Name: マイクロ流体プローブ：局在表面処理のための操作と使用方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶマイクロ流体プローブの組み立てと顕微鏡アライメントの方法。バッファー溶液中での基板表面処理とパターニング技術を習得し、生物医学工学研究に応用する。

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この作品は、フォンデルシェルシュシュールラ自然らレテクノロジーズケベック、イノベーションと健康研究（CIHR）のカナダの協会のためのカナダのfundationによって賄われていた。

1。プローブヘッド（ビデオには示されていないプロセス）の微細加工<ol><li> 1μmの厚さの熱SiO2の層と525μmの厚さのシリコンウェーハ2、直径4インチは、、4000rpmで45秒フォトレジスト（PR）とspincoatedている。 </li><li>ウェーハは、DIで開発し、すすぎ、50秒のために110℃でプリベークし、5秒間すべての要素を（ポートとマイクロチャネル）を搭載したマスクを介して公開されます。 </li><li>発見されたSiO2を≈15分（SiO2のがエッチングされた基板のディウェッティングは、エッチングの完了を示す）でフッ化水素酸（BHF）ソリューションをバッファ1：07にエッチング除去する。 O2プラズマまたはアセトンは灰に使用したり、残りのPRを除去しています。 </li><li>第二PR層は≈10μmである[31]の太い上層をもたらし、45秒、1500rpmでスピンコートです。このPRの層の下にSiO2のパターンが表示されたままですとポートのみを搭載した第二のマスクとウェハを整列させるために使用される。 </li><li>曝露とPRの開発した後、ウェハは、すすぎ、乾燥、および20分間95℃でpostbakedれる。 </li><li> Siウェハチャックを保護するために溶けた白蝋とサポートのウェハ上に添付されます。 </li><li>誘導結合プラズマ（ICP）DRIEは3段階のプロセスでウェーハトポグラフィーにPRし、埋め込まれたSiO2のパターンを転送するために使用されます。 <ol><li> DRIEは、Si（太いPRによって定義されたパターン）に≈500μmdeepポートを作成する。 </li><li> DRIEのマシンからウェーハをアンロードせずに、PRは、プラズマを用いて灰化されています。 </li><li>露出SiO2のパターンは、50μm深さのチャネルを作成し、そしてウェハを介して充填し、ガス抜きのポートを開く、第二ドライエッチングプロセスのためのマスクとして機能します。アンロードした後、サポートのウェハは、暖かい水の流れの下で切り離されます。微細加工ウエハをアセトン、エタノール及びDIで拭きます。 </li></ol></li><li>個々のMFPチップはダイシングされています。 </li><li> PDMSのインターフェースブロックはそれぞれ2個のビア - アクセス穴 - のの1つに挿入された2つの構造化ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）の要素で構成さmicromould、底部を形成する研磨スチール板にキャストすることによって作製、二つの毛細血管（さ鋼板）は流体接続孔のためのプレースホルダとして機能します。 PDMSは、少なくとも1時間60℃のオーブン内で硬化させる</li><li> PDMSブロックは230Wで24秒間1ミリバールで空気プラズマの両方の部分を活性化する、と自家製メカニカルアライメントエイドを使用して2つを結合することで、さいの目MFPシリコンチップに接合されている。 </li><li>アセンブリは、1時間の最低60℃のオーブンで債券に委ねられている</li></ol> 2。 MFPの組立<ol><li>ガスタイトガラスシリンジはに気泡が存在しないことを保証するためにプラスチック製の注射器と注射針を使用して、適切な試薬を充填する。一般的に、我々は、注射用1〜10マイクロリットルのシリンジ、及び誤嚥5-10倍のボリュームでシリンジを使用してください。 </li><li>注射器は、低デッドボリュームでNanotight継手を使用してチューブをキャピラリーに接続されています。 </li><li>毛細血管を記入し、顕微鏡下での気泡のためにチェックされます。 </li><li> MFPのチップは、毛細血管を接続する際に気泡の捕捉を防止するために緩衝液が、事前にフィールドに入力される。 </li><li>毛細血管は、プローブヘッドにPDMSの接続ピースに接続されています</li></ol> 3。セットアップMFPの<ol><li>プローブヘッドは、プローブホルダーにクランプし、倒立顕微鏡上にプローブステーションに搭載されている</li><li>注射器は、高精度のシリンジポンプに配置されます。 </li><li>スライドガラスなどの基板は、、顕微鏡のステージに貼付されているホームメイドのホルダーに挿入されます。 </li><li> MFPと基板のメサの並列処理は、MFPが基板と接触させるときに表示されるニュートンリングを（干渉縞）観察することにより、ゴニオメーターのペアを使用して調整されます。接触およびリングの周波数の点は傾きの指標として役立つ。 MFPが表面に整列されている場合、単一の干渉リングが表面全体にわたって広がっている。この測定値は、MFPと基板の間の距離を校正するために提供しています。 </li><li> MFPと基板間のギャップは、表面のパターニングプロセスにとって重要です。基板がMFPの下にスキャンすることによって処理されるため、水平方向の配置は、マイクロメートルの精度で調整することが三マイクロメートルねじによって形成された三点支持を使用して達成されています。 </li></ol> 4。 MFPの操作<ol><li>調剤は、LabVIEWソフトウェアを介して制御されます。デバイスの操作は、眼とCCDカメラを用いて可視化される。注入：吸引率が周囲のバッファと、目的の幾何学的なフローパターンと試薬の拡散率に応じて、1:3〜1​​:10に変わります。 </li><li>吸引シリンジと気泡の存在を適切に動作するかどうかをチェックするには、まず適切な吸引を開始する前に吸引シリンジで液体を注入する。</li><li>ビーズのまたは蛍光トレーサーの染料の液体とモニターの流れと閉じ込めの注入を開始します。 </li><li>特定のアプリケーション用のプローブを使用する、すなわち、エッチングや表面や細胞の染色、堆積させるための処理のために表面を横切ってスキャン。 </li></ol>

