Name: 蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: 学ぶ蛍光スペックル顕微鏡法を用いた生細胞内F-アクチンダイナミクスの定量的解析法。マイクロインジェクションとイメージングチャンバーの組み立てにより、光漂白を最小化しながら細胞骨格タンパク質の速度と回転動態をリアルタイムで測定する技術を解説します。

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qFSMの開発は、NIHの助成金U01 GM06230によって運営されている。

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

著者は開示すべき事項はありません。

いくつかの重要な要素が正常に画像のスペックル得るために不可欠な、しかし良い斑点が開始して、蛍光標識アクチンの品質で終了。標識タンパク質自体が水溶性と凝集体の自由でなければならないしながら0.4から0.7の周りに設定されたアクチン単量体への染料の高いラベリングの比率は、、斑点が明るいと離散的に表示されるようになります。同様に重要なマイクロインジェクションの手順です。 （と生存）、正常な細胞の恒常性を確保するために、細胞は標識タンパク質の低濃度の導入、低流量の圧力で注入する必要があります。これは、マイクロインジェクションシステムの使用に関する技術的専門知識/経験のある程度が必要です。一般的なルールとして、短い噴射時間（&lt;1秒）より長い注入時間よりも優先されています。最後の重要なコンポーネントは顕微鏡です。ほとんどの中核施設で見られる水銀ランプ落射照明、と対に倒立顕微鏡は、画像のスペックルのために適切なプラットフォームとして機能します。高NAの対物と冷却CCDカメラの組み合わせは、明るい斑点の高解像度の画像を生成する、適切な蛍光フィルターがきちんと整っていると仮定する。我々は、高倍率（100倍）、高NA（&gt; 1.3）、優れた解像度...

インジェクションバッファ（IB） 50 mMリン酸カリウムのグルタミン酸 0.5 M MgCl2を（APPENDIX 2A） -20℃で2年間まで保存 &nbsp; G -バッファ 2mMのトリス⋅はCl、pHが8.0（APPENDIX 2A） 0.2mMの塩化カルシウム（APPENDIX 2A） 使用直前に追加します。 0.2mMのATP（100 mMのためのレシピを参照してください） 0.5mMの2 - メルカプトエタノール 4℃で1日まで保存° C

蛍光を経由してf -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（fsm）

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

このプロトコルでは、蛍光の使用を説明しPtK1細胞におけるアクチンダイナミクスの高解像度の画像をキャプチャするために顕微鏡（FSM）のスペック。 FSMのユニークな利点は、生きた細胞内でF -アクチンのネットワークの移動と回転率の動態（組立/分解）をキャプチャする機能です。この手法は、コンピュータビジョンのソフトウェア（qFSM）と組み合わせた場合、F -アクチンのダイナミクスの定量的な測定値を導出する場合に特に便利です。我々は生きた細胞内の蛍光アクチンプローブの選択、マイクロインジェクションおよび視覚化について説明します。重要なことは、同様の手順では、他のmacomolecularアセンブリの可視化に適用可能である。 FSMは、微小管、中間径フィラメント、及び接着複合体のために実証されている。

選択、マイクロインジェクション、および蛍光を経由して蛍光標識F -アクチンのイメージング顕微鏡（FSM）のスペック。

蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

本プロトコルでは、PtK1細胞におけるアクチンのダイナミクスを高解像度で撮影するための蛍光スペックル顕微鏡法（FSM）の使用について説明します。独自の...

