ上に播種した凝集体の同じような数を確保するためにコーティングされたカバースリップまたは培養プレート上にそれらを播種する前に、しばしば凝集体を懸濁します。 </li><li>インキュベーターからマトリゲルでコーティングされたカバースリップを含む培養プレートを取り出してください。各ウェルから溶液を除去、温かいPBSとのddH 2 Oでカバーグラスを洗浄し、乾燥簡潔に。彼らは現在集計播種の準備ができている</li><li>それらは播種前に均等に分散されるように集約懸濁液を含むチューブを反転。各カバーの中央に集約し懸濁液50μlずつをロードし、ゆっくりと凝集体がカバースリップに均等にアタッチできるようにそれ以上の障害なくインキュベーターにバックプレートを置く 注：集合体の密度が非常に重要です。凝集体を播種している場合はあまりにも接近したり、播種密度が高い場合、彼らは成長するにつれて一緒にマージする傾向がある。 </li><li>翌朝以降早期に各ウェルに4-6時間に追加のDMEM/NBB27medium（500μl）を添加</li><li>集計文化を維持するために、ハーフ3〜4日ごとに培地を変更してください。培地を変更すると、凝集を妨害しないように注意してください、これは穏やかにウェルの側壁に沿ってメディアを追加することによって行われます。 注：数時間プレートに付着凝集後、凝集体からの神経突起の成長を観察することができる。軸索は、最初の2週間で急速に成長し、凝集体（図2）の間に豊富な接続を形成する。グリア前駆細胞は、凝集体から放射状に移動し、星状膠細胞と成熟オリゴデンドロサイトに時間をかけて分化する。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="図1" /> 図1洗浄後に別の日と集計で凝集体を形成する細胞の位相コントラスト像。 <img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="図2" /> 2〜12日間マトリゲルでコーティングされたカバースリップ上に播種した後の骨材文化の図2。位相コントラスト像。

<ol><li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li>
<li>Chen, Y. ing <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li>
<li>Svenningsen, A. F., Shan, W. ei-S. ong, Colman, D. avidR., Pedraza, L. iliana <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li>
</ol>

初期の研究は、シナプスと回転を介したフリーフローティング集約文化1の成熟したミエリンの形成を報告した。ここで説明CNSの集合体の培養系は、細胞の開発、マイグレーションおよびin vitroでの分化の解析を容易にするために、従来の2D文化の利便性を持つ三次元凝集体における多能性前駆細胞の無血清成長を兼ね備えています。システムは、神経前駆体のために修正して使用することができます。細胞の研究およびニューロン - グリア相互作用の調査のため。例えば、そのようなオリゴデンドロサイト前駆細胞2などの遺伝子改変細胞が集合体培養物に添加されることがあります。このようなミクログリアやマクロファージまたはニューロンとグリアの分化に関する種々の試薬として免疫細胞の効果も検討することができます。精製された網膜神経節細胞のReaggregatesは最近、他のセル3の非存在下におけるオリゴデンドロサイトとの共培養でCNSの髄鞘形成を研究するために使用されています。前回の報告書4との契約では、マトリゲルは、それが細胞接着を促進し、神経突起伸長と...

ニューロンとグリアの開発研究ラットの脳の集計文化の調製

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

中枢神経系（CNS）における成熟した神経細胞とグリア細胞への反復する前駆細胞の発生や分化は、軸索 - グリア相互作用、多能性前駆細胞の性質と分化、およびオリゴデンドログリアの進行を調査する神経科学者のための強力なプラットフォームを提供することをin vitroの系細胞および分子レベルでの系統細胞。ここでは3-4週間に無血清培地に維持することができるとニューロン - グリア相互作用と中枢神経系の髄鞘形成を研究するモデルとして我々の研究室で使用されているラット胚のforebrains、からCNSの集合体培養系を説明します。このビデオクリップは、E16ラット脳からこれらのCNSの集合体の文化を分離し、成長させる方法を紹介します。さらに、同じ脳の解剖から、高濃縮レギュラー解離ニューロン培養を容易に得ることができると、様々な研究に使用CNSニューロンや他の細胞との共培養に使用されます。

胎児ラット脳の集合体の培養系のためのプロトコルが記述されています。凝集体の多能性前駆細胞は、開発し、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化することができる。

中枢神経系（CNS）における前駆細胞から成熟したニューロンおよびグリア細胞への発生および分化を再現するインビトロシステム...

