組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

この手順は、単細胞期のゼブラフィッシュ胚をマイクロインジェクションプレートに並べることから始めます。蛍光デキストリン溶液を卵黄にマイクロインジェクションします。注入された胚の直下にあるものが、移植ドナーとなる胚です。

ドナー胚とホスト胚をコートし、シールド期まで成長させます。DECでコートしデキストリンを注入した胚2個を、移植プレートの1ウェルに並べて入れます。各ドナーペアについて同様に繰り返します。各ウェルにホスト胚を1個加え、移植細胞を前脳の将来の菱脳（di cephalon）へ、正中線から、また正中線へと標的化させます。

動物極とシールドの中間点。ドナーのgasaからホストのGasaへ細胞を移植する。30時間まで育成し、固定する。

必要に応じて免疫化学染色を行い、封入して撮影します。あるいは、宿主を生きたまま封入し、タイムラプス撮影を行います。こんにちは。私はマサチューセッツ州ノーサンプトンにあるスミス大学生物科学科のMichael ESI博士の研究室のElizabeth De Shaneです。

私は研究室の主任研究員であるMichael Besi博士です。本日は、ゼブラフィッシュのモデルシステムを用いて、原腸胚期の細胞移植を行い、キメラ胚を作製する方法を解説します。私の研究室では、前脳交連の発達における特定遺伝子の機能や、交連形成時における軸索とグリアの相互作用のプロセスを研究するために、この手順を用いています。

それでは、始めましょう。まず、1 mm径、長さ4インチの非フィラメント毛細管3本を慎重に半分に折り、マイクロインジェクションプレート用の溝型を準備します。瞬間接着剤を使用して、2つの毛細管の半分を平らな表面に並べて接着します。

これら2本の上の溝に3本目のキャピラリーをはめ込み、ピラミッド形状にします。3本のキャピラリーを配置した状態で、モールドを乾燥させてください。注入プレート1枚につき、3〜5個程度のモールドを作成してください。

次に、100 mmのペトリ皿に、溶融した1.5%アガロース含有胚培地を20～25 mL注いで注入プレートを用意します。直ちに、準備した溝型を3～5個プレートの底に配置し、型の平らな面がペトリ皿の底に接し、アガロースに完全に覆われていることを確認します。アガロースが凝固したら、型を含む大きなアガロースの正方形を切り出すことで、溝型を取り除きます。

切り出した正方形の周辺にあるアガーをそっと取り除き、廃棄します。正方形のアガー片を裏返し、微細ピンセットを用いてトロフ型を完全に除去します。新しく成形されたウェルを固定するため、正方形の周囲のペトリ皿に溶融アロースを注ぎます。

そのまま静置します。プレートはパラフィルムで密封し、4 °Cで数週間保存可能です。寒天培地に増殖の兆候が見られる場合は、廃棄してください。

最後に、注入用針を準備するため、マイクロピペットキャピラリープラーを使用して、内部フィラメントを持つ直径1 mm、長さ4インチのガラスキャピラリーから針を作製し、マイクロインジェクションプレートと針を準備します。胚の回収とマイクロインジェクション装置のセットアップについて見ていきましょう。受精卵は産卵直後に回収し、胚培地を満たしたペトリ皿の中で保持します。

先端の広いガラスピペットを使用して、室温に置いた胚培養液を満たした注入プレートのウェルに胚を排出します。鈍端の鉗子を使用して、胚をゆっくりと溝の底に押し込みます。卵膜または卵黄に損傷がある胚は廃棄してください。

次に、希釈した蛍光Alexa 594デキストリン溶液を1～2 µL、注入針に充填します。毛細管現象によって、デキストリンが注入針の先端まで移動するようにします。注入針をステレオタキシス・マイクロマニピュレーターのキャピラリーホルダーに取り付け、まずマイクロインジェクター装置の圧力を調整します。

40～50 PSIの圧力で、パルス幅500ミリ秒に設定します。ピンセットを使用して、注入針の先端を軽く擦るか切り取り、封印を解除します。理想的な直径は0.05～0.15ミリメートルです。

針の校正を行うには、実体顕微鏡を用い、ミネラルオイルを塗布したマイクロメーター上にデキストリンを排出します。パルスの空気圧時間および針のサイズを調整することで、ボーラスサイズを変更してください。ヒント：注入の間、0.8〜1 nL相当のボーラスサイズを維持する必要があります。

実体顕微鏡を約3.2倍の倍率に設定し、デキストリンの微量注入を開始します。トローの一端から胚への注入を開始し、絨毛膜と細胞膜をスムーズに貫通して卵黄内に進入させます。デキストリン溶液を細胞の直下に注入してください。

