背側前脳の外植片上に成長因子-コーティングビーズの配置

こちらが最初に使用するビーズです。青色のゲルビーズで、柔らかい性質を持っています。

そのため、口ピペットの先にプールガラスピペットを取り付け、これらのビーズをXの上に配置します。次に紹介する2種類目のビーズは、ヘパリンアクリルビーズです。これらは硬いタイプのビーズであり、タングステン針を用いてX外植片の上に配置します。まず、ブンゼンバーナーを用いて加熱・溶融させるガラスキャピラリーチューブがこちらです。

次に、より細い先端を作るために、チューブを引っ張ります。キャピラリーチューブを炎の中央に保持し、チューブが溶けるのに合わせて回転させます。柔らかくなるのが感じられます。

炎から取り出し、引き伸ばします。次に、ダイヤモンドチップペンを用いてキャピラリーチューブに線状の刻み目を入れ、直線的に切断できるようにします。その後、端部を火炎研磨して整えます。

キャピラリーを炎に通して先端を研磨し、開口部を狭くします。これにより、ビーズがキャピラリーを通り抜けるのではなく、キャピラリーでビーズを捕捉できるようになります。注意点として、キャピラリーチューブを長時間炎にさらしてはいけません。実際には非常に素早く通過させる必要があります。そうしないと、先端が封止されてしまいます。

先端が炎で封止されてしまうことが多いため、通常はいくつか作成します。コントロールが難しいため、予備を含めて複数用意してください。これは先端が封止されてしまった例です。

これは適切なピペット操作の例です。エッペンドルフチューブにアゲルビーズを250 µL分注しました。浸漬していたazi溶液を除去するため、1 mLのPBSで5回洗浄します。ビーズが沈殿するまで約3分間待ち、余分なPBSを吸引除去します。この操作をあと4回繰り返します。

ビーズがまだ完全には沈降していません。ビーズが沈降したところで、余分なPBSを吸引し、この操作を4回繰り返します。最後に300 µLのPBSを加え、ビーズの操作を開始します。これは標準的なマウスピペットで、自作のキャピラリーを挿入し、上から3分の1ほどの深さまで押し込みます。

まず、ピペットにPBSを満たします。通常は毛細管現象によって充填されます。ここでは、30 mm培養皿の蓋の上に、青色のビーズの液滴を滴下しています。

その隣にPBSの小さな液滴があります。そして、こちらのディッシュには5 µLのタンパク質溶液の液滴があります。ここではBNP4を使用していますが、マイクロピペットを用いて任意のタンパク質を使用することも可能です。

ここにある青色の円からビーズを転送し、PBSの液滴で1回洗浄します。次に、マウスピペットでビーズを回収してタンパク質溶液の液滴に移し、室温で約1時間、または4°Cで数時間インキュベートします。このようにPBS中にビーズが集まっており、適切なサイズのビーズを選択する必要があります。

ビーズが小さすぎると、単純にマウスピペットを通り抜けてしまいます。ビーズが先端に留まる必要があります。このように、大きなビーズを3つと小さなビーズを3つ選びました。

実験にはサイズの大きいビーズを使用します。これから、PBSの液滴からタンパク質溶液の液滴へ、大きなビーズを1つ移動させます。そのために、マウスピペットからゆっくりと舌を離します。

吸い上げるような動作ではなく、単に陰圧をかけるだけです。その後、それを移動させ、舌を再び口部分に置きます。パイプヘッドを、吹くのではなく、陽圧をかけてビーズを端から押し出します。

タンパク質溶液の液滴の中に5つのビーズが入った状態になりました。これを4°Cで数時間、または代替的に室温で30分から1時間インキュベートします。こちらは、培地に浮かべてある膜と、すでに解剖済みの卵管を含む培養皿です。ピペットのチップを使って、培地を少量吸い取ります。

ビーズをX平面に配置する直前に、培地の一滴で一度だけ洗浄します。これらは、アクリルビーズを採取し配置するために使用するタングステン針です。こちらがタングステン針で、現在はホルダーに装着されています。

そして、これらは精巧なピンセットです。45度の角度になっています。タングステンのニードルピンセットを使用して、PBSのプールからビーズを1つすくい上げ、タンパク質溶液の液滴に移動させます。

アゲルビーズの時と同様に行います。アゲルビーズと同様に、これらのアクリルビーズをPBSで5回洗浄し、液滴をこのプレートに転送しました。次に、ピンセットでタングステン針を保持し、ビーズをタンパク質の液滴に転送して、ゲルビーズの時と同じようにインキュベートします。

ビーズをすくい上げる操作です。右手をテーブルにしっかりと固定し、左手の人差し指で針を安定させながら液体の中に進めます。針でビーズに軽く触れ、ゆっくりと液体から持ち上げます。時々ビーズが針から脱落することがありますが、その場合はもう一度やり直してください。

次に左手で、45度角度鉗子を持ちます。先端を下に向け、ビーズと針を液体に触れさせます。鉗子の先端を使用して、それをそっと押し出します。

これでタンパク質を含むビーズが5つになりました。それでは、右手でタングステン針をビーズに刺し、左手で再度ピンセットを持ち、4つのビーズを押し出したときと同様に先端を下に向けます。ここでも同様に操作します。37°Cでインキュベートし、時間は各アッセイによって異なります。