Name: 蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: 学ぶ蛍光スペックル顕微鏡法を用いた生細胞内F-アクチンダイナミクスの定量的解析法。マイクロインジェクションとイメージングチャンバーの組み立てにより、光漂白を最小化しながら細胞骨格タンパク質の速度と回転動態をリアルタイムで測定する技術を解説します。

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qFSMの開発は、NIHの助成金U01 GM06230によって運営されている。

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

著者は開示すべき事項はありません。

いくつかの重要な要素が正常に画像のスペックル得るために不可欠な、しかし良い斑点が開始して、蛍光標識アクチンの品質で終了。標識タンパク質自体が水溶性と凝集体の自由でなければならないしながら0.4から0.7の周りに設定されたアクチン単量体への染料の高いラベリングの比率は、、斑点が明るいと離散的に表示されるようになります。同様に重要なマイクロインジェクションの手順です。 （と生存）、正常な細胞の恒常性を確保するために、細胞は標識タンパク質の低濃度の導入、低流量の圧力で注入する必要があります。これは、マイクロインジェクションシステムの使用に関する技術的専門知識/経験のある程度が必要です。一般的なルールとして、短い噴射時間（&lt;1秒）より長い注入時間よりも優先されています。最後の重要なコンポーネントは顕微鏡です。ほとんどの中核施設で見られる水銀ランプ落射照明、と対に倒立顕微鏡は、画像のスペックルのために適切なプラットフォームとして機能します。高NAの対物と冷却CCDカメラの組み合わせは、明るい斑点の高解像度の画像を生成する、適切な蛍光フィルターがきちんと整っていると仮定する。我々は、高倍率（100倍）、高NA（&gt; 1.3）、優れた解像度...

インジェクションバッファ（IB） 50 mMリン酸カリウムのグルタミン酸 0.5 M MgCl2を（APPENDIX 2A） -20℃で2年間まで保存 &nbsp; G -バッファ 2mMのトリス⋅はCl、pHが8.0（APPENDIX 2A） 0.2mMの塩化カルシウム（APPENDIX 2A） 使用直前に追加します。 0.2mMのATP（100 mMのためのレシピを参照してください） 0.5mMの2 - メルカプトエタノール 4℃で1日まで保存° C

蛍光を経由してf -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（fsm）

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

このプロトコルでは、蛍光の使用を説明しPtK1細胞におけるアクチンダイナミクスの高解像度の画像をキャプチャするために顕微鏡（FSM）のスペック。 FSMのユニークな利点は、生きた細胞内でF -アクチンのネットワークの移動と回転率の動態（組立/分解）をキャプチャする機能です。この手法は、コンピュータビジョンのソフトウェア（qFSM）と組み合わせた場合、F -アクチンのダイナミクスの定量的な測定値を導出する場合に特に便利です。我々は生きた細胞内の蛍光アクチンプローブの選択、マイクロインジェクションおよび視覚化について説明します。重要なことは、同様の手順では、他のmacomolecularアセンブリの可視化に適用可能である。 FSMは、微小管、中間径フィラメント、及び接着複合体のために実証されている。

選択、マイクロインジェクション、および蛍光を経由して蛍光標識F -アクチンのイメージング顕微鏡（FSM）のスペック。

蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

本プロトコルでは、PtK1細胞におけるアクチンのダイナミクスを高解像度で撮影するための蛍光スペックル顕微鏡法（FSM）の使用について説明します。独自の...

