Name: の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶショウジョウバエ胚の電気生理学的記録法。全細胞パッチクランプと吸引電極を用いて、神経筋接合部と中枢シナプスの発達を解析し、シナプス伝達の機能的理解を深める。

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ショウジョウバエの胚からの電気生理学的記録は、マニュアル操作と解剖が必要になります。準備の健康、およびレコーディングの結果としての品質は、迅速かつきちんと記録するための脆弱な胚組織を準備するためにできることつに依存し、実験を実行してください。実験者は、一度に両方に取り組むしようとする前に胚の解剖とパッチクランプ電気生理学の両方を習得している必要があります。 録音は&quot;変更された標準&quot;または&quot;体液のような&quot;（HL）サランのいくつかの種類の一つで行うことができます。これら二つの生理食塩水のクラスの主な相違点は1）のNa +濃度（70 mMのHL対120から135 mMの標準）と2）のMg 2 +濃度（4mMの標準対20 mMのHL）。標準溶液の高いNa +濃度の主な利点は、アクション電位の伝播と、それゆえ、通常の、パターン化されたシナプス伝達の維持管理を容易にするためです。 HL Salinesのは、アクション電位を介したシナプス伝達を抑制する。電位依存性カルシウ...

の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

ショウジョウバエ胚発生と機能的神経科学の両方の研究のための最高の遺伝的モデルです。伝統的に、これらのフィールドは非常に大部分が独立の歴史と科学的なコミュニティと、互いに分離されています。しかし、これらは通常異なる学問分野間のインターフェイスは、神経回路形成の最終段階、機能化学シナプスの機能的電気信号特性と分化の買収の基礎となる発生プログラムです。このインタフェースは、調査のために非常に重要な領域です。 ショウジョウバエでは、機能開発のこれらのフェーズは、胚発生の最後の3分の1の間（25℃）&lt;8時間の期間中に発生します。この後期発達期間が長くタフな、不浸透性の表皮クチクラの堆積により調査に難治性と考えられた。画期的な進歩は、局所的に後期胚の制御解剖を有効にするためにキューティクルに適用できる水重合外科接着剤のアプリケーションでした。背側縦切開で、胚は実験的な調査に腹神経索と体壁の筋肉組織を露出させる、フラットなレイアウトすることができます。ホールセルパッチクランプ法は、個々に識別可能な神経細胞と体細胞の筋から記録するために使用することができる。これらの記録の構成は、イオン電流とニューロンと筋肉の両方の活動電位伝播の外観と成熟を追跡するために使用されています。これらの電気的性質に影響を与える遺伝的変異体はイオンチャネルとそれに関連するシグナル伝達複合体の分子組成を明らかにするために、そして機能的な分化の分子機構の探索を開始するために特徴づけられている。特定の焦点は、中枢神経系と末梢の両方で、シナプス結合のアセンブリとなっています。グルタミン酸作動性神経筋接合部（NMJ）は、光学イメージングと電気生理学的記録の組み合わせに最もアクセスが可能です。ガラス吸引電極は、電圧クランプ筋肉で行われた興奮性接合の電流（EJC）の録音で、末梢神経を刺激するために使用されます。この録音の設定は、シナプスの機能分化をグラフ化し、シナプス前性グルタミン酸放出特性の外観と成熟を追跡するために使用されています。さらに、シナプス後のプロパティは、グルタミン酸受容体のフィールドの外観と成熟を測定するために、筋肉の表面に直接グルタミン酸のイオン導入や圧力のアプリケーションを介して個別に測定することができる。このように、両方の前とシナプス後要素が胚シナプス形成時に個別にまたは組み合わせて監視することができます。このシステムは、大きく胚性シナプス形成を損なうため、シナプスの接続と機能的なシナプス伝達特性の仕様と差別化を支配する分子メカニズムを明らかに遺伝的変異体を分離し、特徴付けるために使用されています。

電気生理学的記録から<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚は、開発途上筋肉と神経細胞の電気的特性の分析だけでなく、グルタミン酸作動性神経筋接合部と中央のコリン作動性およびGABA作動性シナプスにおける機能的シナプス形成の特性評価を可能にする。

ショウジョウバエ（Drosophila）は、胚発生と機能的神経科学の両方を研究するための主要な遺伝学的モデルです。従来、これらの分野はかなり...

