マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

マルチコンパートメント・マイクロ流体ニューロン共培養デバイスの作製は、まずフライス盤を用いてPMMAブロック上にリザーバーを定義することから始まり、続いてコンパートメント間を接続するマイクロチャネルアレイをホットエンボス成形で形成します。PMMA金型が準備できたら、そのPMMA金型からPDMS金型マスターを複製し、トリクロロエチレンでコーティングします。最終的なデバイスは、このPDMS金型マスターから複製し、PDLコーティングされた培養プレート上に組み立てます。

その後、胎生16〜18日のラット一次ニューロンを細胞体コンパートメントに播種し、2週間培養します。その後、共培養のために、軸索gglコンパートメント内の軸索層の上に、生後1〜2日のラットオリゴデンドロサイト細胞を添加します。こんにちは。テキサスA&M大学電気コンピュータ工学科、ナノバイオシステム研究室のJ Parです。本日は、マルチコンパートメント・マイクロ流体ニューロン共培養プラットフォームの作製手順をご紹介します。

当研究室では、中枢神経系のニューロンとグリア細胞の相互作用をin vitroで研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、マイクロフライス盤を使用して、深さ3.5 millimeterのコンパートメントを作成します。

A-P-M-M-Aブロックにおいて、1つの細胞体コンパートメントと6つの軸索gglコンパートメントを定義します。コンパートメントの準備後、イソプロパノールを用いて10分間超音波洗浄し、ゴミを除去します。従来のフォトリソグラフィおよびウェットエッチングプロセスを用いてガラススライド上にマイクロリッジ構造を作製し、ガラスからマイクロリッジパターンをホットエンボスします。まずPMMAマスターにスライドさせ、PMMAモールドマスターとガラス基板を手動で位置合わせします。

次に、ホットプレスを用いて温度を115 °Cまで上げます。設定温度に達したら、0.5 tonの荷重を5分間加えます。5分後、40 °Cまで冷却し、圧力を解除します。

次に、PDMSマスターの作製を開始します。PDMSプリポリマーと硬化剤を重量比10:1で混合し、PMMAマスターを50 mm × 50 mmのサイズのブロックに切断します。バンドソーを用いて、それを容器に入れ、PMMAマスターの上にPDMS混合液を注ぎます。その後、容器を真空ポンプおよび脱気装置（DGA）に接続したデシケーター内に15分間置きます。

PDMSの混合過程で発生した気泡を除去します。すべての気泡が除去されたら、容器を水平な85 °Cのオーブンに入れ、1時間かけて重合させます。PDMSが完全に硬化した後、PMMAマスターからPDMSマスターを剥がします。次に、トリクロロエチレンを2〜3滴入れたデシケーターにPDMSマスターを配置し、15分間真空をかけてPDMSマスターを蒸着処理します。

PDMSマスターをコーティングすることで、最終的なPDMSニューロン共培養デバイスをPDMSマスターモールドから剥離させやすくなります。コーティング後、過剰なトリクロロエチレンを除去するためにPDMSマスターをイソプロピルアルコールで短時間すすぎ、窒素ガスで乾燥させます。PDMSポリマーからのニューロン共培養デバイスの作製は、前節で述べたPDMSマスターモールドの準備と同様です。まず、PDMSプレポリマーと硬化剤を重量比10:1で混合し、次にPDMS混合液をPDMSマスターの上に注ぎます。マスター上の高さ3.5 mmのPDMS構造が完全に浸からないよう、PDMSを注ぎすぎないことが重要です。

真空ポンプに接続したデシケーター内でDGAsを15分間脱気します。気泡がすべてなくなった後、水平に設置した85 °CのオーブンにPDMSを1時間入れ、重合させます。1時間後、PDMSをオーブンから取り出し、室温で冷却させます。その後、PDMSマスターからPDMSニューロン培養デバイスをゆっくりと剥がします。

PDMSデバイスをパラフィルムで包み、ほこりやゴミから保護します。次に、刃を取り付けたボール盤を用いて、パラフィルムで包まれたPDMSを個別のピースに切り分けます。これで、ニューロン共培養用PDMSデバイスを細胞培養プレートで使用する準備がほぼ整いました。ニューロン共培養用PDMSデバイスを細胞培養プレートに配置する前に、デバイスをプラズマクリーナーに入れ、90秒間エアプラズマに曝露して表面を親水化させます。