蛍光スペックル顕微鏡法は、生細胞内におけるさまざまな細胞骨格タンパク質のダイナミクスを調べるために用いられます。正しく使用することで、細胞骨格タンパク質の速度およびターンオーバー速度の定量的測定が可能です。本手順では、まず少量の蛍光標識アクチンを生細胞にマイクロインジェクションすることから始めます。次に、光退色の影響を軽減するためにイメージングチャンバーを組み立てます。まず、細胞用カバーガラスを載せるマイクロスライドの両側に、2枚の両面テープを貼ります。その後、開いているスリットの一方の近くにイメージング用培地を滴下し、チャンバー内に注入します。最後に、4辺すべてをパラフィルムで密封します。こんにちは、私はJames Limです。Scripps Research Instituteの細胞生物学部、Galden Deucer研究室に所属しています。今日は、蛍光スペックル顕微鏡法の procedure についてご紹介します。本手順では、移動中の上皮細胞におけるアクチンダイナミクスを調査します。それでは始めていきましょう。高品質な蛍光スペックル顕微鏡動画を取得するための重要な要素は、適切な蛍光色素によるアクチンの標識です。Alexa Fluorやrhodamine C5-NHSエステル誘導体など、アクチン表面の露出したリシン残基を標的とする蛍光色素の使用を推奨します。長期保存前にスペックルを明るく個別に視認できるようにするためには、アクチンモノマー1つあたりの染料の標識比を0.3から0.7の高い範囲に維持することが重要です。標識したアクチン溶液を、4°Cで75,000から80,000 ×gで20分間遠心分離して清浄化します。標識アクチンは、Gバッファー溶液に入れ、-80°Cで保存してください。不溶性凝集塊の形成につながる繰り返しの凍結融解を避けるため、2 µLずつの分注液を調製しました。花四数（floral fours）の光退色を防ぐため、標識したアクチン溶液を長時間直射光にさらさないでください。また、長期保存には遮光性のマイクロ遠心チューブを使用してください。マイクロインジェクション用の細胞は、酸洗浄した正方形のガラスカバースリップ上に配置します。標準的な基板コーティングをカバースリップに適用することができ、これはマイクロインジェクションに影響しません。アクチンの調製中に細胞を37°Cで保持し、マイクロインジェクションに適した細胞を選択してください。FSMについては、以下の基準を検討してください。細胞は大きく、直径が 50 µm 以上で、プレートに播種された際に平坦に広がり、基質に自然に接着している必要があります。また、細胞の細胞質が核よりも広い面積を占めていることが望ましいです。適切な細胞株としては、PTK1、イモリ肺細胞、およびAIAニューロンなどが挙げられます。このデモンストレーションでは、PTK1上皮細胞に注入を行います。マイクロインジェクション針の適切な選択は、チップ開口部のサイズに依存します。通常、孔のサイズは0.5 µmから最大3 µmまで異なります。開口径は0.5から1 µmの間が最適です。Actonのマイクロインジェクション用針は、市販品を購入するか、自作することができます。市販のニードルプラー（針牽引機）が利用可能な場合、初心者は注入手順を開始する前に10本から20本の牽引済み針を用意しておくことをお勧めします。次のステップでは、ラベル化したactonを氷冷した注入バッファーで希釈します。すべての作業溶液は氷上で保持してください。針に充填されるactonの最終濃度である理想的な注入濃度は、0.5から1 µg/µLの間です。Dとアクチンモノマーの負荷量の標識率を40%とした場合、希釈したアクチン溶液を0.5～1 µL分注します。マイクロシリンジの針を用い、慎重にアクチン溶液を分注してください。この際、気泡が入らないように注意します。気泡がある場合は、気泡周囲の余剰液体を吸い上げることで簡単に除去できます。Acton溶液が針先に完全に溜まっていることを確認してください。針のキャピラリー沿いに余剰な溶液があると、注入フローを妨げる可能性があるため、残らないようにしてください。充填済みの針が、マイクロインジェクション用のインジェクションホルダーに取り付けられる準備が整いました。インキュベーターから細胞を取り出し、カバーガラスを顕微鏡のステージ上に配置します。マイクロインジェクションの手順を開始するために、充填済みの針を顕微鏡まで運びます。針先が触れないように注意しながら、インジェクターホルダーに針を慎重に取り付けます。針が顕微鏡ステージの底部に対して35〜50度の角度になるようにホルダーを配置します。針先を、培養液の表面にわずかに触れるまで下げます。ここで、ニードルの先端が対物レンズの中心の真上に位置するように調整します。