Name: 酵母細胞からミトコンドリアの精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶ Saccharomyces cerevisiaeからミトコンドリアを精製する方法。細胞壁消化、ホモジナイズ、遠心分離、蔗糖密度勾配遠心により高純度ミトコンドリアを分離します。構造と機能の保全性を保ちながら迅速に精製可能です。

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この作品は、CIHRとカナダのNSERCからの補助金によって支えられている。 VITはCIHR新調査官とゲノミクスのコンコルディア大学のリサーチチェア、細胞生物学と高齢化です。

材料および方法酵母菌株及び成長条件野生型株BY4742（MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0が ）豊富なYEPD培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース）で増殖させた。細胞を30℃で回転が5:1の&quot;フラスコの体積/培地体積&quot;比での三角フラスコで200 rpmで振盪しながら培養した。 原油ミトコンドリア分画の単離<ol><li> 48時間野生型株BY4742培養液1 Lに成長する</li><li> 500mlのNalgeneの遠心管に文化を注ぐ。室温で3000 × gで5分間の遠心分離により、負荷や収穫の細胞のバランスをとる。 </li><li> dH2Oの250mlの上清をデカントし、ペレット化した細胞懸濁する。室温で3000 × gで5分間の遠心分離により細胞をペレット化する。 </li><li> dH2Oの250mlの上清をデカントし、ペレット化した細胞懸濁する。室温で3000 × gで5分間の遠心分離により細胞をペレット化する。 </li><li>細胞ペレットの湿重量を決定します。 </li><li> DTTバッファーでペレット化した細胞を再懸[バッファー/ g（湿重量）の細胞を2ml]。 </li><li> 50 mlのファルコンのプラスチックチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> 30℃で20分間シェーカーで70 rpmでチューブを回転させる</li><li>室温で3000 × gで5分間の遠心分離により細胞を回収。 </li><li>ザイモリアーゼ[バッファ/ g（湿重量）の細胞7mlの] なしザイモリアーゼバッファーでペレット化した細胞を再懸濁します。 </li><li>室温で3000 × gで5分間の遠心分離により細胞をペレット化する。 </li><li>ザイモリアーゼ[バッファ/ g（湿重量）の細胞7mlの] なしザイモリアーゼバッファーでペレット化した細胞を再懸濁します。 </li><li>ガラス製フラスコに細胞懸濁液を移す。 </li><li>ザイモリアーゼ- 100T [ザイモリアーゼ- 100T / g（湿重量）の細胞を1mg]細胞懸濁液への粉体を​​追加。 </li><li> 30℃で30分間シェーカーで70 rpmで細胞懸濁液でフラスコを回転させる</li><li>転送フェロプラストは、ザイモリアーゼ- 100T〜50 mlのプラスチック遠心管で細胞壁の消化のために結成。 </li><li> 4℃で2200 × gで8分間℃での遠心分離によりペレットのスフェロプラスト</li></ol> **すべての後続のステップは4℃または氷上で行ってください。スフェロプラストの懸濁液を穏やかに細胞小器官を破ることを避けるため、カットのヒントをピペットを用いて処理する必要があります** <ol start="18"><li>氷冷均質化緩衝液[バッファ/ g（湿重量）の細胞の6.5 ML]でペレットスフェロプラストを再懸濁します。 </li><li> 4℃で2200 × gで8分間℃での遠心分離によりペレットのスフェロプラスト</li><li>氷冷均質化緩衝液[バッファ/ g（湿重量）の細胞の6.5 ML]でペレットスフェロプラストを再懸濁します。 </li><li>氷ガラスホモジナイザーで予備冷却するセルを転送する。 </li><li>タイトな乳棒を用いて、乳棒の15ストロークをすることで細胞をホモジナイズする。 </li><li>氷冷均質化緩衝液の1ボリュームを追加します。 </li><li> 50 mlのプラスチック遠心管に均質化スフェロプラストを転送する。 </li><li> 4℃で1500 × gで5分間遠心してペレット切れ目のない細胞、核、および大規模な破片℃の</li><li> 4℃で3000 × gで5分間得られた上清を遠心℃に</li><li> 4℃をXGの12000で15分間、得られた上清を遠心</li><li>氷冷均質化緩衝液の上清をデカントし、ペレットを再懸濁します[バッファ/ g（湿重量）の細胞の6.5ミリリットル]。 </li><li> 4℃で3000 × gで5分間遠心する℃、 </li><li> 4℃をXGの12000で15分間、得られた上清を遠心</li><li>氷冷SEMの緩衝液3mlで上清をデカントし、ペレットを再懸濁します。 </li></ol> **この懸濁液をミトコンドリアに富んでいるものの、それはまた、小胞体（ミクロソーム）、ゴルジ体、および液胞などの他の小器官が含まれています。純粋なミトコンドリアを取得するには、この粗ミトコンドリア分画は、後述のように、さらに分別にかけることができます** 他の小器官による汚染のミトコンドリアを欠いての精製<ol><li> EMの氷冷60％（w / v）ショ糖の代わりに1.5ミリリットルのベックマンウルトラクリア遠心管にバッファリング。 </li><li>オーバーレイ60％（W / V）32％、23％液1.5 ml、15％スクロース（EMバッファ内のすべての重量/ v）を1.5 mlの4 mlのショ糖。 </li><li> 15％（w / v）スクロースの上にSEMバッファの粗ミトコンドリア分画の3mlを置きます。 </li><li> 4で134000 XG（33000回転）℃で1時間のためのベックマンSW41のTiスイングローターで遠心</li><li> 60％/ 32％スクロース界面で無傷のミトコンドリア形態は茶色のバンド。 </li><li>慎重にミトコンドリアのバンドに到達するまで、ショ糖を削除します。 </li><li>カットの先端にピペットを用いてミトコンドリアのバンドを外して、MLS - 5ローターのためベックマン遠心管に入れてください。 </li><li> SEM用緩衝液でチューブを埋める。 </li><li>ペレット4℃で30分10000 × gで（31000 rpm）で30分間MLS - 5ローターの遠心分離によって純粋なミトコンドリア℃の</li><li>使用して上清をデカントピペット。 </li><li>ミトコンドリア機能、ミトコンドリアプロテオームとlipidome、およびミトコンドリアDNAの分析のための純粋なミトコンドリアを使用してください。 </li></ol>試薬<ol><li> DTTバッファー[100 mMのTris/H2SO4液（pH 9.4）、10mMのジチオスレイトール]（15ミリリットル用） <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 M Tris/H2SO4緩衝液（pH 9.4）1.5 mlの</li><li> 1 M DTTを150μl </li><li> 15mlに容積</li></ul></li><li>ザイモリアーゼバッファー[20 mMリン酸カリウム（pH7.4）に、1.2 Mソルビトール]（100ミリリットル用） <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）を2ml </li><li>ソルビトール2 M 60 mlの</li><li> 100mlにボリューム</li></ul></li><li>均質化緩衝液[10mMトリス/ HCl（pH7.4）中、ソルビトール0.6 M、1mMのEDTA、0.2％（w / v）のBSA]（250ミリリットル用] <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 Mトリス/ HCl緩衝液（pH7.4）2.5 mlの</li><li>ソルビトール2 M 75mlの</li><li> 500mMのEDTAを500μl </li><li> BSA、0.5gの</li><li> 250mlにボリューム</li></ul></li><li> SEMバッファー[10 mMのMOPS / KOH（pH7.2）に、250mMスクロース、1mMのEDTA]（250ミリリットル用） <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 MのMOPS / KOH緩衝液（pH7.2）2.5 mlの</li><li> 2 Mのショ糖の31.25ミリリットル</li><li> 500mMのEDTAを500μl </li><li> 250mlにボリューム</li></ul></li><li> EMバッファー[10mMのMOPS / KOH（pH7.2）中、1mMのEDTA]（250ミリリットル用） <ul style="list-style-type:none;"><li> 1 MのMOPS / KOH緩衝液（pH7.2）2.5 mlの</li><li> 500mMのEDTAを500μl </li><li> 250mlにボリューム</li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

