クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

この手順を開始するには、Kumasi Brilliant BlueまたはCBG two 50を1リットルの重蒸留水に2〜4時間攪拌して溶解します。塩酸は後でさらに1分間攪拌しながら紺色の溶液に加えられ、溶液は後で使用するために暗所で保存されます。タンパク質サンプルの調製とSTSページングに続いて、ゲルカセットを分解し、ゲルを箱に入れて、その後の3回の二重蒸留水による洗浄ステップを行います。

3回目の洗浄ステップの後、水はボックス内のゲルを覆うのに十分なCBB染色溶液と交換されます。箱を電子レンジで10秒間加熱し、ジェルの入った箱をシェーカーの上に置きます。染色の完了には、1分後にタンパク質バンドを観察することができます。

こんにちは、エンベリン・ハイデルベルクのタンパク質発現精製咳嗽施設のアムリ・ローレンスです。本日は、塩化物ゲル中の cooma brilliant blue G hundred 50 でタンパク質を染色するプロトコールをご紹介します。従来の染色法とは異なり、当社のプロトコールでは有機溶媒や酢酸は使用しません。

このプロトコルを使用して、各精製ステップの後にタンパク質を分析します。それでは始めましょう。CBB染色液を調製するには、60〜80ミリグラムのCBBを1リットルのビスト蒸留水に2〜4時間撹拌して溶解します。

CBVが溶解した後、溶液をドラフトに移します。ヒュームフードで、濃い青色の溶液に3ミリリットルの濃塩酸を慎重に加えます。1分間攪拌する場合は、最終溶液のpHが2になるため、手袋を着用する必要があります。

溶液が作られたら、後で使用するために暗闇で保管されます。この溶液は、染色効率を損なうことなく、数週間または最大数か月間保存できます。SDSページ用のタンパク質サンプルを調製するには、タンパク質サンプルの適切なアリコートをローディングバッファーと混合して最終濃度1 x ローディングバッファーにし、タンパク質サンプルを約5分間加熱してからロードします。

サンプルが加熱されている間、ゲル電気泳動チャンバーがランのために準備されます。MESバッファーをランニングバッファーとして使用したミニセルでプレキャストゲルを使用します。ただし、他のゲルおよび電気泳動システムを使用できます。

次に、加熱したタンパク質サンプルをゲルおよびelectro Eastに220ボルトで50分間ロードします。SDSページが完成したら、ゲルカセットを分解し、100ミリリットルのビスト蒸留水を入れた箱にゲルを入れます。その後の洗浄ステップでは、ボックスを電子レンジで30秒間加熱します。

沸騰する前に加熱を停止する必要があります。ジェルをシェーカーに置いた状態で箱を電子レンジで3〜5分間加熱した後、この洗浄手順を真水で2回繰り返します。3回水で洗った後、CBBスタンディング溶液を箱の中のゲルで覆い、箱を電子レンジで沸騰させずに10秒間加熱します。

その後、ゲルの入った箱をシェーカーに載せて染色を完了させます。タンパク質バンドは1分後と15〜30分後に観察できます。染色は通常十分に強力です。

染色液を注ぎ出し、50〜100ミリリットルの重蒸留水を加えます。ゲルの水色の背景をシェーカーにさらに保持するために、水を真水に置き換えてさらに染色を除去できます。必要に応じて、ゲルをスキャンしたり、写真を撮ったり、乾燥させたりして長期保存することができます。

この手順で染色したゲルは、このようになるはずです。このゲルでは、タンパク質バンドがよく染色され、はっきりと見えます。背景はごくわずかですが。

アスタリスクで示される最初のレーンには、分子量マーカーが含まれています。これに対して、染色前に十分に洗浄されていないゲルは、このゲルでは洗浄ステップが短すぎたため、タンパク質バンドが十分に染色されていなかった。アスタリスクで示されたレーンには、以前のゲルと同じ量の分子量マーカーが含まれていますが、染色の効率は劣ります。

アミドゲル中のco-massive brilliant blueでタンパク質を染色する方法を、毒性または可燃性の有機溶媒を使用せずに紹介しました。この手順を実行する際には、タンパク質の効率的な染色には洗浄ステップが重要であることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。