胚に刺入した時と同様に、滑らかな動作で注入針を抜いてください。ペトリ皿を移動させて次の胚を配置し、溝に沿って注入を続けてください。圧力とボラスサイズを定期的に確認してください。

次に、ピンセットを使用して、胚をトラフから静かに押し出します。抗生物質含有胚培養液を満たしたペトリ皿に胚を移します。胚を28.5 °Cでインキュベートし、未受精卵や死亡個体がないか観察します。

これで、胚を今後の移植に使用する準備が整いました。ガス換気中のポリマー化が完了する前は、卵黄の一部が露出したままになります。卵黄は非常に脆弱であり、ペトリ皿のプラスチックに付着すると容易に破れるため注意してください。

したがって、移植を行う前日に、コーティング済みのプレートで胚をコーティングする必要があります。100 mmのペトリ皿に5〜10 mLの溶融アガロースを注ぎ、これらのデコレーションプレートを作成します。デコレーション中に胚を保護するためには、2〜3 mm程度の薄いアガロース層があれば十分です。

プレートを冷却させます。次に、100 mmのペトリ皿に1.5%アガロース溶液を30 mL注いで個別の移植用プレートを作成し、移植ウェル用モールドを挿入します。このモールドには、3つの90度角の辺と1つの45度角の辺で構成される三角形のくぼみが104個含まれている必要があります。

ウェルは2つの胚を並べて保持できるように設計されています。モールドの下に気泡が入らないように注意し、アガロースを硬化させます。モールドを取り除くと、傾斜した縁を持つ正方形のウェルを含む陥没領域が現れます。

移植用のホスト胚およびドナー胚を準備するためには、ほぼ同齢のペアリングを維持できるよう、その発育状況を監視する必要があります。そのためには、胚を23から31°Cのさまざまな温度で育成し、発育速度を遅らせたり早めたりすることができます。ホスト胚とドナー胚は、目的の齢に達する1時間前に、コーティング済みのプレート上でハンドコートしてください。

胃腸形成期（gastro stage）の移植の場合、これは受精後5時間（5 HPF）、つまり5.5 HPFの楯状期（shield stage）に達する前までに完了させる必要があります。ガラスピペットを使用して、抗生物質入り胚培養液を満たした移植用プレートに、ホスト胚とドナー胚をロードします。ここでは、最初の行にドナー胚を1ウェルあたり2個ずつ配置し、続く2行にホスト胚を1ウェルあたり1個ずつ配置します。

移植には、ジョイスティックでズームとフォーカスを完全自動操作できるZeiss luer蛍光実体顕微鏡を使用します。この自動顕微鏡は必須ではありませんが、特に大量の移植を行う場合に、これらの微細な外科的移植の容易さと効率を劇的に向上させます。移植装置をセットアップするには、einorエアラムをスケールの中央位置に設定し、エアラムのチューブをキャピラリーホルダーに接続して、ホルダーをeinor自動マイクロマニピュレーターに固定します。胚と移植装置の準備が整いましたので、胃胚期（gastro stage）の細胞移植に進みます。

胃胚期細胞移植を完遂する上で最も重要なスキルは、ゼブラフィッシュでシールドとして知られる背面芽（dorsal blast）の細胞解剖学的構造を認識できる能力です。ここでは、異なる視点から撮影した原腸胚のシーケンス動画を提示し、この側面視においてシールドがどこに位置しているかを強調します。シールド（背面側）は赤色の輪郭で囲まれた右側にあり、前脳へ移植する細胞および正中線へ移植する細胞の標的となります。

動物極とシールドのちょうど中間の位置から、まず胚をこちら側に回転させて動物極を観察し、その過程でシールドと移植部位を明確にします。次に、胚を軸回転させてシールドを下側に配置します。その後、原腸胚を再び上方に回転させ、背面を正面から捉えた状態で提示します。

胚を順に回転させ、6 HPFでの側面像に戻します。マイクロマニピュレーターを用いて、キャピラリーの先端で胚にそっと触れ、正中線とシールドが見え、かつキャピラリーの先端と向かい合うように、細胞抽出に適した位置まで回転させます。明視野照明から蛍光照明に切り替えることで、ドナー胚を容易に確認できます。ここでは、原腸の細胞が赤色に蛍光を発します。細胞が気液界面に接触して損傷する可能性を排除するため、少量の胚培養液をキャピラリー内に吸引しておきます。

ドナー胚の動物極とシールドのちょうど中間にある正中線の外胚葉を、静かに刺します。gasaでは、表面外胚葉と下層の卵黄の間の細胞層は約20 micrometersしかありません。卵黄を突き刺すと数時間以内に死に至ることが多いため、注意してください。

エアトラムを用いて、キャピラリー内にゆっくりと細胞を吸引します。チップを軽く揺らしながら、常に水面の視認性を維持してください。ドナー内部に留まることで、細胞間の接触を緩めるのに役立ちます。

