背側前脳の外植片上に成長因子-コーティングビーズの配置
January 30th, 2007
このビデオでは、大脳皮質の外植片に、成長因子でコーティングされたビーズを、準備して置くための2つの方法を示しています。これらのビーズは、前脳の外植片のような神経組織の開発に空間的に制限された遺伝子の発現を誘導するために使用することができます。メソッドは、アッフィ - ゲルビーズやヘパリンacryllicビーズの両方を使用するために与えられている。
これが私が最初に使用するビーズの種類です。ジェルブルーのジェルビーズです。彼らは柔らかいです。
だから、私はXs.Theのビーズの2番目のタイプは、ヘパリンアクリルビーズであるXs.Theにこれらのビーズを配置するために、口ピペットの端にプールガラスピペットを使用する必要があります。それらは硬いタイプのビーズであり、タングステン針を使用してX外植片にこれらのビーズを配置します。これがガラスキャピラリーチューブで、まずブンゼンバーナーで溶かします。
次に、それらを引っ張って、より細かい先端を作成します。そこで、キャピラリーチューブを炎の真ん中に持ち、チューブが溶けるときに転がします。柔らかくなるのが感じられます。
炎から持ち上げてから引き抜きます。このダイヤモンドチップペンで毛細管全体に線をエッチングして、まっすぐにカットできるようにします。次に、端を火炎研磨してきれいにします。
キャピラリーを炎に通して端を磨き、開口部を小さくして、ビーズがキャピラリーを通過するのではなく、ビーズを捕らえることができるようにします。注意すべき重要なことは、キャピラリーチューブを炎の中であまり長く保持したくないということです。実際には非常に速いパスで、そうでなければシールされてしまいます。
私は通常、これらのいくつかを作成しますが、その多くは先端が炎で密封されている場所で判明するためです。コントロールするのが難しいので、いくつか作るだけです。これは、先端が密閉されている例です。
これは良いピペットの一例です。私はこのエイノールチューブに250マイクロリットルのアゲルビーズをピペットで入れ、1ミリリットルのPBSで5回洗って、浸していたアジ溶液を取り除きます。ビーズが落ち着くまで約3分待ってから、余分なPBSを吸引し、これをさらに4回繰り返します。
ビーズはまだ完全に落ち着いていないので、ビーズが落ち着いているので、余分なPBSを吸引してこれを4回繰り返すつもりです。そして最後に、PBSを300マイクロリットル追加して、ビーズの作業を開始します。これは標準的なマウスピペットで、引っ張ったキャピラリーを3分の1ほど上に押し込むだけです。
まず、ピペットにPBSを入れます。それは通常、毛細管現象だけで満たされます。これは30ミリ培養皿の蓋をしたもので、ビーズの液滴を青く入れました。
そしてその隣にはPBSの小さな液滴があります。そして、この皿には5マイクロリットルのタンパク質溶液が入っています。この場合、BとPの4つですが、マウスピペットを使用して選択したタンパク質を使用することもできます。
ここでこの青い円からビーズを移し、PBSの液滴で一度すすぎます。次に、ビーズをマウスピペットで取り、タンパク質溶液の液滴に入れ、室温で約1時間または4度で数時間インキュベートします。そこで、PBSにビーズのプールがあり、適切なサイズのビーズを選択する必要があります。
小さすぎると、マウスピペットを通過するだけです。彼らはただ最後に座っている必要があります。さて、ここで私が選んだビーズ、大きいビーズが3つ、小さいビーズが3つ
あることがわかります。実験では大きい方のビーズを使用します。次に、PBSの液滴から大きなビーズをタンパク質溶液の液滴に移します。そのために、舌をマウスピペットからそっと引き離します。
吸うような動きではなく、ただ負圧をかけるだけです。そして、それを移し替えてから、基本的に舌を口の上に戻します。パイプヘッドは、吹くのではなく、ビートを端から押し出すために正の圧力を追加するだけです。
現在、タンパク質溶液の液滴に5つのビーズがあり、それらを4度で数時間、または室温で30分から1時間インキュベートします。つまり、これは、私がすでに解剖したナスと一緒に培地に浮かんでいる膜を含む培養皿です。ピペットの先端を取って、メディアの一部を吸い込みます。
X explanにビーズを配置する直前に、メディアの液滴でビーズを1回だけすすぎます。これらは、アクリルビーズを拾って配置するために使用するタングステン針です。これはタングステン針で、今はホルダーに入っています。
そして、これらはいくつかの素晴らしい鉗子です。45度の角度で。タングステン針を鉗子で使用して、このPBSのプールからビーズを持ち上げ、ビーズをタンパク質溶液の液滴に移します。
私がアゲルビーズでやったように。アゲルビーズと同様に、これらのアクリルビーズをPBSで5回すすぎ、液滴をこのプレートに移しました。次に、タングステン針を鉗子で使用して、ビーズをタンパク質の液滴に移し、ゲルビーズと同じようにインキュベートします。
だから、ビーズを持ち上げるのです。私は右手をテーブルにしっかりと押し付け、左手の人差し指で針を安定させながら液体の中へ降りていくと、針でビーズに軽く触れてゆっくりと液体から持ち上げます。時々針から落ちるので、別の針に戻ってください。
今、私の左手には45度の角度の鉗子があります。ポイントを下にして、ビードと針を液に触れて使用します。鉗子の先端を使って、そっと押します。
だから今、私はタンパク質に5つのビーズを持っています。さて、だから私の右手ではビーズにタングステン針があり、左手では、鉗子を再びポイントを下にして、それらを押し出すのと同じ方法で4つ、ここでもう一度やります。37°Cでインキュベートし、時間は特定のアッセイによって異なります。
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概要
このビデオでは、発生中の大脳皮質の組織切片に成長因子でコーティングされたビーズを準備し、配置する2つの方法を示しています。これらのビーズは、前脳切片などの発生中の神経組織で空間的に制限された遺伝子発現を誘導できます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 遺伝子発現
背景
- ビーズは神経組織の遺伝子発現を操作するために使用できます。
- ビーズの種類によって、その応用に影響を与える物理的特性が異なります。
- これらの方法を理解することは発生神経科学研究にとって重要です。
- 成長因子は神経発生において重要な役割を果たします。
研究の目的
- 成長因子でコーティングされたビーズの準備と応用を実証すること。
- これらのビーズを大脳皮質切片でどのように使用できるかを示すこと。
- 研究者に遺伝子発現を誘導するための実践的な方法を提供すること。
使用された方法
- プールされたガラスピペットを使用したゲルブルーゲルビーズの準備。
- タングステン針を使用したヘパリンアクリルビーズの適用。
- 正確なビーズ配置のためのガラス毛細管チューブの溶解。
- 両方のタイプのビーズに関する技術の実演。
主要な結果
- 切片へのビーズの配置に成功しました。
- 両方のビーズタイプが効果的に実証されました。
- 成長因子コーティングによって遺伝子発現の誘導が促進されました。
- これらの方法は類似の実験セットアップに再現できます。
結論
- 示された方法は神経組織の遺伝子発現を操作するのに効果的です。
- 研究者はこれらの技術を発生神経科学のさらなる研究に活用できます。