この処理により、ポリリジンでコーティングされたプレートにアセンブリした後、マイクロチャネルへの培地の充填が容易になります。プラズマ処理したデバイスを滅菌するために、70% ethanolに30分間浸し、容器を滅菌バイオフード内に移動させます。30分後、デバイスを取り出し、0.2 micronのミリポアフィルターでろ過した窒素ガスで乾燥させます。

次に、乾燥させたデバイスをポリDリシンコート済みのポリスチレン製6ウェル培養プレートの上に配置し、培養プレートの表面とデバイスの氷との間に隙間がないよう、軽く圧力をかけます。次に、somaコンパートメントに培養液を満たします。マイクロチャネル内に気泡が残っていないことを確認するため、1〜2分間待ちます。

次に、6つの軸索グリアコンパートメントを満たします。最後に、デバイスに培地を満たし、37 °Cのインキュベーターで一晩インキュベートして、可能性のあるデブリや毒性残留物を除去します。一晩のインキュベーション後、デバイスへの細胞播種に向けた培養を開始できます。

ピペットを使用して、Soma（細胞体）およびAxon（軸索）コンパートメントから培地を吸引します。次に、胎生16日から18日のラット由来の前脳一次ニューロン細胞を、500 cells/mm²の密度で、マイクロチャネル入口付近のSomaコンパートメントに40 µL分ロードします。細胞をロードする際にPDMSデバイスに触れないようにすることが重要です。デバイスと細胞培養プレートの間のシールが破損する可能性があるためです。

これらの顕微鏡画像は、カルシウム試薬で染色されたニューロン細胞を示しています。細胞体コンパートメント内では、細胞が均一にロードされ、マイクロ流路に近接して配置されています。基材への細胞接着性を高めるため、細胞をロードしたデバイスを37 °Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。

このインキュベーション後、すべてのコンパートメントに培養液を満たします。デバイス内で細胞を37 °C、5% CO2の加湿インキュベーターで培養し、3〜4日ごとに培養液の半分のみを交換してください。Axon gliaコンパートメント内に、高密度の軸索ネットワークが形成されるはずです。

14日間の培養後、in vitro一次ニューロンにCLIA細胞を添加します。細胞を播種する前に、コンパートメントから培養液の約60%を吸引除去します。オリゴデンドロサイトは、生後1〜2日のSprague-Dawleyラットの大脳半球から分離したものです。各軸索・グリアコンパートメントに、播種密度1000 cells/mm²でオリゴデンドロサイト細胞を5 µLずつ添加します。播種時にピペットで底面の基質に触れないよう注意してください。基質上に形成された軸索ネットワークを損傷させる可能性があるためです。オリゴデンドロサイトの添加後、細胞を37 °Cで1時間インキュベートし、その後コンパートメントを充填します。

培養培地を用いて、CLIA添加前と同様にニューロンの培養を継続します。哺乳類の中枢神経系における軸索とグリアの相互作用を研究する際は、その後2週間、3〜4日ごとに培養培地の半分のみを交換してください。実験が適切に実施されていれば、ソマコンパートメントにロードされたニューロン細胞はマイクロチャンネル入口の近くに配置され、軸索Gglコンパートメント内に軸索層が形成され始めます。

1週間の培養後、ソマコンパートメント内で神経細胞の凝集が見られる場合は、オリゴデンドロサイトを導入する際に細胞の状態が良好ではないことを示している可能性があります。2週間の神経細胞培養後には、軸索コンパートメントが軸索の密な層で覆われている必要があり、その軸索層の上にオリゴデンドロサイトを導入します。以上で、マルチコンパートメント神経共培養プラットフォームの作製方法と、それを用いてCNS（中枢神経系）の神経細胞-グリア相互作用をin vitroで研究する方法について説明しました。

本手順を行う際は、デバイスをほこりから保護すること、およびエタノールでの滅菌時間を長くしすぎないことが重要です。滅菌時間が長すぎると、接合面に劣化が生じる可能性があるためです。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。