ドナー胚から約10～50個の細胞を抽出します。次に、ドナーからキャピラリーを抜きます。同様にホスト胚の向きを合わせ、穿刺して、ホスト胚の全く同じ位置に細胞を注入します。明視野照明から蛍光照明に切り替えると、キャピラリー針内のデキストリン標識細胞がホスト胚内へ移動する様子が確認できます。

最後に、移植後、ドナー胚とホスト胚をウェルから取り出します。これらを分離し、抗生物質含有胚培養液を満たしたAコート済みペトリ皿に静かに移します。胚を28.5 °Cでインキュベートし、移植工程を完了します。

視覚化およびイメージングを開始します。まず、免疫化学的に検証済みの保存液を用いて、イメージングに適した段階の胚を固定します。本手法では、4% formaldehydeを用いて、室温で2時間、または4 °Cで一晩回転させながら固定します。

続いて、固定した胚を2回すすぎ、その後0.1 M pbで3〜5分間洗浄します。必要に応じて、適切な免疫標識を行ってください。

胚を75% glycerolに入れ、室温で沈めてから4 °Cで保存します。スライド上に正方形の内径に合わせた पेट्रोलियमジェリー の正方形の枠を2つ作り、2つの胚をマウントするためのスライドを準備します。胚の隣にカバーガラスを置き、前脳の前面が観察できるよう必要な解剖を行います。

中脳を垂直に切断し、前脳を切り出します。この組織を少量のグリセロールとともにペトロリウムゼリー中に配置します。組織を適切な位置に正しく配向させ、標本の上にカバーガラスを被せます。

あるいは、生胚の場合、0.75% agar溶液を用いてガラス製の底面培養皿に固定します。agarが凝固する前に、タングステン針を使用して胚を適切なイメージング方向へ調整してください。固定した個体と生体の個体の両方をイメージングします。

Leica SP 5レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いてZスタック画像を取得し、Velocityソフトウェアを用いて3次元または4次元の画像処理を行うことで、胚内のアストログリア集団の一部が遺伝子型または表現型において異なるキメラ胚を作製します。我々は、アストログリアを標識するGFPトランスジェニック胚の使用と、クローンを頭部に特異的に導入するための原腸胚期の細胞移植を組み合わせた多角的なアプローチを採用しました。ゼブラフィッシュの原腸胚運命地図を利用し、動物極とシールドから等距離にある正中線上の細胞を選択的に採取しました。

これらの抽出された細胞を、野生型のホストガサの同一部位に移植し、30 HPFまで育成した後、前脳解剖学の参照指標となる全軸索の免疫標識を行いました。ここに示す例では、1つのホスト胚の共焦点画像により、頭部および頭部全体に孤立したGFP陽性細胞が認められます。これらのGFP陽性細胞の完全な形態をこのクローン解析で観察すると、これらの細胞のほとんどが特徴的な放射状グリア形態を呈しており、細胞体が脳室帯に隣接して位置し、大きな終末足が皮層表面で放射状突起を終端していることが分かります。

収集したこれらの光学切片のZスタックを3次元レンダリングすることで、標識された軸索に対するこれらの細胞の位置が明確に示されます。移植細胞を可視化するために一般的に用いられるもう一つの手法は、1細胞期の野生型またはGFP転換胚の卵黄に、蛍光細胞系譜染料をあらかじめマイクロインジェクションすることです。この例では、野生型胚にAlexa 594デキストリンを注入しました。

1細胞期に、遮蔽期（shield stage）の原腸胚まで発生させ、上述のように脳を標的とした4箇所の移植を行いました。ただし、今回はトランスジェニックなホスト原腸胚に移植し、レーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて背側頭部のイメージングを行いました。その結果、前脳内のGFP陽性核の中に、ドナー細胞の赤色蛍光クラスターが認められました。

さらに、レーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて、2時間にわたり3分ごとにZ-stackを収集し、このホストの解析を行いました。IMP提供のVelocityソフトウェアを用いたこのタイムラプス画像の4次元レンダリングにより、桿体優位細胞膜およびGFP陽性核のダイナミックな細胞運動が示されています。以上で、ゼブラフィッシュ胚への細胞移植に必要なすべての装置および試薬の準備方法について説明しました。

具体的に、本手法を原腸胚期で実演しました。ただし、胞胚期の移植にも適用可能です。この手順を用いる際は、移植細胞の最終的な目的部位と、原腸胚期におけるこれらの細胞の初期運命地図上の位置を正確に相関させることが重要です。詳細なガイダンスについては、Scott Frazier博士による1995年のゼブラフィッシュ運命地図に関する詳細な研究「Fate Maps of the Zebrafish Embryo」をご参照ください。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。