- ビーズの特性を理解することは最適な応用に不可欠です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Spatially controlled delivery of growth factors to neural explants enables precise interrogation of developmental signaling pathways, supporting early-stage target validation in neurobiology. Quantitative placement of coated beads facilitates hypothesis-driven studies of localized gene expression, reducing mechanistic ambiguity in pathway analysis. This approach strengthens predictive confidence for downstream screening and translational research in neurodevelopmental disorder models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables localized delivery of signaling molecules to dissect pathway function in neural tissue.
- Supports functional validation of candidate targets by inducing spatially restricted gene expression.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating effects of specific growth factors on explant development.
- Improves predictive confidence for advancing neurodevelopmental targets in the portfolio.
Screening & Assay Development
- Prepares explant systems with defined growth factor gradients for downstream phenotypic screening.
- Standardizes bead placement and incubation to ensure reproducible quantitative outputs.
- Enables assay scalability and platform reuse by adapting bead types and placement tools.
- Supports reliable evaluation of compound effects in spatially controlled biological contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro explant models with disease-relevant developmental processes for translational continuity.
- Provides a foundation for biomarker discovery linked to spatial gene expression changes.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by clarifying pathway-specific effects in preclinical models.
- Enhances predictive de-risking for neurodevelopmental therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This bead placement method integrates into the early discovery continuum, bridging hypothesis testing, target validation, and assay development for neurobiological research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven manipulation of signaling pathways in neural explants.
- Screening: Provides reproducible, spatially controlled systems for quantitative phenotypic assays.
- Analytics: Enables measurement of localized gene expression and pathway activation in response to growth factor delivery.
- Translational Research: Connects in vitro findings to preclinical models of neurodevelopmental disorders when aligned with disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various growth factors and explant systems for repeated use across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pathway analysis.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows for bead preparation and placement.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target relevance early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in micro-manipulation and explant culture handling.
- Needs access to specialized tools such as pulled glass pipettes and tungsten needles.
- Demands cross-team standardization of bead preparation and placement protocols.
- Adaptation may be necessary for different explant types or growth factor formulations.
- Practical limitations include bead size selection and maintaining bead integrity during placement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:45
Types of beads: Affi-Gel and Heparin Acrylic
1:13
Affi-Gel bead placement
14:32
Example of obtained results
11:27
Preparation of acrylic beads
1:18
Preparation of glass capillaries
3:47
Preparation of Affi-Gel beads
13:31
Acrylic bead placement on explant
9:32
Affi-Gel bead placement on explant