<ol><li>Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. Nature Materials. 4 (8), 622-622 (2005).</li>
</ol>

それは、試薬と基質の異なるタイプで使用するための（ⅱ）適応、（i）は携帯電話であり、それは（iii）の広い範囲で動作させることができるので、マイクロ流体プローブ（MFP）は、汎用性があります。 不要な泡が気泡を避けるために、フローの中断につながることができる、すべてのコンポーネントは、アセンブリの前に液体で満たされる必要があります。プローブと表面との間の隙間はわずか数マイクロメートルである、まだメサは数百マイクロメートル幅で、センチメートルの範囲内の距離はスキャンされます。したがって、スキャンした表面の水平度とMFPメサと基板の間に並列処理の両方は、細心の注意を払って調整する必要があります。最後に、吸引と注入の間の比率は、MFPと基板との間の隙間に注入される試薬のすべてを捕捉するのに十分な大きさである必要があります。 MFPは、生理的緩衝液に浸漬組織や個々のセルを処理する、または表面にエッチングパターンにするために、温和な条件下でタンパク質をパターニング表面のために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>マイクロ流体コネクタ</td><td>Upchurch Scientific</td><td>Micro- および Nano-tight フィッティングおよびスリーブ</td><td></td></tr><tr><td>2液混合手動ディスペンサー</td><td>Conprotec Inc.</td><td>DM400</td><td>PDMS混合液の分注および混合用</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td>Version 8.0</td><td></td></tr><tr><td>強制対流オーブン</td><td>VWR international</td><td>1330FM</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製シリンジ</td><td>Hamilton Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ</td><td>Polymicro Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラズマチャンバー</td><td>Tegal Corporation</td><td>Plasmaline 415</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-E</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Cetoni</td><td>neMESYS</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>Photometrics</td><td>QuantEM 512SC</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ステージ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体プローブホルダー・ゴニオメーター</td><td>Melles Griot</td><td>07GON504</td><td></td></tr><tr><td>リニアステージ</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>LS-50</td><td>MFPのz軸制御用</td></tr><tr><td>手動リニアステージ</td><td>Newport Corp.</td><td>443-4 Series</td><td>MFPのx軸およびy軸制御用</td></tr><tr><td>顕微鏡ステージ</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>PZ-2000</td><td>x、y、z軸制御機能付き</td></tr></tbody></table>

マイクロ流体プローブ：局在表面処理のための操作と使用方法

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

マイクロ流体デバイスは、アッセイは、サンプルの微量を使用して実行されるように、最近、細胞の微小環境を制御するために使用されています。マイクロフルイディクスは、一般的に導入し、限られたボリューム内で、細胞の場合で培養可能なサンプルに、その使用を制限する閉じたマイクロチャネルに関連付けられています。一方、システムをmicropipettingと特にシンク、ソース、もう一つとして1つのピペットの行為プッシュプルのセットアップを使用して、局所的に細胞と表面を灌流するために使用されているが、フローの閉じ込めは、三次元では困難である。また、ピペットは壊れやすいと位置に困難であり、したがって、スタティック設定だけで使用されます。 マイクロプローブ（MFP）は、クローズドマイクロ流体チャネルの建設によって課されると代わりにマイクロ流体システムにサンプルを囲むの、マイクロ流体の流れを直接試料に配信できる、とMFPを使用して、サンプル全体でスキャンされた制約を回避することができます。 。注入と吸引開口部は、隙間に注入されたマイクロジェットが周囲の液体の流体力によって閉じ込めと完全に他の開口部に戻って吸引されるように互いのメートル数十内に位置しています。マイクロジェットは、基板表面全体にフラッシュされ、ローカライズされた堆積/表面全体にプローブを走査することによって広い範囲で使用可能な試薬の配信のための精密なツールを提供することができます。このビデオでは、マイクロ流体プローブ1（MFP）を提示する。我々は、MFPをアセンブルする方法を詳細に説明し、倒立顕微鏡上にそれをマウントして、基板表面からの相対位置を合わせ、そして最終的にバッファーに浸漬基板表面を処理するためにそれを使用する方法を示します。