このメソッドは、酵母細胞から純粋なミトコンドリアの高収量を可能にします。この方法で精製したミトコンドリアは、他の小器官で、本質的に汚染の自由であり、その精製後、構造と機能の整合性を保持。本質的なミトコンドリアのプロセスの無細胞再構成に適しているミトコンドリアに記載の方法利回り。これらの高純度のミトコンドリアは、ミトコンドリアの構造と機能、ミトコンドリアプロテオームとlipidome、およびミトコンドリアDNAの分析にも使用できます。

酵母細胞からミトコンドリアの精製

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

ミトコンドリアは、真核生物、非光合成細胞における好気的代謝の間にATPの生産の主なサイトです。<sup&gt; 1</sup&gt;。これらの複雑な細胞小器官もアポトーシス細胞死の重要な役割を果たして<sup&gt; 2</sup&gt;、細胞の生存<sup&gt; 3</sup&gt;、哺乳類の開発<sup&gt; 4</sup&gt;、ニューロンの発達と機能<sup&gt; 4</sup&gt;、細胞内シグナル伝達<sup&gt; 5</sup&gt;、および寿命調節<sup&gt; 6</sup&gt;。ミトコンドリアによって制御されるこれらの複雑な生物学的プロセスについての我々の理解は、その形態、それらのタンパク質と脂質組成、彼らのDNAの完全性、およびそれらの数多くの重要な機能を評価するための堅牢な方法に依存しています。出芽酵母<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;、注釈付きのゲノムと明確に定義されたプロテオームとの遺伝的および生化学的に操作可能な単細胞真核生物は、ミトコンドリアの本質的な生物学的機能の根底にある分子細胞メカニズムを研究するための貴重なモデルです。このような種類の勉強のために、それは高純度のミトコンドリアを持つことが重要です。ここでは、酵母ミトコンドリアの精製のための迅速かつ効果的な方法の詳細な説明を提示する。このメソッドは、他の細胞小器官による汚染の本質的に自由であり、それらの精製後、構造と機能の整合性を維持する高純度のミトコンドリアの分離が可能になります。この方法で精製したミトコンドリアは、本質的なミトコンドリアのプロセスの無細胞再構成に適しており、ミトコンドリアの構造と機能、ミトコンドリアプロテオームとlipidome、およびミトコンドリアDNAの解析に使用することができます。

我々は、酵母からのミトコンドリアの精製のための迅速かつ効果的な方法を説明します<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;。このメソッドは、他の細胞小器官による汚染の本質的に自由であり、それらの精製後、構造と機能の整合性を維持する純粋なミトコンドリアの高収量を可能にします。

ミトコンドリアは、真核生物の非光合成細胞における好気性代謝中のATP産生の主要な場である1。これらの複雑なオルガネラはまた、...

