マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

マルチコンパートメントマイクロ流体ニューロン共培養デバイスの作製は、フライス盤でPMMAブロック上のリザーバーを定義することから始まり、その後、コンパートメントを接続するマイクロチャネルアレイのホットエンボス加工が行われます。A-P-M-M-A型が準備されたら、A-P-D-M-S型マスターはPMMA型から複製され、トリクロロエチレンでコーティングされます。最終的なデバイスは、PDMSモールドマスターから複製され、PDLコーティングされた培養プレートに組み立てられます。

次いで、一次E 16〜18ラットニューロンを体細胞コンパートメントにロードし、2週間培養した後、共培養のために軸索gglコンパートメント内の軸索層の上にP 1〜2ラットオリゴデンドロサイト細胞を添加する。こんにちは、テキサス大学およびm大学の電気およびコンピューター工学部のナノバイオシステム研究所のJパーです。本日は、マルチコンパートメントマイクロ流体ニューロン共培養プラットフォームを作製する手順をご紹介します。

私たちの研究室では、この手順を使用して、中枢神経系ニューロングリア相互作用をin vitroで研究しています。それでは始めましょう。この手順を開始するには、マイクロフライス盤を使用して3.5ミリメートルの深さのコンパートメントを作成します。

A-P-M-M-Aブロックで、1つの体細胞コンパートメントと6つの軸索gglコンパートメントを定義します。コンパートメントを準備した後、破片を除去するために10分間超音波処理し、イソプロパノールを洗浄し、従来のフォトリソグラフィーを使用してスライドガラス上にマイクロリッジ構造を作成し、ウェットエッチングプロセスでガラスからマイクロリッジパターンをホットエンボスします。最初にPMMAマスターにスライドさせ、PMMAモールドマスターとガラス基板を手動で位置合わせします。

次に、ホットプレスで温度を摂氏115度に上げます。そして、温度に達したら、0.5トンの重りを5分間加えます。5分後、摂氏40度まで冷まし、圧力を解放します。

次に、PDMS マスターの準備を開始します。PDMSプレポリマーとその硬化剤を10:1重量の比率で混合し、PMMAマスターを50ミリメートル×50ミリメートルのサイズのブロックに切断します。ベンドソーを使用してキャスクの中に入れ、PDMS混合物をPMMAマスターの上に注ぎ、キャスクを真空ポンプとDGAに接続された乾燥剤に15分間置きます。

PDMSの混合プロセス中に発生する気泡を除去するため。すべての気泡を取り除いたら、キャスクを水平にした摂氏85度のオーブンに1時間入れて重合します。PDMSが完全に硬化したので、PDMSマスターをPMMAマスターベーパーコートから剥がし、PDMSマスターを2〜3滴のトリクロロエチレンを含む乾燥剤の中に入れて、15分間真空を適用します。

PDMSマスターのコーティングは、PDMSマスター型からの最終的なPDMSニューロン共培養デバイスの放出を容易にする コーティング後、PDMSマスターをイソプロピルアルコールで短時間すすぎ、過剰なトリクロロエチレンを除去し、窒素ガスニューロン共培養デバイスで乾燥させたPDMSポリマーからの製造は、前のセクションで説明したPDMSマスター型を調製するのと同様である。まず、PDMSプレポリマーと隠蔽剤を10重量対1の比率で混合し、PDMSマスターの上にPDMS混合物を注ぎます。マスター上の高さ3.5mmのPDMS構造が完全に浸らないように、PDMSを注ぎすぎないことが重要です。

真空ポンプに接続された乾燥剤内のDGAを15分間。すべての気泡が除去されたら、PDMSを水平にした摂氏85度のオーブンに1時間入れて1時間後に重合し、PDMSをオーブンから取り出し、室温で冷まします。次に、PDMSマスターからPDMSニューロン培養デバイスをそっと剥がします。

PDMSデバイスをパラフォームで包み、ほこりや破片から保護します。パラフォームで包まれたPDMSをブレード付きのドリルプレスで一枚一枚に切断し、細胞培養プレートにほぼ使用できる状態です。ニューロン共培養PDMSデバイスを細胞培養プレートに入れる前に、デバイスをプラズマクリーナーの中に入れ、空気プラズマに90秒間さらして表面を親水性にします。