このビデオでは、マイクロ流体プローブを提示<sup&gt; 1</sup&gt;（MFP）。我々は、MFPをアセンブルする方法を詳細に説明、倒立顕微鏡上にそれをマウントして、基板の表面に対して相対的位置を合わせ、最後に緩衝溶液に浸漬基板の表面を処理するためにそれを使用する方法を示します。

マイクロ流体デバイスを用いることで、微量のサンプルでアッセイを実施することが可能となり、近年では細胞の微小環境の制御にも利用されています。

本手順では、マイクロ流体プローブ（MFP）の組み立ておよび使用方法について解説します。MFPのマイクロ流体コンポーネントは、気密シリンジ、ガラスキャピラリーチューブ、Upchurch社製のマイクロタイトコネクタ、およびMFPヘッドで構成されています。このビデオでは、組み立てとアライメントにおける重要なステップについて説明します。組み立てが完了したMFPは、表面のパターニングおよび処理のために、多種多様な基板や試薬とともに使用することができます。こんにちは、セシル・ペローです。私はカナダのモントリオールにあるマギル大学生物医学工学科のデビッド・イーカー研究室の博士研究員です。こんにちは、Mohammad Kasimeです。私はマギル大学生物医学工学部のDavid Yの研究室で博士課程に在籍しています。こんにちは、David Yokerです。私は生物医学工学科の助教です。本日は、マイクロ流体プローブの実演にお越しいただき、ありがとうございます。本日は、マイクロ流体プローブの操作および使用の手順についてご紹介します。当研究室では、この手順を表面処理やパターニングに利用しています。それでは、プロトコルの手順を開始しましょう。試薬をガス密閉型ガラスシリンジに充填する際は、気泡が入らないようにプラスチック製シリンジと針を使用します。通常、注入には1～10 µLのシリンジを使用し、吸引にはその5～10倍の容量のシリンジを使用します。次に、デッドボリュームの少ないナノタイトフィッティングを用いて、シリンジをキャピラリーチューブに接続します。その後、キャピラリーに液体を満たし、顕微鏡下で気泡がないか確認します。キャピラリー接続時の気泡混入を防ぐため、MFPチップにはあらかじめ緩衝液を満たしておきます。最後に、キャピラリーをマイクロファブリケーションされたプロブヘッド内のPDMS接続パーツに差し込みます。これでMFPの組み立てが完了し、セットアップを開始する準備が整いました。基板を自家製のホルダーに挿入します。顕微鏡ステージに固定されています。MFPと基板の間のギャップは、表面パターニングプロセスにおいて極めて重要です。マイクロメータネジで構成される3点支持を用いることで、水平アライメントをマイクロメータ精度の精度で調整できます。基板をMFPの下で走査して処理する必要があるため、この手順が必要となります。MFPのセットアップを開始するには、プローブヘッドをプローブホルダーに固定し、倒立顕微鏡上部のプローブステーションに取り付けます。その後、シリンジを高精度シリンジポンプにセットします。次に、一対のゴニオメーターを用いて、ニュートンリング（干渉縞とも呼ばれる）を観察しながら、MFPの台座（meza）と基板の整合を調整します。MFPを基板に接触させるとこれらのリングが現れ、接触点とリングの頻度によって傾きを判断します。MFPが表面と正確に整合すると、単一の干渉リングが表面全体に広がります。この測定は、MFPと基板の間の距離を調整するためにも利用されます。MFPのセットアップが完了しましたので、次にMFPの操作に移ります。MFPの動作中は、LabVIEWソフトウェアによって分注が制御されます。装置の動作は、目視およびCCDカメラを用いて確認します。本格的な吸引を開始する前に、少量の液体を注入し、吸引用シリンジが正しく配置されており、気泡が含まれていないことを確認してください。その後、MFPをバッファーに浸します。ビーズの流動的な閉じ込め状態をモニタリングしながら、液体の注入を開始します。注入・吸引比は、試薬の周囲バッファーに対する拡散係数や、目的とする幾何学的な流れのパターンに応じて、1:3から1:10まで変化させます。これで、プローブをさまざまなアプリケーションに使用することが可能になります。ここに示す表面パターンは、strep divideでフルオレセイン標識ビオチンを固定化したENCコートハイドロゲルガラススライドを用い、MFPによって作製されました。注入流速は1 nL/s、吸引流速は10 nL/sとし、それぞれ10 µLおよび50 µLのシリンジを使用しました。表面とプローブの間のギャップは5 µmでした。MFPは、細胞や組織の局所的な染色および処理にも使用できます。流れの閉じ込めにより試薬の拡散が抑制され、細胞の精密な化学染色が可能になります。ここでは、線維芽細胞の単層を 100 µg/mL のダイで染色した例を示します。以上で、マイクロ流体プローブの操作方法について説明しました。この手順を行う際は、システム内に気泡が入らないようにし、マイクロ流体プローブの表面が基板と平行であることを必ず確認してください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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