中枢神経系（CNS）の神経前駆細胞を培養し、それらが成熟したニューロンおよびグリア細胞へと発達・分化する過程を観察するためのシステムを紹介します。手順は、E 16のラット胎児から4つの脳を単離し、プロパンを用いて消化することから始まります。組織は単一細胞懸濁液にされ、ろ過および計数が行われた後、6ウェルプレートに分注されます。凝集体の形成を促すため、ウェルプレート内の細胞を1日1回、2〜3日間、緩やかに再懸濁させます。その後、凝集体を回収して200 µmのメッシュでろ過し、洗浄によって小さな塊や細胞残渣を除去します。最後に、凝集体の数を数え、Matrigelでコーティングしたカバーガラス上に播種します。テキサスA&amp;M大学獣医統合生命科学科のJohn L博士の研究室に所属しているCotoです。本日は、脳凝集体培養の手順について説明します。私たちはこの手法を、内胚葉系の細胞分化および細胞間相互作用の研究に活用しています。それでは始めましょう。開始する前に、滅菌済みの器具、70% ethanol、作業用のディスペンサーパッド、および氷上に置いた解剖用培地入りの10 centimeterシャーレをベンチに準備してください。クリーンベンチ内で、氷上ステージを備えた解剖顕微鏡と、同じく氷上の10 centimeterディッシュに入れた解剖用培地を数個準備します。最後に、使用する溶液を調製し、播種用培地をウォーターバスで37 degreesに加温します。本プロトコルでは、まずSprague Dawleyラットから胚齢16日（E 16）の胚を採取することから開始します。まず、所属機関の動物実験委員会によって承認された手順に従い、妊娠した雌ラットを安楽死させます。安楽死させたラットを使い捨てシーツの上に置き、腹部をアルコールでスプレーして洗浄します。次に、ピンセットで腹部の皮膚をつまみ、もう一方の手で皮膚のみをハサミで切開します。皮膚を広げ、別の滅菌済みピンセットとハサミを用いて筋肉層を切開します。次に、子宮を摘出し、氷冷した解剖培地を入れた10 cmディッシュに移します。次の工程は、クリーンベンチ内でマイクロ解剖用剪刀を用いて行います。子宮から各胚を慎重に摘出してください。それでは、採取を開始します。胚脳を用いて作業を行います。各胚から脳を採取し、取り出した脳を、氷上に置いた解剖用培地が入った清潔な10 centimeterディッシュに移します。解剖顕微鏡下で、脳の解剖を完了させてください。中脳および後脳のセクションを取り除きます。精密ピンセットを用いて髄膜を除去し、残った前脳を解剖用培地を入れた50 milliliterのファルコンチューブに移します。これで、組織が次のステップに使用できる状態になります。酵素消化による細胞の解離。消化を開始する直前に、プロパンおよびトリプシンインヒビターフィルターの新鮮な溶液を調製します。これらを滅菌し、ウォーターバスで37 °Cに加温します。解剖した脳から過剰な培地を除去します。次に、調製したプロパーゼ消化液4 mLを50 mLチューブに加えます。このチューブを37 °Cの恒温水槽で正確に5分間インキュベートします。時間が経過したら、ピペットを用いてプロパン溶液を除去します。次に、調製したばかりのトリプシンインヒビター溶液を5 mL加え、チューブを再び37 °Cの恒温水槽に2～3分間戻します。時間が経過したら、トリプシンインヒビター溶液を除去します。トリプシン阻害剤溶液によるインキュベーションをさらに3回繰り返します。最後にトリプシン阻害剤溶液を除去した後、温めたプレート用培地pmをチューブに20 milliliters加えます。次に、細胞の分散と洗浄を行います。10 mL ピペットを用いて、細胞の凝集塊がすべて消失するまで、約 20 ～ 30 回ピペッティングします。