心臓全体のイメージング用蛍光光学投影トモグラフィのために生まれたの正規化
June 2nd, 2009
我々は、撮像された試料の吸収特性のためのアカウントが正確かつ定量的な蛍光トモグラフィー再構成を取得すること（BnOPT）光学投影トモグラフィのために生まれ、正規化手法を提案する。我々は、小動物の臓器内の蛍光分子プローブの分布を再構成するために提案されたアルゴリズムを使用してください。
正規化されたボーン光学プロジェクション断層撮影を行うために、サンプルは最初にオーガのシリンダーに固定され、埋め込まれます。次に、サンプルを垂直軸に沿って回転させ、励起波長で均一に照らし、透過率をC、CDに適した光学系で測定します。波長の蛍光シグナルは、透過照明モードで測定されます。
取得した蛍光画像と吸収画像を使用して、正規化されたボーン比を決定し、サンプル内のフルオロフォーの分布を再構築します。こんにちは、私の名前はクラウディア・ナオネで、ハーバード大学医学部のマサチューセッツ総合病院のシステム生物学センターで働いています。ミュンヘン工科大学およびアルセンターミュンヘンの生物医学イメージング研究所のダニエル・ラキです。
私はジゼル・ファイドです。私はここC-M-I-C-S-B、マサチューセッツ総合病院、ハーバード大学医学部のExperimental su Coのディレクターです。本日は、Bornの正規化されたアプローチによる光学投影断層撮影法を使用した、リアルタイムのex vivo全臓器イメージングの手順をご紹介します。
当研究室では、この手順を用いて、中空臓器における蛍光分子プローブの分布を研究しています。それでは始めましょう。このビデオでは、光学投影断層撮影を使用して準備した組織や臓器を画像化する手順と付属のビデオについて説明します。
このシステムを使用して、発育中のショウジョウバエのタイムラプスイメージングを行う方法について説明します。光学プロジェクショントモグラフィーの3次元イメージング技術には、光学系と回転ステージの独自の組み合わせが必要です。この部分では、イメージングの手順を解説します。
まず、主光源は照明測定と吸収測定の両方の光源として機能し、蛍光測定の蛍光励起を提供するために、主光源は最初に狭帯域通過干渉フィルターでフィルタリングされます。次に、光は固定および可変の減光フィルターのセットを通過します。これらは、自動シャッターの存在と組み合わせて、サンプル上の光の量を制御し、写真の漂白を防ぐために十分に低く保
ちます。ビームエキスパンダーとグラン望遠鏡レンズとディフューザーレンズの組み合わせにより、均一な試料照明を実現します。最後に、光学式狭帯域パス干渉フィルターを使用して、励起光源を光学的にクレンジングします。サンプルを透明化溶液に浸し、ガラス管内でイメージングするために所定の位置に保持します。
サンプルは、0.05度の絶対精度で高速回転ステージを介して垂直軸に沿って回転します。3つの異なる手動コントローラーにより、サンプルの垂直軸を直交面に傾けて調整することができます。吸収性信号は透過照明で取得され、CCDカメラで直接検出されます。
蛍光シグナルは、狭帯域パス干渉フィルターでフィルタリングされ、ロングパスフィルターと結合されてから、テレセントリックレンズで収集されます。望遠レンズには、理想的な独自の機能を提供するという利点があります。光学投影断層撮影用。
レンズアセンブリ内のレンズの焦点にある絞りの存在が重要です。これにより、画像が光軸と平行に移動することが保証されます。これにより、遠近法の歪みがなくなり、テレセントリック深度内の多くの焦点面で均等な倍率が得られます。
次のビデオセグメントでは、サンプルを準備するための手法について説明します。これに続いて、イメージングに使用される方法論が続きます。断層撮影用のサンプル組織または臓器の準備は、非対称的な収縮を回避するサンプルのエタノールベースの脱水に依存しています。
このプロセスは、完了するまでに何日もかかります。このビデオでは、マウスの心臓を調製していますが、プロトコルは任意の組織や臓器に適用できます。梗塞をコントロールした動物の心臓を用いた蛍光イメージング法を実演します。
言い換えれば、血液供給の喪失は、事前に明らかな組織壊死につながります。マウスには、治癒中のカテプシン活性を報告する6つの80不活性蛍光センサー以来、プロが注射されています。心筋は、ケタミンとキシラジンの腹腔内注射を使用して、マウスの灌流と心臓の押し出しのためにマウスを麻酔します次に、凝固を防ぐために50ユニットのヘパリン腹腔内注射を行います。
5分後、完全に麻酔をかけた動物に縦断開腹術を行い、血液を採取します。まず、左腎静脈を開きます。次に、20ミリリットルの生理食塩水を下大静脈にゆっくりと注入します。
生理食塩水は、解剖顕微鏡ですべての血液を洗い流した後、血液を置換します。胸部を開き、心臓を切除するために、標準的な操作方法を引き続き使用します。次に、4°Cの4%PFAで心臓を8時間固定します。
この時点から、組織に塗布された蛍光造影剤やタンパク質の漂白を避けるために、組織調製ステップは暗闇で実行する必要があります。固定が完了したら、PBSで15分間のすすぎでPFAを洗い流し、クリーンアップされた心臓を0.8%arosのプールに埋め込みます。アロスが乾いたら、アガロースを組織の周りで切り取り、ブロック状にします。
次に、最初に20%エタノールに浸し、次に徐々に高濃度のエタノール、最後に純粋なエタノールに浸すという5段階のシリーズを通じて、arosで暗号化された心臓を脱水します。この脱水手順は、サンプルの非対称収縮を回避するのに役立ちます。希釈エタノールでの最初の4回の浴は1時間、100%エタノールでの最後の浴は少なくとも10時間行わなければなりません。
