心臓全体のイメージング用蛍光光学投影トモグラフィのために生まれたの正規化

正規化ボーン光学的投影トモグラフィー（normalized born optical projection tomography）を行うため、まずサンプルを固定し、アガールのシリンダーに包埋します。次に、サンプルを垂直軸に沿って回転させ、励起波長で均一に照射し、C、CDに適した光学系を用いて透過光を測定します。透過照明モードにて、特定の波長における蛍光信号を測定します。

得られた蛍光画像および吸収画像を用いて、正規化されたボルン比を決定し、試料内における蛍光色素の分布を再構築します。こんにちは、私はClaudia Naoneです。マサチューセッツ総合病院、ハーバード医学大学のシステム生物学センターで研究しています。私はDanielle Rakiです。ミュンヘン工科大学およびAIセンター・ミュンヘンの生物医学イメージング研究所に所属しています。

私はGiselle Fidoです。マサチューセッツ総合病院、ハーバード大学医学部C-M-I-C-S-Bにて、Experimental su Coのディレクターを務めています。本日は、光学投影トモグラフィーのためのBorn正規化アプローチを用いた、リアルタイムex vivo全臓器イメージングの手順をご紹介します。

当研究室では、中空臓器における蛍光分子プローブの分布を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。このビデオでは、光学投影トモグラフィーを用いて準備した組織や臓器をイメージングする手順について、付随するビデオと共に解説します。

本システムを用いて、発生過程にあるショウジョウバエのタイムラプスイメージングを行う方法を解説します。光学投影断層撮影（OPT）による三次元イメージング技術には、光学系と回転ステージの独自の組み合わせが必要です。本ビデオのこのセグメントでは、そのイメージング手順について詳しく説明します。

まず、主光源は照明および吸収測定の両方の光源として機能し、蛍光測定のための蛍光励起光を提供するために、主光源はまず狭帯域パス干渉フィルターでフィルタリングされます。次に、光は一連の固定および可変の中性密度フィルターを通過します。これらは自動シャッターと組み合わされており、サンプルへの光量を制御し、光退色を防ぐために十分に低く保つ役割を果たします。

ビームエキスパンダーと、ディフューザーレンズを組み合わせたグラン望遠鏡レンズを用いることで、試料への均一な照明を実現しています。最終的に、励起光源の光を光学的に精製するために、光学狭帯域パス干渉フィルターを使用します。試料は透明化溶液に浸し、ガラス管に入れてイメージング時に固定します。

サンプルは、絶対精度0.05度の高速回転ステージによって垂直軸を中心に回転させられます。3つの独立した手動コントローラーにより、サンプルの垂直軸を直交平面内で傾斜および調整することが可能です。吸収信号は透過照明下で取得され、CCDカメラによって直接検出されます。

蛍光信号は、狭帯域パス干渉フィルターを通過し、ロングパスフィルターと組み合わされた後、テレセントリックレンズで集光されます。テレセントリックレンズは、光学投影トモグラフィーにとって理想的な独自の特性を備えているという利点があります。

レンズの焦点位置に、レンズアセンブリ内の絞りが配置されていることが重要です。これにより、像が光軸に対して平行に伝搬することが保証されます。その結果、パースペクティブ歪みが排除され、テレセントリック深度内の多くの焦点面において均一な倍率が得られます。

次のビデオセグメントでは、試料調製の手法について説明します。続いて、イメージングに使用される手法について解説します。トモグラフィーイメージングのための組織または器官の試料調製では、非対称な収縮を防ぐため、エタノールを用いた試料の脱水処理を行います。

このプロセスを完了するには数日かかります。本ビデオではマウスの心臓を調製しますが、このプロトコルはあらゆる組織や臓器に適用可能です。ここでは、制御された心筋梗塞を起こさせた動物の心臓を用い、蛍光イメージング法を実演します。

言い換えれば、血流の喪失により、あらかじめ明らかな組織壊死が引き起こされた状態です。マウスには、治癒過程におけるカテプシン活性を報告するpro since six 80不活性蛍光センサーが注入されています。ケタミンとキシラジンを腹腔内注射してマウスを麻酔し、灌流および心臓の摘出を行います。次に、凝固を防ぐためにヘパリン50 unitsを腹腔内注射します。

5分後、十分に麻酔をかけた動物に縦方向の開腹術を行い、血液を除去します。まず、左腎静脈を開きます。次に、下大静脈に20 millilitersの生理食塩水をゆっくりと注入します。

解剖顕微鏡下ですべての血液を洗い流した後、生理食塩水で血液を置換します。引き続き標準的な操作方法に従って胸腔を開き、心臓を取り出します。次に、心臓を4%PFAを用い、4°Cで8時間固定します。

ここからの組織作製ステップは、組織に適用した蛍光造影剤やタンパク質の退色を防ぐため、暗所で行う必要があります。固定が完了したら、PBSで15分間洗浄してPFAを洗い流し、洗浄した心臓を0.8% arosのプールに埋め込みます。arosが乾燥した後、組織の周囲のアガロースを切り取り、ブロック状に整えます。

次に、まず20%Ethanolに浸し、その後段階的にエタノール濃度を上げ、最終的に純エタノールに浸すという5段階の工程で、 encrypted heartを脱水します。この脱水手順により、サンプルの非対称的な収縮を防ぐことができます。希釈エタノールの最初の4回の浸漬はそれぞれ1時間行い、最後の100%Ethanolへの浸漬は少なくとも10時間行ってください。