適切に調製したoph胚の体壁から、筋肉および運動ニューロンの電気生理学的記録を得ることができます。筋肉6、7、12、または13はホールセル記録構成で容易に記録でき、ギガオームシールを形成して神経筋接合部から記録することで、強固なミニチュア振幅電流を測定することが可能です。吸引電極を用いてCNS出口付近の運動神経を引き込み、シナプス前刺激を与えながら、シナプス後の筋肉においてホールセル電流を測定することができます。あるいは、ピペットを用いてイオン導入法または圧力噴射法により、記録電極の近傍に興奮性神経伝達物質を投与することも可能です。こんにちは。イリノイ大学シカゴ校生物科学部のDaveの研究室のTonです。今日は、前脊髄期の胚性神経筋接合部および中枢ニューロンの電気生理学的記録について解説します。これらの手順は、joof神経筋系の機能と発達を研究するために使用しています。これらの手法はもともとKendall Brodyによって開発され、David Fit Stoneを経て私へと伝えられました。本日は、それを皆さんに伝授します。この手順では、あらかじめ胚を適切に採取し、解剖しておく必要があります。その方法については、Brody FeatherstoneおよびChenによる付随する出版物の「Electrophysiological Recordings from Jossa embryonic muscles and neurons」をご参照ください。記録には標準的なホールセルパッチクランプ法を用います。まず、解剖した胚を小型のプレキシガラス製記録チャンバーに入れます。生理学的記録エリアはファラデーケージによって電気的に遮蔽され、振動減衰テーブル上に設置されています。チャンバーは、KY光学系と40 xの長作動距離水浸対物レンズを備えた正立複合顕微鏡を用い、透過光下で観察されます。温度が上昇するとoph筋のパッチクランプが困難になるため、記録は通常、室温以下で行われます。記録電極の最終抵抗値は5～10 MΩとし、内径が約1 µmになるまで加熱研磨してください。記録電極の先端には、塩化カリウムとスクロースを含む生理食塩液を満たします。標準生理食塩水を含むバスに塩化銀接地線を配置し、この生理食塩水は胚の解剖にも使用します。信号はパッチクランプアンプを用いて増幅され、フィルタリングされた後、後刻の解析のためにデジタル保存されます。Axon社の機器およびソフトウェアなど、パッチクランプ実験に適したあらゆるシステムが使用可能です。胚性神経系の3つの異なる組織から採取した細胞（NMJの筋細胞、ニューロン、および中心運動ニューロン）を、刺激および記録することが可能になります。この胚の調製法を用いれば、ほとんどの実験において任意の胚性筋肉から記録を行うことができます。4つの縦走腹側筋（筋肉6、7、12、13）に焦点を当て、特に前腹部の筋肉6に注目してください。背側筋から記録を行う場合は、A2からA3の領域を対象とします。胚は背側を下にして接着し、幼い胚の場合は腹側正中線に沿って解剖する必要があります。筋肉の記録を行う前に酵素処理を行う必要はありません。ただし、クチクラが発達した後期の胚では、パッチ記録の前に筋肉鞘も形成されます。この鞘は、コラゲナーゼに短時間浸漬させることで除去する必要があります。ほとんどの記録は、セルアタッチ状態からわずかな吸引または電気的刺激（バズ）を加えることで容易に移行できる、ホールセル記録構成で行われます。これが「ザップ」であり、細胞膜を切断するために行われる電気刺激のことです。ホールセル構成において、筋肉細胞のシール抵抗は通常 1 GΩ を超えます。ホールセル電流は通常、シール形成から 3 分以内に得られます。多くの場合、直列抵抗は著しく増加し、細胞に漏れ電流が増大することがあります。パッチクランプを行うには、胚は少なくとも 14 時間以上経過している必要があります。それ以前の発達段階では不可能です。筋管の間で広範な電気的結合があるため、筋線維のパッチクランプ記録において電圧クランプの精度が低下します。一般的な保持電位は-60 mVから-80 mVであり、電圧クランプ法および電流クランプ法が使用可能です。-60 mVでのホールセル記録に成功すると、ここに示すように、数 pAから数百 pAに及ぶ強力な自発的シナプス電流が伴います。吸引電極を用いて運動神経を刺激することで、大きなNMJ電流を誘発できます。