エタノール処理が完了したら、サンプルが透明になるまでサンプルをマレーの透明な溶液に入れます(これは数時間から数日までさまざまです)。この清澄化溶液は細胞の水分を模倣し、インデックスは細胞膜と一致するため、組織は透明になります。最小限の微量なエタノールが清算プロセスの最後に存在し、清算溶液自体内のアルコールの熱運動により、再構成にいくつかのアーティファクトを生じさせる可能性があります。
この問題を回避するには、2 回目のクリア サイクルをお勧めします。これには 4 時間以上かかることはありません。完了すると、サンプルは光学投影の準備が整います。
コンピュータの助けを借りて断層撮影。光散乱がない場合の光吸収の再構成は、一般的なフィルタリングされたラドン後方投影アルゴリズムを使用して取得できます。このプロセスは、2次元X線コンピューター断層撮影に似ています。
エアロスのブロックを、クリアリング溶液で満たされた透明なイメージングチャンバーに入れます。次に、チャンバーをステージに取り付け、励起測定と透過測定の両方のために照合ビームでサンプルを照らします。励起ソースの選択は、選択した蛍光タンパク質または分子イメージング造影剤に基づいています。
サンプルの垂直軸をCCDのピクセル列に平行に位置合わせすると便利です。1度の角度増分を使用してサンプルを360度投影にわたって回転させ、吸収波長と蛍光波長の両方で透過照明の各角度で画像を取得します。集録を実行するソフトウェアは、一次光源のシャッターを自動的に制御して、連続照明を回避し、サンプル写真の漂白を減らします。
シャッターは、吸収データから3D再構成を作成するために長い積分時間が必要な場合に特に重要です。フィルタリングされたラドンバックプロジェクションアルゴリズムを使用するだけで、蛍光画像から3D再構成できます。その他の吸収寄与も考慮に入れる必要がありますが、これについては次のビデオセグメントで説明します。
吸収再構成に必要な手順を完了した後、蛍光再構成を完了するためのさらにいくつかの手順があります。光散乱がない場合の光学マップの再構成は、一般的なフィルタリングされたラドン後方投影アルゴリズムを使用して取得できます。このプロセスは、2次元X線コンピューター断層撮影に似ています。
蛍光分布を再構築する場合。空間依存性の吸収が変化すると、逆ラドンをバックに使用するのは間違っており、得られた蛍光タンパク質または蛍光分子プローブの分布とその定量能力に深刻な影響を与える蛍光像が投影されます。任意の光源位置Xsから放出される励起波長ラムダXの各光線は、画像化されたオブジェクトを通過するときに指数関数的に減衰します。
励起後、X位置にある蛍光色素、発光波長の放射は、Telericイメージングレンズシステムを使用してXD位置にあるCCDピクセルによってフィルタリングおよび収集されます。放出された蛍光は励起光線と同じ経路をたどるわけではありませんが、各ピクセルで記録される強度は、この特定の励起光線に対応する焦点ゾーン全体に沿って励起されたすべての蛍光色素の投影に近似しています。このシステムの高いテレセントリック性により、撮像された物体は360度回転し、CCDカメラで励起波長のUXと発光波長のUFLを複数の光源検出器で測定します。
次に、これらは、2 つの比率として定義される正規化された出生フィールド UB の下で結合されます。フルオロクロム分布の再構築は、励起と発光の両方のフォワードモデル、励起を記述するgreens関数を記述することで促進できます。光線伝搬は、単純なビールランバートの法則に従い、moo A は以前に決定された光吸収分布です。
光源から放出された位置 excess から放射され、検出器が XD の位置 C.C, D で測定した光強度 UX は、システムに依存する定数 B を持つグリーン関数の積として記述できます。次に、各光路に沿った励起光強度GXの正確な分布を計算できます。光源Xsから放出された光によって刺激される検出器XDで検出される蛍光強度UFLは、Xからxdへの光路に沿って励起されたすべてのテーロの寄与を考慮に入れています。
イメージング問題のフォワードモデルは、ub ub と記述でき、alpha にはシステムに依存する未知の定数が組み込まれます。次に、フォワードモデルを仮定したメッシュ上で離散化し、反転を実行して蛍光色素分布を抽出し、透過信号と蛍光シグナルの両方を取得し、従来のバックプロジェクションアルゴリズムを使用してサンプルを再構築します。ここでは、透過型と従来の蛍光光学投影断層撮影の再構成を示します。
心臓の単一の平面の再構築は、吸収と蛍光の両方で示されます。正常化された生まれつきの再建が提示され、心臓内の色素分布の違いを示しています。正規化後、光学投影断層撮影のセットアップ方法と、蛍光断層撮影の再構成における光吸収によるアーティファクトの除去方法を示しました。
散乱光の寄与を取り除くためには、サンプルの透明化を念頭に置くことが非常に重要ですが、同時に、蛍光の寄与をできるだけ多く保つために、透明化プロセスのバランスをとることも重要です。このアプローチを使用する際に覚えておくべきもう1つの非常に重要なことは、蛍光画像を吸収画像で割ることによって得られる骨正規化比を計算することです。というわけで、これだけです。
視覚化された実験に参加していただき、ありがとうございます。
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概要
この研究では、サンプルの吸収特性を考慮することで蛍光断層再構成の精度を向上させるボルン正規化アプローチを光学投影断層撮影（BnOPT）に導入します。この方法は小動物の臓器における蛍光分子プローブの分布を再構成するために適用されます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 光学イメージング