ニードルの先端が対物レンズと正しく揃っていれば、接眼レンズを通して明るいハロー（光輪）が見えるはずです。これがニードルの先端部分です。ニードルをゆっくりと左右に動かすことで、ハローの位置をより正確に特定できる場合があります。ナビゲートする際は、ニードルの先端が細胞よりも十分に高い位置にあることを確認してください。ニードルの先端が破損するのを防ぐため、細胞がはっきりと見えるまで顕微鏡のZ.Focusを調整してください。次に、フォーカスを調整しながらニードルの先端をゆっくりと下げ、ハローが徐々に収縮し、最終的にニードルの先端に収束するまで操作します。また、直線的な影を落とすニードルのシャフトを探すこともできます。ニードルを下げていくことで、ニードルのシャフトが徐々に明確になります。コントラストを向上させるために、位相環の微調整が必要な場合があります。針の先端と細胞の両方が鮮明に見える状態にする必要があります。注入する細胞を選択する際は、細胞の自由縁が針先に向くようにしてください。これにより、核が存在する最も厚い部分から最前縁の最も薄い部分にかけての細胞の傾斜面が、針先と平行にならずに適切に接触することになります。ニードルの圧力を0.3〜0.8 PSIに設定します。一定の圧力をかけることで、acton溶液が安定して流れます。注入する細胞を決めたら、ニードルの先端が細胞核の隣に来るように配置し、ゆっくりと下げながら、先端が押し込まれるまでニードルの位置を調整してください。膜を貫通するまで、針を少しずつ下げてください。針が完全に膜を貫通すると、細胞がより明るく見えます。この変化が見られたらすぐに、針が細胞に触れない位置まで上げてください。実際の穿刺および注入プロセスには0.5秒から2秒かかります。正しく行われれば、細胞の形状に変化は見られません。細胞へのストレスを最小限に抑えるため、1回のマイクロインジェクションセッションは20分から45分以内に完了させてください。注入時に細胞に変化が見られず、細胞が明るくならないことがあります。これは、ニードルチップが詰まっている可能性があることを示しています。トランスインジェクターにクリーンボタンがある場合は、それを押して確認してください。ニードルの先端が開いている場合、定圧フローが著しく増加し、これは波紋や周囲のデブリの分散として観察されます。ニードルの先端が閉じている場合は、新しいマイクロインジェクションニードルを挿入するか、ニードルをゆっくりと下げて先端をガラスカバースリップに押し付け、先端の極めて一部を破損させることで、先端を切り出すことができます。破損部位の面積は、マイクロインジェクション終了時に針先端に向かって収束し始める部分である針先の面積の5分の1以下である必要があります。蛍光性の残渣を除去するため、ディッシュ内の細胞培地を、あらかじめ温めておいた新鮮な培地に交換してください。培地を交換した後、イメージングを行う前に、37 °Cのインキュベーター内で30分間細胞を回復させてください。これにより、細胞がインキュベーター内で回復している間に、アクチンが既存の細胞骨格ネットワークに組み込まれます。次に、イメージングチャンバーの組み立てを開始します。まず、イメージング用培地を37 °Cのウォーターバスでプレウォームします。続いて、15 µL分注したoxa eraseを室温で解凍します。後で培地にRAを添加することで、光退色による影響を大幅に軽減できます。oxa eraseをアルミホイルで包んでおくことで、光感受性化合物が光から保護されます。VAPシーラントを低温に設定したホットプレートで予熱してください。VAPを加熱しすぎたり焦がしたりすると、シーラントとしての効力が失われます。純エタノールを浸したKimwipeでマイクロスライドを拭き、汚れや小さな破片を取り除いて清浄にします。別のマイクロスライドなどの清潔で平らな面を使用して、2.5 cmの同サイズの両面テープを2枚、上に重ねて貼り付けます。台座として、閉じ込められた気泡を押し出し、完全に平らな面を作成します。次に、カミソリを使用して、テープの長軸に沿って幅0.5 cmの直線的なストリップを2本切り出します。ピンセットを用いて、それぞれのストリップをマイクロスライドの長辺に沿って配置し、2本のテープの間の中央に隙間ができるようにします。テープを軽く押さえ、ガラス面にしっかりと密着させます。これらのテープ状のストリップは、マイクロスライドとカバーガラスの間のスペーサーとして機能します。バルブが完全に液状になっていることを確認してください。次のステップに進む前に、あらかじめ温めておいたイメージング用培地を用意してください。500 µLの培地に対し、15 µLのoxy raysを添加します。キムワイプを三角形に折り畳み、3つの鋭いエッジを作ります。これは後でカバーガラスを拭くために使用します。