これらの電極は、さまざまな繊維充填ガラス電極から作製でき、ピペットを用いて適切に選択された中枢神経系（CNS）出口付近の分節運動神経の短いセグメントを緩やかに吸引し、所望の形状にするために火炎研磨を行う必要があります。密着したシールを形成するには、実験的に決定された強度（通常1〜5Vの間）で短時間の刺激を与えるのが最適です。刺激強さを実験的に決定した閾値よりも1〜2V高く設定することで、確実な刺激が可能になります。神経筋接合部（NMJ）のポストシナプス側にあるグルタミン酸受容体は、神経伝達物質であるグルタミン酸を適用することで活性化できます。グルタミン酸のような電荷を持つ分子は、イオン導入法を用いてNMJに送達することが可能です。受容体のマッピングには高抵抗ピペットを使用し、グルタミン酸受容体の総応答を推定するには低抵抗ピペットを使用します。イオン導入用ピペットには、100 millimolarのL-グルタミン酸溶液を満たします。L-グルタミン酸を放出させるには、リークを防ぐための小さな正のバックアップ電流を伴う短い負電流パルスを使用します。また、グルタミン酸やその他の電荷を持たない分子は、加圧注入を用いてNMJに送達することも可能です。加圧注入を行う場合は、1〜2 mMのグルタミン酸を使用し、ピコスプリッツァーを用いてピペットに5〜10 PSIの外向きの圧力をかけます。-60 mVでの神経刺激またはグルタミン酸投与によって誘発されるNMJ電流は、通常1500から2000 pAです。多くの胚ニューロンは、細胞体（soma）の位置と投射形態に基づいて個別に識別することが可能です。ほとんどの実験的記録では、胚の腹側神経索内にある5つの浅層背側ニューロンのグループに焦点を当てています。これらのニューロンから記録を行うには、プロテアーゼを用いた短時間の局所処理によって腹側神経索のニューロマ鞘を除去する必要があります。記録用の大口径パッチピペットを用いて0.5〜1%のプロテアーゼを注入し、鞘の物質をピペット内に吸い込むことで、細胞体を脱鞘します。口による緩やかな吸引と排出を繰り返すことで、鞘をピペット内で往復させることができます。1〜2分後には、鞘が破裂します。これで、細胞がホールセルパッチクランプ法のために露出しました。この記録パラダイムでは、生理食塩水の循環や加温は必要ありません。本調製で用いる外部記録用生理食塩水は、筋肉の記録に使用するものとは異なります。パッチピペットにLucifer yellowを充填することで、後でパッチ細胞の位置と形態を可視化できます。ここでは、Lucifer yellowを取り込み、蛍光顕微鏡を用いて可視化された中心運動ニューロンを示しています。ホールセル電位固定記録は、18 °Cで-60 mVの保持電位にて行われます。電流クランプ記録も可能です。ニューロンは、神経伝達物質であるアセチルコリンまたはGABAを用いて刺激することができます。これらは、神経接合部の記録時と同様に、イオン導入法または圧力噴射法を用いて細胞体に適用されます。ホールセル接続が確立されると、まず自発電流が観察されます。これは、刺激のない状態で-60 mVにパッチクランプした胚性腹側縦方向筋肉から得られた1分間の生のデータです。良好な調製のサンプルでは、通常、ここでは多くの下向きの電流偏向として示される、強力な自発的シナプス活動が見られます。ここでは、同一の筋肉に対し、その筋肉に至る運動神経に吸引ピペットを用いて刺激を加えた際のデータを示します。これにより、誘発接合後電流（eJC）を表す下向きの電流偏位が複数回認められました。また、こちらは圧力注入法を用いて1 mMのグルタミン酸を投与し、同一の筋肉を刺激した際のデータです。グルタメートは受容体を開き、大きな下向きの振幅を引き起こします。電流波形では、グルタメートを2回連続で投与した際の2つのトレースが示されています。以上で、後期 Xenopus 胚からの電気生理学的記録の手法について説明しました。電気生理学的記録には一般的に標準的なパッチクランプ法が用いられますが、本稿では詳細についてここでは省略します。理想的には、あなたの軟骨胚からの記録を試みる人は、より簡単な標本を用いてパッチクランプ法を習得済みであるべきです。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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