- 蛍光断層撮影
- 生物医学イメージング
背景
- 光学投影断層撮影は生物サンプルのイメージングに使用される技術です。
- 従来の方法は吸収特性を考慮していないため、不正確になる可能性があります。
- 蛍光分子プローブは生物学的プロセスを視覚化するのに不可欠です。
- 再構成方法を改善することで、臓器機能の理解を深めることができます。
研究の目的
- 蛍光分布を正確に再構成する手法を開発する。
- 生物サンプルの吸収特性を考慮する。
- 小動物の臓器のイメージングの信頼性を向上させる。
使用された方法
- サンプルは固定され、オーガーの円筒形に埋め込まれます。
- サンプルは回転され、励起波長で照明されます。
- 透過モードで蛍光信号が測定されます。
- 再構成を助けるために正規化されたボルン比が計算されます。
主要な結果
- 提案されたBnOPT手法は正確な蛍光再構成を提供します。
- サンプルの吸収特性を効果的に考慮します。
- この方法は小動物の臓器におけるプローブ分布を成功裏に視覚化します。
- 結果は従来の方法と比較してイメージングの品質が向上したことを示しています。
結論
- BnOPTアプローチは蛍光断層撮影の精度を向上させます。
- in vivoで生物サンプルを研究するための信頼できる方法を提供します。
- この技術は生物医学イメージングと臓器機能解析の研究を進歩させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate fluorescence quantification in whole-organ imaging is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The Born normalized Optical Projection Tomography (BnOPT) method addresses absorption-induced artifacts that compromise fluorescence signal interpretation, thereby improving predictive confidence in probe distribution analysis. This capability supports reliable assessment of therapeutic target engagement and pathway modulation in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing artifact-free fluorescence distributions of molecular probes in intact organs.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative imaging of probe activity in pathophysiological contexts such as infarction models.
- Predictive Value: Enhances confidence in target modulation readouts by correcting for spatially varying absorption that otherwise distorts quantification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares cleared, stable biological samples suitable for longitudinal imaging studies requiring reproducible fluorescence readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via ethanol dehydration and Murray’s clearing, minimizing asymmetric shrinkage and signal variability.
- Assay Readiness: Generates quantitative absorption and fluorescence datasets enabling normalized ratio calculations essential for reliable signal interpretation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining fluorescence signal integrity during extended clearing and imaging sessions.
- Mechanistic De-risking: Reduces false conclusions about probe distribution by accounting for absorption effects that mimic or mask true biological signals.
- Disease Model Fidelity: Applied to infarcted mouse hearts to visualize protease activity probes, supporting target-specific mechanism evaluation in relevant pathophysiology.