本プロトコルでは、まずzymolyaseを用いて酵母細胞の細胞壁を消化し、スフェロプラストに変換します。次に、ガラス製テフロンホモジナイザーを用いてスフェロプラストをホモジナイズします。得られたホモジネートを2回遠心分離し、未破砕細胞、核、および大きなデブリをペレット化します。続いて、得られた上清を12,000 Gsで15分間遠心分離し、ミトコンドリアを沈殿させます。最後に、他のオルガネラがまだ含まれている粗ミトコンドリア画分を、ショ糖密度勾配を用いて134,000 Gsで60分間遠心分離します。これにより、他のオルガネラによる混入のない純粋なミトコンドリアが、60% weight per volumeと32% weight per volumeのショ糖の界面に回収されます。こんにちは、コンコルディア大学生物学科のDr.Vladimir tkoの研究室のDr.Christopher Gregです。今日は、酵母の*Saccharomyces*からミトコンドリアを単離する方法をご紹介します。ミトコンドリアで起こるダイナミクスおよび加齢に伴う変化を研究するために、これを行います。細胞の老化に伴い、ミトコンドリアのプロテオーム、リピドーム、およびDNAの変化を検討します。それでは、始めていきましょう。まず、10本の250 mLフラスコを用いて酵母株を培養します。各フラスコに50 mLのYP培地を入れ、30 °Cで48時間回転振盪させます。次に、培養液を500 mLのNalgene遠心チューブに移します。室温にて3000 Gsで5分間遠心分離し、細胞を回収します。上清を捨て、沈殿した細胞を250 millilitersの蒸留水に再懸濁し、室温にて3000 Gsで5分間遠心分離します。この手順を繰り返し、最後に沈殿した細胞を250 millilitersの蒸留水に再懸濁し、5分間遠心分離します。室温にて3000 Gsで遠心分離し、得られた細胞のウェットペレットの重量を測定後、ペレット化した細胞をDTTバッファーで再懸濁し、細胞懸濁液を250 mLのフラスコに移します。フラスコを30 °Cで70 RPMで20分間回転させます。20分後、室温にて3000 Gsで5分間遠心分離して細胞を回収し、ペレット化した細胞をXsを含まないXsバッファーで再懸濁し、5分間遠心分離します。室温で3000 ×gにて遠心し、ペレット化した細胞をXsを含まないZy緩衝液で再懸濁させ、細胞懸濁液をガラスフラスコに移します。細胞懸濁液にZy liase 100 T粉末を加え、30 °Cのシェーカーで70 RPMで30分間回転させます。Zy liase 100 Tが細胞壁を消化し、Sphero platsが形成されます。前述のX消化以降のすべての工程は、4 °Cまたは氷上で行ってください。オルガネラの破壊を避けるため、スプラットの懸濁液はチップの先端をカットしたピペットを用いて慎重に扱ってください。30分間のXMO消化が完了した後、Sphero platsを50 milliliterのプラスチック製遠心チューブに移し、4 °Cで2200 Gsにて8分間遠心分離します。沈殿したS splatsを氷冷したホモジナイズ緩衝液で再懸濁し、さらに4 °Cで2200 Gsにて8分間遠心分離します。ペレット化したスフェロプラストを氷冷したホモジナイズ緩衝液で再懸濁し、あらかじめ冷却しておいたガラス製ホモジナイザーに細胞を移します。密着性の高いペッスルを用い、ペッスルを15回往復させて細胞をホモジナイズします。ホモジナイズしたSスプラットに等量の氷冷ホモジナイゼーションバッファーを加え、50 mLプラスチック遠心チューブに移します。1500 Gs、4 °Cで5分間遠心分離し、未破壊の細胞、核、および大きなデブリをペレット化します。得られた上清を新しいチューブに注ぎ、さらに5分間遠心分離します。4°Cで3,000 Gsで遠心分離します。その後、得られた上清を4°Cで12,000 Gsで15分間遠心分離し、上清を捨てて、ペレットを氷冷したホモジナイズ緩衝液で再懸濁します。再懸濁したペレットを 4 °C、3000 Gs で 5 分間遠心分離します。最後に、得られた上清を 4 °C、12,000 Gs で 15 分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを 3 mL の氷冷した溶液で再懸濁します。SEMバッファー。この懸濁液は粗ミトコンドリア分画である。ミトコンドリアが濃縮されているが、純粋なミトコンドリアを得るためには、小胞体やマイクロソーム、GOGI、VAなどの他のオルガネラも含まれている。この懸濁液は、次のセクションで説明するように、さらに分画処理を行います。粗ミトコンドリア懸濁液の分画を開始して純粋なミトコンドリアを得るには、氷冷した60% w/v ショ糖含有EMバッファーを1.5 milliliters、Beckman UltraClear遠心チューブに入れます。