この処理により、ポリデリシンコーティングプレートに組み立てた後、マイクロチャネルに培地を充填することが容易になります。プラズマ処理した装置を滅菌するためには、70%エタノールに30分間浸漬し、容器を滅菌バイオフードに移します。30分後、デバイスを取り出し、0.2ミクロンのミリポアフィルターでろ過した窒素ガスで乾燥させます。

次に、乾燥したデバイスをポリDリジンコーティングポリスチレン6ウェル培養プレートの上に置き、穏やかな圧力を加えて、培養プレートの表面とデバイスの氷との間にしっかりと密閉されるようにします。次に、ソーマコンパートメントを培養液で満たします。1〜2分待って、マイクロチャネル内に気泡が閉じ込められていないことを確認します。

次に、6つの軸索グリアコンパートメントを埋めます。最後に、培養培地を充填したデバイスを摂氏37度のインキュベーターで一晩インキュベートし、可能性のある破片や有毒な残留物を取り除きます。一晩のインキュベーション後、培養を開始して、デバイスへの細胞ローディングの準備をすることができます。

ピペットを使用して、SomaおよびAxonコンパートメントから培地を吸引します。次に、胚の16日目から18匹のラットから40マイクロリットルの初代前脳ニューロン細胞を、マイクロチャネル入口の周りの体細胞コンパートメントに、1平方ミリメートルあたり500細胞の空中密度でロードします。細胞をロードしている間は、PDMSデバイスに触れないことが重要です。これは、デバイスと細胞培養プレートの間のシールを破る可能性があるためです。

これらの顕微鏡画像は、カルシウムAMが染色されたニューロン細胞を示しています。体細胞コンパートメントの内部では、細胞はコンパートメント内に均一にロードされ、マイクロ流体チャネルの近くに配置されています。細胞を充填したデバイスを摂氏37度のインキュベーターで30分間インキュベートし、基質への細胞接着を促進します。

このインキュベーションの後、すべてのコンパートメントを培地で満たします。加湿された5%CO2インキュベーターでデバイス内で増殖する細胞を摂氏37度に維持し、3〜4日ごとに培養培地の半分だけを交換します。密集した軸索ネットワークは、軸索グリアコンパートメントの内側に形成されるべきです。

培養の14日後、培養の2週間後、初代ニューロンin vitro CLIA細胞をロードする前に細胞を添加し、コンパートメントから培養培地の約60%を吸引します。オリゴデンドロサイトは、出生後にSprague Dollyラットの大脳半球から解剖されました。1日目から2日目にかけて、5マイクロリットルのオリゴデンドロサイト細胞を各軸索グリアコンパートメントに1平方あたり1000細胞の空中密度で追加します。オリゴデンドロサイトの添加後に基質上に形成された軸索ネットワークを損傷する可能性があるため、ロード中にピペットを使用して底部基質に触れないようにミリメートルの注意を払う必要があります。なぜなら、細胞を摂氏37度で1時間インキュベートし、次いでコンパートメントを埋める。

培養培地では、CLIAの追加前と同様にニューロンの培養を続け、哺乳類の中枢神経系を研究しながら、さらに2週間、3〜4日ごとに培養培地の半分しか交換しません。実験が適切に行われた場合の軸索グリアの相互作用。体細胞コンパートメントにロードされたニューロン細胞は、マイクロチャネル入口の近くに位置し、軸索Gglコンパートメント内に軸索層が形成され始めます。

培養の1週間後、体細胞コンパートメント内のニューロン細胞凝集の兆候は、オリゴデンドロサイトをロードするときに細胞が健康でないことを示している可能性があります。ニューロン培養の2週間後、軸索gglコンパートメントは軸索の密な層で覆われ、オリゴデンドロサイトは軸索層の上にロードされるべきです。今回は、マルチコンパートメントニューロコ培養プラットフォームの製造方法と、それを使用してin vitroでCNSニューログリア相互作用を研究する方法を紹介しました。

この手順を実行するときは、デバイスをほこりから遠ざけ、接着を劣化させることができないため、エタノールで長時間滅菌しないようにすることが重要です。それです。ご覧いただき、