Pipeline & Workflow Integration
The BnOPT method integrates into early discovery workflows following target engagement screening, providing quantitative 3D fluorescence maps that inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling longitudinal tracking of fluorescent probe distribution in intact organs without signal degradation from absorption artifacts.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared tissue samples with standardized preparation protocols ensuring reproducibility across experimental batches.
- Analytics: Outputs normalized born ratios (fluorescence/absorption) that isolate true fluorescence signals from absorption confounders, enabling accurate inter-group comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical studies by preserving fluorescence signal in cleared samples over time, allowing correlation of probe activity with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for whole-organ fluorescence quantification applicable across multiple therapeutic areas and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by eliminating absorption-mediated quantification errors in fluorescence tomography.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized clearing (Murray’s solution) and dehydration protocols that minimize sample variability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision reliability by providing accurate spatial readouts of molecular probe activity in disease-relevant organs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by reducing false-positive or false-negative conclusions from uncorrected imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, sample clearing, and fluorescence quantification to avoid artifacts from residual ethanol or incomplete clearing.
- Dependent on telecentric optical systems, rotation stages with 0.05° accuracy, and synchronized excitation/emission filtering for signal fidelity.
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration and ethanol gradients to ensure consistent refractive index matching and fluorescence preservation.
- Adaptation to diverse organ sizes and densities may require adjustments in clearing time and illumination intensity to prevent signal loss or bleaching.
- Practical limitation: prolonged clearing beyond optimal duration risks fluorescence degradation, necessitating timed clearing cycles as described in the protocol.