次に、60% sucroseの上に、32% sucroseを4 mL、23% sucroseを1.5 mL、15% sucroseを1.5 mL（すべてw/v）の順で緩やかに重ねます。SEMバッファーで調製した粗ミトコンドリア画分3 mLを、15% (w/v) sucroseの上に添加します。Beckman SW 41 TI スイングバケットローターを用い、4°Cで134,000 G（33,000 RPM）で1時間遠心分離します。遠心分離後、無傷のミトコンドリアが60%から32%のSucrose界面に褐色のバンドを形成します。先端を切断したピペットを用い、ミトコンドリアのバンドに到達するまで慎重にSucroseを除去し、ミトコンドリアのバンドを回収してBeckman遠心管に移します。MLS fiveローターを使用する場合、チューブにSEM bufferを満たし、MLS fiveローターを用いて4 °Cで10,000 GSまたは31,000 RPMで30分間遠心分離を行い、純粋なミトコンドリアをペレット化して上清をデカンテーションで取り除きます。この精製ミトコンドリアは、ミトコンドリア機能、ミトコンドリアプロテオーム、脂質、およびミトコンドリアDNAの解析に使用できます。左側のレーンの粗ミトコンドリア画分と、右側のレーンのスクロース密度勾配遠心分離法で精製されたミトコンドリアを、SDS-PAGEおよび各種オルガネラのマーカータンパク質に対する抗体を用いた免疫ブロットに供しました。両方の調製物におけるミトコンドリアの存在は、PO1PおよびCOX1Pの免疫反応性によって確認されました。免疫ブロットにより、粗ミトコンドリア画分において、それぞれ小胞体、小胞体、およびゴルジ体を代表するDPM1P、FO13P、およびVPS10Pの存在が示されました。対照的に、これらのマーカータンパク質は精製ミトコンドリアからは検出されず、本プロトコルによって他のオルガネラの混入がないミトコンドリアが得られたことが確認されました。以上で、酵母 Saccharomyces cerevisiae からミトコンドリアを単離する方法を説明しました。この実験を行う際は、細胞を Zymolyase 100T で30分以上インキュベートさせないように注意してください。時間を過ぎると、細胞内に存在する膜タンパク質やオルガネラタンパク質が分解される恐れがあります。これは、試薬に含まれるプロテアーゼが原因である可能性があります。また、ミトコンドリアの単離およびスクロース密度勾配遠心法を行う直前に、ミトコンドリアを-20 °Cで冷凍保存し、実際に遠心分離ステップを行う準備が整った段階で解凍することも可能です。以上となります。実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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プロテオームスケールでのタンパク質の発見と定量に適合する高品質のミトコンドリア単離のための2段階プロトコルを提示します。私たちのプロトコルは遺伝子工学を必要としないため、あらゆる初代細胞や組織からのミトコンドリアの研究に適しています。...

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ミトコンドリアコンタクトサイトは、ミトコンドリアの内膜および外膜タンパク質と相互作用するタンパク質複合体です。これらの部位は、ミトコンドリア膜間のコミュニケーション、したがって細胞質とミトコンドリアマトリックスの間のコミュニケーションに不可欠です。ここでは、この特定のクラスのタンパク質に適格な候補を同定する方法について説明します。...

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この研究では、バイオリスティックな方法を使用して酵母ミトコンドリアを形質転換する方法を説明しています。また、形質転換体の選択方法と精製方法、およびミトコンドリアゲノム内の標的位置に目的の突然変異を導入する方法も示します。...

ベイカーにおけるミトコンドリア形質転換

酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸は、細胞の生体エネルギー学の貴重な指標です。ここでは、さまざまな酵母種に適用できるこの表現型を定量化するためのプロトコルを紹介します。...

酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸の定量化

分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe は、ミトコンドリアを研究するための魅力的なモデルとして浮上しています。ここでは、 S.

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