その後、100 ×g で 7 分間遠心分離します。この時点で、細胞は互いに十分に分離しているはずです。7分後、上清を除去し、細胞ペレットを10 mLのプレート用培地で再懸濁して、細胞を洗浄します。その後、再び遠心分離して沈殿させます。上清を除去し、洗浄と遠心分離を繰り返します。2回目の洗浄後の工程です。ペレットを10 millilitersの凝集培養培地で再懸濁し、細胞を70 micrometerのセルシーブでろ過します。最後に、血球計数計を用いて生存細胞数をカウントします。これで、解離させた脳細胞に凝集塊を形成させる準備が整いました。細胞数をカウントした後、解離細胞を凝集培養液に懸濁し、細胞密度を2×10⁶ cells/mLに調整します。この細胞懸濁液を2 mLずつ、コート処理されていない6ウェルプレートの各ウェルに分注してください。3晩の間、毎日細胞を穏やかに再懸濁させます。P 1000 ピペットを使用して、凝集体の播種日に細胞が凝集し始めるまで行います。細胞を3晩培養した後、再び細胞を穏やかに再懸濁し、200 µm メッシュでろ過して 50 mL ファルコンチューブに回収します。凝集塊をチューブの底に沈殿させるため、約3〜5分間静置します。その後、上清を慎重に除いて培地を加え、凝集塊を穏やかに再懸濁させてから、再び沈殿させます。この操作を数回繰り返します。死細胞、単一細胞、およびデブリを除去するため、顕微鏡を用いて上清に未凝集の細胞やデブリがまだ含まれていないかを確認します。凝集塊を十分に洗浄した後、同じ培地で穏やかに再懸濁し、凝集塊をカウントして濃度を決定します。その後、凝集塊の密度を50 µLあたり約25～30個になるように調整します。次に、カバーガラスに凝集塊を播種します。凝集塊はチューブの底に沈殿しやすいため、播種用に凝集塊懸濁液を複数のチューブに分けて準備することが重要です。凝集塊懸濁液を1000 µLずつ、2 mLのエッペンドルフチューブに移します。このステップで使用するカバーガラスは、37 °Cで一晩インキュベートし、細胞培養基質のMatrigelでコーティングしたものです。凝集懸濁液の分注が完了したら、Matrigelコーティング済みのカバーガラスが入った培養プレートをインキュベーターから取り出します。各ウェルから溶液を除去します。カバーガラスを温めたPBSで洗浄し、続いてDD H2Oで洗浄します。これで、カバーガラスに凝集体を播種するための凝集体播種準備が整いました。凝集体懸濁液のチューブを転倒混和し、凝集体を均一に分散させます。次に、各カバーガラスの中央に凝集体懸濁液を50 µLずつ分注します。凝集塊をカバーガラスに均一に付着させるため、それ以上刺激を与えないよう、プレートを慎重にインキュベーターに戻します。凝集塊の密度は非常に重要です。凝集塊同士が近すぎたり、播種密度が高すぎたりすると、初期播種から4〜6時間後に成長するにつれて融合する傾向があります。各ウェルに500 µLの培地を加えます。凝集塊培養を維持するために、3〜4日ごとに培地を半分交換します。培地を交換する際は、凝集塊を乱さないよう、ウェルの壁面に沿って加えてください。凝集塊がカバーガラスに接着してから数時間後には、凝集塊からのアウトグロースが観察されます。軸索は最初の2週間で急速に伸長し、凝集塊間に豊富な接続を形成します。Ggl前駆細胞は凝集塊から放射状に遊走し、時間をかけてアストロサイトおよび成熟オリゴデンドロサイトへと分化します。以上で、CS凝集塊の培養方法を説明しました。この手順を行う際は、容量を適切に量り取り、凝集物を均一に混ぜ合わせることが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

