に有糸分裂研究のためのマイクロインジェクション技術キイロショウジョウバエ合胞体胚
2009年9月15日
このプロトコルは、マイクロインジェクションとで高解像度の画像の使用について説明キイロショウジョウバエシンシチウム胚。
この手順は、新鮮なブドウジュースプレートに胚を30〜60分集めることから始まります。湖のケージからプレートを取り出した後、湿らせたブラシで胚を拾い上げ、二重粘着テープの上に置きます。ピンセットの半分を使用して、コリオンが開くまで、片方の胚をテープ上でそっと転がします。
胚を拾い上げ、カバーにそっと置きます。ヘット接着剤の層を滑ります。十分な胚が得られるまでこれを繰り返します。
脱水後、胚は注射の準備ができています。こんにちは、カリフォルニア大学デービス校分子細胞生物学部のジョナサン・スカリー博士の研究室のイングリッド・ブルース・マッシャーです。今日は、ショウジョウバエ合胞体胚をマイクロインジェクションする手順をご紹介します。
この手順を使用して、有糸分裂におけるマイクロ tte と僧帽弁ベースのモーターの役割を研究します。例えば、特定の有糸分裂タンパク質の抗体やその他の阻害剤をマイクロインジェクションします。この阻害剤の有糸分裂に対する効果を解析することで、標的タンパク質の機能を決定することができます。
それでは始めましょう。実験の2〜3日前に準備を始めるには、ペットボトルの反対側に約1cm四方の小さな穴を2つ開けてレイケージを設置します。穴を綿片で埋め、空気が流れるようにします。
ハエをボトルに軽くたたき、グレープジュースプレートで覆います。酵母では、実験の少なくとも1日前にハエが最大10日間卵を産むため、レッグケージを室温に保ちます。注射用の針を引っ張り、摂氏4度に保ちます。
実験当日は、針を準備してロードします。まず、ラベル付きのチューブリンを冷凍庫から取り出し、氷の上に5〜15分間置きます。次に、GPEM緩衝液で希釈し、13, 000 RPMで摂氏4度で10〜15分間遠心分離します。
最後に、針に1〜2マイクロリットルをロードし、摂氏4度に保ちます。針の温度誘起重合を防止します。カバースリップをセットする前に、二重粘着テープを巻き込み、100ミリリットルのボトルに入れてヘプタン接着剤を作ります。
約50ミリリットルのヘプタンを加え、ボトルを密封して数日間揺らします。胚を準備する前に、注入前に胚を配置する脱水チャンバーを作成します。これを行うには、35ミリメートルの皿の一部を100ミリメートルのシャーレの中に入れて、テーブルに無水硫酸カルシウムであるドライヤーを追加します。右は、ドライヤーの高さがテーブルとカバーよりも高くならないようにします。
胚の準備を開始するには、まず、1時間ごとに酵母とブドウジュースプレートを交換して湖のケージから胚を収集し、胚は収集開始から約2時間後に画像化する必要があります。カバースリップを準備するには、顕微鏡の片側に置き、四隅をスライドさせてテープで留め、動かないようにします。綿の先端のアプリケーターを使用して、カバースリップにヘプタン接着剤を1層並べます。
接着剤は粘性であってはならず、数秒で乾くはずです。濃すぎる場合は、ヘプタンを追加してください。最後に、カバーの横のスライドに二重の粘着テープを貼ります。
湿らせたブラシで滑ります。グレープジュースプレートから胚を慎重に拾い上げ、スライド上の二重粘着テープの上に置きます。次に、ピンセットの半分を使用して、コリオンが壊れるまで胚を二重粘着テープの上で転がします。
胚をコーリアンの上でそっと転がしてピンセットにくっつくようにして胚を拾い上げ、カバーのヘプタン接着剤の上に置きます。胚の長辺をカバースリップの長辺と平行にして滑ります。10〜20個の胚を一列に置きます。
カバースリップを取り外し、脱水チャンバーに3〜8分間置きます。時間は、地域の湿度と注入する量によって異なります。次に、カバースリップを真空グリースで金属製のチャンバーに置きます。
最後に、胚をハロカーボンオイルで覆い、さらなる脱水症状を防ぎます。これで、胚を注入する準備が整いました。まず、16 x 対物レンズの下の胚を見つけます。
胚を遠ざけ、焦点面を動かさずに針を見つけます。針を中央に配置し、X方向またはY方向に動かさずに上に移動します。針を開くには、カバースリップの端を視野に入れますが、針が来る場所ではありません。
そして、針を同じ焦点面に下げます。カバースリップを針に当たってそっと開くまで、非常に慎重に動かします。針を上に動かします。
次に、胚を視界に入れます。針をオイルに下げ、針からきれいな液滴が得られることを確認します。胚を針にしっかりと移動させ、胚に一滴注入してから、胚を遠ざけます。
すべての胚が注入された後、60倍または100倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡で観察する準備が整います。対照胚は、この映画のように見えるはずです。GFPチューブリンとRFPヒストンを発現する胚を、スピニングディスク共焦点顕微鏡で100倍対物レンズでイメージングしたものです。
表示される合計時間は 8 分です。極間距離のプロットは非常に再現性が高く、コントロール胚の成功の信頼性の高い尺度です。これらは、サイクル 11 から 13 で示されているもののようになります。
この映画に写っているのは、別の対照胚です。これはKLP 61 FGFPを発現し、r Domineチューブリンを注入したものです。これも、回転する円盤の共焦点に100倍の対物レンズを使用して画像化され、合計時間は7分です。
この動画はマイクロインジェクションの直後に撮影したもので、動画の冒頭でr Domineチューブリンの濃度の勾配がはっきりと見えます。これらの胚は、Klp 61 F抗体のマイクロインジェクション後のKlp 61 Fの阻害を研究するために使用できます。スピンドルからのKlp 61 FGFPの損失を確認できます。
ショウジョウバエの切開胚をマイクロインジェクションする方法をお見せしました。この手順を行うときは、コントロールを実行することを覚えておくこと、最初にバッファーまたはルチンのみを注入する練習をすること、および有糸分裂が細胞内を正常に進行することを確認することが重要です。すべての注射が信頼でき、損傷を引き起こさなくなったら、阻害剤を注射して、その特定の阻害の効果を研究することができます。
というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
このプロトコルは、ショウジョウバエの合胞体胚におけるマイクロインジェクションと高解像度イメージングの使用を説明し、有糸分裂を研究します。この手順には、成功したイメージングと分析を確実にするために胚を慎重に扱うことが含まれます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 細胞生物学
背景
- ショウジョウバエは生物学研究で広く使用されるモデル生物です。
- 有糸分裂を理解することは、細胞分裂と発達に関する洞察を得るために重要です。
- 高解像度イメージング技術は細胞プロセスの観察を向上させます。
- マイクロインジェクションは実験目的のための胚の正確な操作を可能にします。
研究の目的
- ショウジョウバエの胚における有糸分裂のダイナミクスを調査すること。
- 詳細な細胞観察のために高度なイメージング技術を活用すること。
- 発生生物学の将来の研究のための信頼できるプロトコルを確立すること。
使用された方法
- グレープジュースプレート上での胚の収集。
- 実験的操作のための胚のマイクロインジェクション。
- 有糸分裂プロセスを観察するための高解像度イメージング。
