収穫と準備ショウジョウバエ胚

ショウジョウバエの胚で電気生理学的記録を行うには、まずショウジョウバエの胚を採取し、調整し、解剖する必要があります 制御された解剖は、水重合外科用接着剤で可能になります。次に、安定化した胚から内臓を取り出して、腹側CNS、末梢神経、体性筋組織を露出させます。こんにちは、ここイリノイ大学シカゴ校の生物科学部のデイブ・フェザーストーンです。

こんにちは、イリノイ大学シカゴ校生物科学部のデイブ・フェザーストーン研究室のトンです。今日は、Joofから後期胚を収集し、手動で解剖する方法をご紹介します。この手順を使用します 一般的なラボ joof神経筋系の発達と機能の電気代替テストの準備

それでは始めましょう。このプロトコールは、さまざまな実験で使用される一般的な手順である胚収集から始まりますが、これからレビューします。産卵ポットに20〜40匹の若いオスとメスのハエの混合物を確立します。

摂氏25度の加湿チャンバーに保管します。胚の発生段階を正確に推定するためには、温度と湿度が一貫している必要があります。市販の敷設ポットが利用可能ですが、60ミリメートルのリンゴオーガープレートに収まる穴あき100ミルトリップの貧しいプラスチックビーカーから構築できます。

リンゴオーガーのレシピは、書かれたプロトコルに記載されています。ビーカーのミシン目は、加熱されたプローブで行うことができ、成虫のハエよりも小さくする必要があります。プレートには酵母ペーストのボーラスが補充されており、これにより女性は多くの卵を産むように刺激され、酵母と水をピーナッツバターの粘稠度に混合し、次にへらでプレートに塗ります。

プレートを1日2回交換し、フライをプレートからタップします。そして今、新しい皿を置くことができ、それをインキュベーターに戻すことができます。しかし、その間に、3日目までにここにどれだけの卵が産まれたかを確認することができました。

良い鍋は、夜明けから深夜にかけて最も卵の生産量が多く、1時間あたり100〜200個の卵を生産する必要があります。コレクションプレートオーガーへの収集、引っかき傷、またはチゼルの起源を簡単にするために、この手順ではほとんどの卵が引っかき傷の中または隣に置かれます。ハエは1〜2時間産卵できるため、後期の胚を収穫することができますが、この時間枠は実験によって異なります。

また、実験に必要な胚の数によっても胚採取方法が異なります。解剖および電気生理学のためには、比較的少数の胚が必要であり、その場合、それらは細い鉗子でプレートから穏やかに摘み取ることができる。外側のコリオンを除去するには、胚を蒸留水ですすぎ、新鮮な50〜100%漂白剤を含む皿に置き、各胚を解剖顕微鏡で監視します。

30〜120秒後、コリオンは溶解し、光沢のある透明なバイタルメンブレンが露出します。漂白剤は活力のある組織を急速に破壊する可能性があるため、脱塩素卵は短時間すすぐか、生理食塩水に入れる必要があります。脱塩素卵を蒸留水が入ったプラスチック製の培養皿に入れます。

このとき、蛍光解剖顕微鏡でGFPマーカーを確認することで視覚的にジェノタイピングすることができ、目的のものを選別した後、適切なフィルターで解剖を進めます。胚は解剖ピンには小さすぎるため、ある程度の高度な準備が必要です。キューティクルが発達した古い胚は、シアノアクリレート外科用または獣医用接着剤 シアノアクリレート外科用接着剤(ヒストアールとも呼ばれる)を使用して、ソガーコーティングされたカバースリップに接着する必要があります。

青色は、二価イオンを含む溶液と接触して重合するため、うまく機能します。解剖を開始するには、目的の胚を葉巻でコーティングしたカバースリップに移し、背側を上にして生理食塩水を滴下します。ガラスマイクロピペットまたはタングステン針でメンブレンに小さな切開をして、バイタルメンブレンを取り外します。

その後、胚を膜からそっと解放します。初期段階の胚は、きれいなガラスまたはポリLリジンでコーティングされたガラスに直接付着します。古い胚の場合は、ゴムチューブに取り付けられた小さなガラスピペットを介して外科用接着剤を送達することにより、サードコーティングされたカバースリップに取り付けます。

接着剤の流れは口で制御されます。少量の接着剤を使用して、ヘッドとテールをしっかりと取り付けます。接着剤は生理食塩水ですぐに溶けるため、これは慎重に行ってください。

安定化した胚を解剖するには、ガラス電極または鋭利なタングステン針で背側正中線に沿って線を静かに穿孔します。同じツールを使用して、ミシン目を切り開いて切開します。解剖針は常に浅い角度にあることが、腹側神経筋の損傷を避けるために重要です。

次に、ゴムチューブに取り付けられたガラスピペットから穏やかな口内吸引を使用して内臓を取り出します。切開部の側面をカバースリップに取り付けるために、より多くの接着剤を使用して胚を平らに広げます。すべての内臓が掃除機で取り除かれたら、腹側CNS末梢神経と体性筋組織を実験のために露出させます。

この時点で、胚は電気生理学的記録の準備ができているか、または従来の技術を使用して免疫組織化学およびその後の顕微鏡検査のために固定することができます。胚を柔らかくするために、後の段階を分離して解剖する方法を紹介しました。外科的接着剤の適用と胚の解剖は最初はイライラするでしょうが、秘密のトリックはありません。

数週間の練習で細かい運動能力を伸ばす必要がありますが、徐々に解剖の成功率が増加します。筋肉細胞と運動ニューロンからの記録構成を詳しく説明している他のジオビデオをご覧ください。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。