蛍光スペックル顕微鏡法は、生細胞内におけるさまざまな細胞骨格タンパク質のダイナミクスを調べるために用いられます。正しく使用することで、細胞骨格タンパク質の速度およびターンオーバー速度の定量的測定が可能です。本手順では、まず少量の蛍光標識アクチンを生細胞にマイクロインジェクションすることから始めます。次に、光退色の影響を軽減するためにイメージングチャンバーを組み立てます。まず、細胞用カバーガラスを載せるマイクロスライドの両側に、2枚の両面テープを貼ります。その後、開いているスリットの一方の近くにイメージング用培地を滴下し、チャンバー内に注入します。最後に、4辺すべてをパラフィルムで密封します。こんにちは、私はJames Limです。Scripps Research Instituteの細胞生物学部、Galden Deucer研究室に所属しています。今日は、蛍光スペックル顕微鏡法の procedure についてご紹介します。本手順では、移動中の上皮細胞におけるアクチンダイナミクスを調査します。それでは始めていきましょう。高品質な蛍光スペックル顕微鏡動画を取得するための重要な要素は、適切な蛍光色素によるアクチンの標識です。Alexa Fluorやrhodamine C5-NHSエステル誘導体など、アクチン表面の露出したリシン残基を標的とする蛍光色素の使用を推奨します。長期保存前にスペックルを明るく個別に視認できるようにするためには、アクチンモノマー1つあたりの染料の標識比を0.3から0.7の高い範囲に維持することが重要です。標識したアクチン溶液を、4°Cで75,000から80,000 ×gで20分間遠心分離して清浄化します。標識アクチンは、Gバッファー溶液に入れ、-80°Cで保存してください。不溶性凝集塊の形成につながる繰り返しの凍結融解を避けるため、2 µLずつの分注液を調製しました。花四数（floral fours）の光退色を防ぐため、標識したアクチン溶液を長時間直射光にさらさないでください。また、長期保存には遮光性のマイクロ遠心チューブを使用してください。マイクロインジェクション用の細胞は、酸洗浄した正方形のガラスカバースリップ上に配置します。標準的な基板コーティングをカバースリップに適用することができ、これはマイクロインジェクションに影響しません。アクチンの調製中に細胞を37°Cで保持し、マイクロインジェクションに適した細胞を選択してください。FSMについては、以下の基準を検討してください。細胞は大きく、直径が 50 µm 以上で、プレートに播種された際に平坦に広がり、基質に自然に接着している必要があります。また、細胞の細胞質が核よりも広い面積を占めていることが望ましいです。適切な細胞株としては、PTK1、イモリ肺細胞、およびAIAニューロンなどが挙げられ

live-cell-imaging-f-actin-dynamics-via-fluorescent-speckle-microscopy

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生物学

本論文では、培養中の生細胞の機械的刺激のための統合された原子間力光学イメージング顕微鏡の操作で、リーダーに指示することを目指しています。ステップバイステップのプロトコルが表示されます。機械的な刺激に生細胞の応答を示す代表的なデータセットが表示されます。...

集積光と原子間力顕微鏡による研究機械的刺激に対する細胞応答を生きる

GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

生細胞内の動的タンパク質に関する時空間的な情報は、生物学を理解するために非常に重要です。高速3D構造化照明顕微鏡(f3D-SIM)と呼ばれる超解像顕微鏡の一種は、細菌の細胞動態Zリングに関するユニークな情報、つまりそのビーズ状の外観とリング内のFtsZの急速なダイナミクスの両方を明らかにします。...

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

細胞膜タンパク質と脂質の空間分布と時間ダイナミクスは、生物学におけるホットなトピックです。ここでは、この問題は、概念的には同じ物理量の単一粒子追跡を提供する時空間画像変動解析によって対処されますが、低分子ラベルと標準的な顕微鏡セットアップを使用します。...

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

T細胞免疫シナプスにおける糸状アクチンの流れ速度と方向性を調査するために、生細胞の超解像イメージングと全反射蛍光を組み合わせ、時空間画像相関分光法で定量化します。...

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

私たちは、接着性、哺乳動物細胞におけるアクチン細胞骨格のイメージングに、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）、3次元の単一分子の局在超解像顕微鏡法の適用のためのプロトコルを提示します。このアプローチは、そうでなければ、従来の回折限界光学顕微鏡で未解決のままであるナノスケールの構造的特徴の光ベースの可視化を可能にします。...

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

このプロトコルでは、蛍光共鳴エネルギー移動し、蛍光寿命イメージングに基づく SNARE...

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

どのように FRAP など photoactivation のマイクロ ・ photomanipulation...

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

前進するためには、成長コーンは外部環境に対して牽引力を発揮しなければならない。牽引力の生成はアクチンの動態およびクラッチの結合に依存する。本研究では、成長コーンアドバンスのためのアクチンダイナミクス、クラッチカップリングおよび牽引力を分析する方法について説明する。...

アクチンダイナミクス、クラッチカップリング、成長コーンアドバンスの牽引力の解析

我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。...

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

ここでは、精製されたタンパク質から準2次元(2D)エンタングル、架橋、および液晶アクチンアセンブリを調製する方法を紹介します。...

活性アクチンベースアセンブリの収縮性および変形モードのin vitroでのチューニング:2次元活性ネットワークから液晶滴まで

学ぶ蛍光スペックル顕微鏡法を用いた生細胞内F-アクチンダイナミクスの定量的解析法。マイクロインジェクションとイメージングチャンバーの組み立てにより、光漂白を最小化しながら細胞骨格タンパク質の速度と回転動態をリアルタイムで測定する技術を解説します。

蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

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