エタノール処理が完了したら、サンプルが透明になるまでMurray's clear solutionに浸します。透明になるまでの時間は、数時間から数日まで異なります。この透明化溶液は細胞内の水分を模倣し、細胞膜の屈折率を合わせることで、組織を透明にします。透明化プロセスの終了時に極微量のエタノールが残っている場合がありますが、これは透明化溶液中のアルコールの熱運動により、再構成画像にいくつかのアーティファクトを引き起こす原因となります。

この問題を避けるため、2回目の透明化サイクルの実施を推奨します。この工程に要する時間は4時間を超えません。完了後、サンプルは光学投影が可能な状態になります。

コンピュータを用いたトモグラフィーについて。光散乱がない条件下での光吸収の再構成は、一般的なフィルタ補正逆投影法（Filtered Back Projection algorithm）を用いて得ることができます。このプロセスは、2次元X線コンピュータ断層撮影（CT）と同様の原理に基づいています。

透明なイメージングチャンバーに透明化溶液を満たし、そこにエアロゾルのブロックを配置します。次に、チャンバーをステージに固定し、励起および透過の両方の測定のために、コリメート光でサンプルを照射します。励起光源の選択は、使用する蛍光タンパク質または分子イメージング造影剤に基づいて決定します。

サンプルの垂直軸をCCDのピクセル列と平行に合わせると便利です。1度ずつの角度増分で360回の投影にわたりサンプルを回転させ、各角度で吸収波長と蛍光波長の両方の透過照明下で画像を取得します。取得を実行するソフトウェアが一次光源のシャッターを自動的に制御し、連続照射を避けてサンプルの光退色を低減させます。

吸収データから3D再構成を行うために長い積分時間が必要な場合、シャッターが特に重要となります。蛍光画像からの3D再構成には、単純にフィルタ補正逆ラドン変換アルゴリズムを使用してください。その他の吸収による寄与を考慮する必要がありますが、これについては次のビデオセグメントで説明します。

吸収再構成に必要な手順を完了した後、蛍光再構成を完了させるためにさらにいくつかのステップが必要です。光散乱がない状態での光学マップの再構成は、一般的なフィルタ付きラドン逆投影アルゴリズムを用いて得ることができます。このプロセスは、二次元X線コンピュータ断層撮影（CT）と同様です。

蛍光分布を再構成する場合、空間的に依存して変化する吸収があるため、逆ラドン変換を用いて蛍光画像を逆投影すると不正確となり、得られる蛍光タンパク質や蛍光分子プローブの分布およびその定量能に深刻な影響を及ぼします。任意の光源位置 Xs から放出される励起波長 Lambda X の各光線は、イメージング対象物を通過する際に指数関数的に減衰します。

位置Xにある蛍光色素を励起した後、放出波長の放射光がフィルタリングされ、Telericイメージングレンズシステムを用いて位置XDにあるCCD画素によって収集されます。放出された蛍光は励起光と同じ経路を通りませんが、各画素で記録される強度は、この特定の励起光に対応する焦点領域全体で励起されたすべての蛍光色素の投影近似値となります。システムの高いテレセントリック性により、イメージング対象物を360度回転させ、励起波長でのUXおよび放出波長でのUFLという複数の光源検出器測定値をCCDカメラで取得します。

これらは、2つの比として定義される正規化されたボルン場UBの下で結合されます。蛍光色素分布の再構成は、励起光と放出光の両方の伝播に関する順モデルを記述することで促進され、グリーン関数が励起を記述します。光線の伝播は、事前に決定された光学吸収分布であるmoo Aを用いた単純なビール・ランベルトの法則に従います。

光源位置 Xs から放出され、C.C. D 上の検出器位置 Xd で測定される光強度 UX は、グリーン関数とシステムに依存する定数 B の積として記述できます。これにより、各光路に沿った励起光強度 GX の正確な分布を計算することが可能です。光源 Xs から放出された光によって刺激され、検出器 Xd で検出される蛍光強度 UFL は、X から Xd までの光路沿いで励起されたすべての蛍光体の寄与を考慮したものになります。

本イメージング問題のフォワードモデルはub ubと記述でき、ここでalphaはシステムに依存する未知の定数を含んでいます。次に、このフォワードモデルを想定されるメッシュ上で離散化し、反転処理を行うことでフルオロクロム分布を抽出します。透過信号と蛍光信号の両方を取り込み、従来の逆投影アルゴリズムを用いてサンプルを再構成します。ここでは、透過および従来の蛍光光学的投影トモグラフィーによる再構成結果を示します。

心臓の単一断面の再構成を、吸収像と蛍光像の両方で示します。正規化されたボルン再構成を提示しており、心臓内における染料分布の違いが示されています。正規化後、光学投影トモグラフィーのセットアップ方法と、蛍光トモグラフィーの再構成における光学吸収に起因するアーチファクトの除去方法について説明しました。

散乱光の影響を取り除くためにサンプルを透明化することは非常に重要ですが、同時に、蛍光成分を可能な限り維持できるよう、透明化のプロセスを適切に調整することも重要です。また、この手法を用いる際に非常に重要な点は、蛍光像を吸収像で割ることで得られる、骨正規化比を算出することです。以上です。

本視覚化実験をご視聴いただきありがとうございました。皆様のご自身の実験の成功をお祈りいたします。