- 準備中の損傷を防ぐための胚の慎重な取り扱い。
主な結果
- ショウジョウバエの胚における有糸分裂段階の成功した可視化。
- マイクロインジェクション技術の有効性の実証。
- 細胞分裂のタイミングと調整に関する洞察の提供。
- 胚発生に関する将来の研究のための枠組みの確立。
結論
- このプロトコルはショウジョウバエの胚における有糸分裂を研究するのに効果的です。
- 高解像度イメージングは細胞ダイナミクスの理解に不可欠です。
- この研究は発生生物学の広範な分野に貢献しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables functional interrogation of mitotic proteins in a rapid, synchronous in vivo system, supporting target validation through phenotypic readouts of protein inhibition. The syncytial Drosophila embryo provides a disease-relevant system for mechanistic de-risking of mitotic targets, allowing assessment of protein function prior to lead identification. Quantitative imaging of spindle dynamics offers predictive confidence in target essentiality and pathway involvement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation by visualizing loss-of-function phenotypes via protein-specific antibody microinjection.
- Operational Value: Supports biological de-risking through gradient-dependent phenotypic series resembling allelic mutants.
- Predictive Value: Facilitates target confidence assessment by correlating inhibition strength with mitotic defect severity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible mitotic readouts (pole-to-pole distance) for compound or inhibitor screening.
- Quantitative Output: Provides measurable, imaging-based endpoints enabling dose-response analysis of protein inhibition.
- Scalability: Allows parallel embryo preparation and imaging for medium-throughput functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Mitotic machinery conservation supports translational biomarker alignment with human cell division pathways.
- Preclinical Continuity: Enables mechanistic follow-up from genetic hits to functional validation in a living system.
- Risk-Adjusted Decisions: Helps prioritize targets based on phenotypic penetrance and specificity of inhibition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to validate mitotic targets before assay development and lead identification stages, leveraging in vivo functionality.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation via direct perturbation of mitotic proteins.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantifiable mitotic imaging readouts.
- Analytics: Delivers objective, imaging-based measurements (e.g., spindle length) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved mitotic mechanisms and protein function conservation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target validation across multiple mitotic regulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function through direct, reversible protein inhibition in vivo.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized embryo preparation and injection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization using phenotypic severity gradients.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, microinjection, and live confocal imaging.
- Dependent on microinjection apparatus, antifade oils, and high-resolution imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging and injection consistency.
- Adaptation considerations include protein solubility, antibody functionality, and fluorescent tag compatibility.
- Practical limitations include embryo viability post-injection and potential diffusion barriers in larger embryos.