preparation-rat-brain-aggregate-cultures-for-neuron-glia-development

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、グリアフィーダー層の存在下で培養ラット大脳皮質ニューロンのためのプロトコルを提供しています。培養神経細胞は極性を確立し、シナプスを作成し、そのような電気生理学、カルシウムイメージング、細胞生存アッセイ、免疫細胞化学、およびRNA / DNA...

初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

脳の細胞の不均質性からプライマリミクログリアを分離すると、生理学的および病理学的条件の両方で彼らの役割を調査することが不可欠である。このプロトコルは、機械的な分離と高収率かつ高純度を提供する混合細胞培養技術、実行可能な主なミクログリア細胞について説明します。...

新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

我々は、齧歯類の胚から海馬および皮質ニューロンを分離、培養するための迅速な方法論を記述します。このプロトコルは、私たちはほぼ純粋な神経細胞の培養が必要とされる実験を行うことができます。...

ラット胚神経細胞の分離と文化：クイックプロトコル

このビデオでは、グリア細胞の三次元培養を確立する技術を示しています。ラット脳由来のグリア細胞は、細胞外マトリックス成分を含む光架橋性ポリマーマトリックス内にカプセル化されています。増殖培地でインキュベートすると、グリア細胞は支持マトリックス内で増殖し、三次元培養を作製します。...

ラット脳由来グリア細胞の三次元培養法の確立

本研究の目的は、ラット同系内皮細胞とアストロサイトの共培養が関与する生体外 BBBモデルの再現性を検証することでした。内皮細胞単層は、高いTEERと低LY透過性を提示した。特定のTJタンパク質の発現は、炎症および輸送体および受容体の機能性に機能的応答を評価した。...

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

私たちは、新生児マウスの標識とジェノタイピング、およびそれらから一次ニューロン培養を生成する手順について説明します。ジェノタイピングは迅速、効率的、信頼性が高く、自動核酸抽出が可能です。これは、ジェノタイピングを事前に完了する必要がある新生児致死マウスとその培養物に特に有用です。...

脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング

人工多能性幹細胞(iPSC)に由来するニューロン、初代皮質ニューロン、およびアストロサイトからなる共培養システムを生成するためのプロトコルが説明されています。この共培養システムにより、新しいiPS細胞由来ニューロンとチャネルロドプシン-2を発現する既存の皮質ニューロンとの間のシナプス接触および回路の形成を検出することができます。...

共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

私たちは、興奮性皮質ニューロン12に人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）の、迅速な再現性、および効率的な分化を説明以前に公開されたプロトコルを変更して実施します。具体的には、私たちの修飾は、神経細胞の密度の制御を可能にし、ネットワークレベルでの電気生理学的特性を測定するために微小電極アレイ上で使用します。...

マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

この記事では、グリア単層の上に反転したカバーガラス上で成長する低密度初代海馬神経細胞を培養するためのプロトコルを記述しています。ニューロンとグリアの層は、パラフィンワックスビーズで分離されています。この方法によって成長させた神経細胞は、高分解能光学イメージングおよび機能アッセイに適しています。...

低密度初代海馬ニューロンの文化

本論文では、上方の頸神経節からの胚性ラット交感神経の単離と培養について述べている。また、免疫細胞化学染色や質量分析のためのニューロン抽出物の準備のための詳細なプロトコルも提供します。...

形態学およびプロテオーム解析のための胚性子宮頸部神経節からのラット交感神経の培養

ここでは、高収率と再現性を持つ、胚性皮質由来のニューロンおよびアストロサイトエンリッチ培養、またはニューロングリア培養を確立できる特定の培養培地を用いた簡単なアプローチを提示する。...

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

学ぶラット胎児脳の集団培養法。E16胚から脳を分離し、神経前駆細胞を培養してニューロンとグリア細胞に分化させる手法です。発生神経科学の研究に応用可能です。

ニューロンとグリアの開発研究ラットの脳の集計文化の調製

さらに動画を探す