ピンセットを用いて、インキュベーターから細胞を回収します。カバーガラスの端を素早く持ち上げます。細胞側を上にし、組織に触れないようにカバーガラスをキムワイプの上に置きます。折りたたんだキムワイプを使用して、カバーガラスの向かい合う2辺を拭き、表面を半乾燥状態にします。次に、ピンセットでカバースリップの端をつかみ、乾燥した面が2本のテープに沿うようにマイクロスライド上に配置します。これで2辺が閉じ、2つの隙間が開いた状態になります。イメージング用メディアRA溶液 200 µLを、一方の開口部の近くにゆっくりとピペットで注入します。気泡を混入させないことが重要です。溶液は毛細管現象によって新しく組み立てたチャンバー内に吸い上げられ、これにより細胞が溶液に完全に浸されます。綿棒を使用して、カバーガラスの四隅に溶けたvapを塗り、カバーガラスを素早く固定し安定させてください。VAPは室温で数秒以内に乾燥することがわかります。次に、閉じた側から始めて、綿棒を使用して筆で描くようにVAPを細く塗布します。開いた側に対しても同様に繰り返します。コーティングの手順を繰り返してvapの層をゆっくりと厚くし、封止を強化します。VAPはカバースリップの端にのみ塗布し、中央部分は何も付けずに空けておきます。カバースリップの端が封止されたら、綿棒にDD H2Oを浸してカバースリップの中央部分を優しく拭き取り、残留した培地を除去します。細胞を潰さないように注意してください。純エタノールを用いて、この洗浄ステップを繰り返します。これで、蛍光スペックルイメージングに最適化された、完全に密閉されたイメージングチャンバーが完成しました。完全に密閉された容器を使用することで、floral foursの急速な光退色を防ぐことができます。完全に密閉されたチャンバー内の細胞は、これでイメージングが可能な状態になりました。ここでは、水銀ランプ、エピ照明装置、適切なフィルター、および油浸プランレンズを備えた倒立広視野顕微鏡を使用します。アポクロマート対物レンズによる画像は、6.7 micronの画素を持つ冷却CCDカメラと画像取得ソフトウェアを用いて撮影します。顕微鏡ステージを37 °Cに予熱します。イメージングチャンバーを設置し、撮影前に温度が安定するまで10〜15分間待ちます。温度が安定したら、明視野で細胞にフォーカスを合わせ、適切な蛍光設定に切り替えて注入された細胞を探します。光退色を抑えるため、蛍光露光時間は最小限にするようにしてください。健康的で湾曲したリーディングエッジを持つ注入細胞を探します。過剰に注入された細胞は、多数のフィロポディア（糸状仮足）に似た、後退しギザギザとした縁が特徴となります。これらの細胞はイメージングしないでください。撮影設定は、細胞の種類、標識されたアクチンの品質、および顕微鏡の構成部品によって異なります。ただし、露光時間は2秒を超えないようにし、フレーム間の時間間隔は5秒から10秒の間に設定してください。カメラのゲイン設定を上げることで、信号対雑音比を向上させることができます。理想的なスペックルの特性としては、各スペックルが隣接するスペックルとおよそ2スペックル径の間隔で配置されている必要があります。上皮細胞の場合、アクチンネットワークのスペックルは均一に現れ、スペックルが等間隔に分散して見えます。最適なスペックル画像を得るために、露光設定を調整してください。良好なスペックル動画を得るための鍵は、フォーカスを維持することです。これは、特にスペックル流やターンオーバー測定を含む事後解析において重要になります。したがって、定量解析の質は、タイムラプス撮影期間中にフォーカスを固定できているかどうかに依存します。フォーカスを維持するためのさまざまな戦略が本文に詳しく記載されていますが、このデモンストレーションではNikon Perfect Focusシステムを使用します。ここでは、マイクロインジェクションを施した細胞のさまざまな例を示します。左のパネルは、低濃度のスペックル画像を用いたマイクロインジェクション後の細胞を示しています。中央のパネルは、注入濃度が高すぎた細胞のスペックル画像を示しており、右のパネルは最適に注入された細胞を示しています。これは、良好なスペックル画像を得るためのFSMの結果です。以上で、蛍光スペックル顕微鏡法のために、蛍光標識したアクチンを上皮細胞にマイクロインジェクションする方法について説明しました。この手順を行う際は、ラベル化されたactonの品質およびマイクロインジェクションの技術が、スペックル画像の全体的な品質を左右することを十分に留意することが極めて重要です。以上となります。皆様の実験の成功を願っております。

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