Name: ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質の迅速かつ高感度コロイドクマG - 250染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学ぶ、ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質検出のための改良型コロイドクマシーG-250染色法。2時間以内にナノグラムレベルの高感度検出が可能で、ゲルベースプロテオミクス研究に有用です。

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我々は1 - Dゲルの調製および染色のために博士ニコラWiethölterに感謝。 この作品は、ドイツ学術振興（NDとSMへのGRK 1089/project 5）からの助成金によって資金を供給され、NDに財団ユルゲンManchotから研究フェローシップによってサポートされていました。

パート1：カップローディングを使用して二次元（2 - D）ゲル電気泳動<ol><li> IPGストリップの水和と等電点電気泳動（IEF） <ul><li> 125μlの補液でイモビのDryStripゲル、pHが6-11（7 cm）の水和する[7 M尿素、2 Mチオ尿素、4％CHAPS、50 mMリンhydroxyethyldisulfideと2％IPGの緩衝液pH 6月11日]のためにイモビDryStrip Reswellingトレイを使用して少なくとも10時間。 </li><li> [7 M尿素、2 Mチオ尿素、2％CHAPS、2％ASB - 14、50mMリンhydroxyethyldisulfideと2％IPGの緩衝液pH 6月11日]を100μl当たり60から100μgのタンパク質に対応するIEFサンプル緩衝液中で沈殿したタンパク質試料を溶かす。 </li><li>可溶化（室温で少なくとも30分間）した後、サンプルカップを使用してカップローディング陽極を介してタンパク質のサンプルを適用する。カップの容量は100μlである（マニホールドのコップは150μLまでできます）。 注：あなたが焦点を当てプロトコルと詰め替えの先頭にカップを低電圧ステップを挿入するとカップの液膜が残っている間に、より大きなサンプルの量を読み込むことができます！ </li><li> Multiphor II電気泳動ユニットの勾配モードで11.1 KVHのために等電点電気泳動法を実行します。 </li></ul></li><li>平衡とSDS - PAGE <ul><li> IEF後、IPGストリップを平衡化溶液中でそれぞれ1％ジチオスレイトール、2.5％のヨードアセトアミドを使用して、シェーカーにするたびに、減少してアルキル化するために15分を行った[50 mMのTris-HCl/pH 8.8、6 M尿素、30％グリセロールと2％SDS]。 </li><li> H 2 Oで平衡化したストリップをリンスし、余分な平衡化バッファーを削除するにはワットマンのペーパーにそれらを覆い隠す。その後、SDSランニングバッファー（1X）のストリップを浸し。 </li><li>二次元目は12％の総アクリルアミド濃度の垂直電気泳動システムでSDS - PAGEによって実行されます。平衡化したIPGストリップは、[ブロモフェノールブルーを含むバッファ動作し、0.5％アガロース]を分離ゲルの上に置かれ、熱いアガロース溶液で固定した。 </li><li>タンパク質は、色素フロントがゲルカセットの底に達するまで、120 Vに続いて15分間80 Vから始まる、2.5時間のために分離した。 </li></ul></li></ol>パート2：CBB G - 250コロイドCoomassie染色 1。染色液 注：ミリポアシステム（Milli - Q水）から取得として染色溶液の調製のために、このような分析グレード（PA）と高純度の水のような高品質で化学品を使用。 <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2">クマのソリューション： </td><td>広告2000ミリリットルH 2 O </td></tr><tr><td> 0.02％（w / v）の</td><td> CBB G - 250 </td><td> 0,4グラム</td></tr><tr><td> 5％（w / v）の</td><td>硫酸アルミニウム-（14-18） - 水和物</td><td> 100グラム</td></tr><tr><td> 10％（v / v）の</td><td>エタノール（96％） </td><td> 200ミリリットル</td></tr><tr><td> 2％（v / v）の</td><td>オルトリン酸（85％） </td><td> 47ミリリットル</td></tr></tbody></table> 注：染色溶液の調製のために、次の順序でコンポーネントを逐次添加を維持する必要がある。 <ol><li>第一Milli - Q水に硫酸アルミニウムを溶解する</li><li>その後、エタノールを追加してホモジナイズし、解決するためにCBB G - 250を混在させる</li><li>ソリューションが完全に溶解されているように、最近、リン酸を（アルコールのメディアへの酸の取り込みは、そのコロイド状態に集約し、クマシー分子をすることができます）を追加</li><li>最終的にMilli - Q水でいっぱいに</li></ol> 注：最終的な染色液は濃い緑、青味のある外観をして泳ぐの粒子に満ちている： <ul><li>ろ液は、このソリューションはいけない！ </li><li>あなたが準備の順序を変更した場合、あなたは、機密性の低い、よりバイオレット-青みがかったソリューションになるだろう。 </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2">ソリューションを脱染： </td><td>広告2000ミリリットルH 2 O </td></tr><tr><td> 10％（v / v）の</td><td>エタノール（96％） </td><td> 200ミリリットル</td></tr><tr><td> 2％（v / v）の</td><td>オルトリン酸（85％） </td><td> 47ミリリットル</td></tr></tbody></table> 2。染色手順<ul><li>二次元目の分離後、慎重にガラス板からゲルを取り出して、Milli - Q水で満たされた染色皿にそれらを転送する。 </li><li>水平シェーカーで10分間ゲルをMilli - Q水で3回洗浄し（ゲル上の残りのSDSは、タンパク質への染料の境界を乱すので、不十分な洗浄は貧しい感受性を引き起こす）​​。 </li><li>均等にコロイド粒子を分散させるために使用する前に、クマシーソリューションを振る。 </li><li>よく2月12日時間シェーカー上で攪拌によってクマシーソリューションで覆われたゲルをインキュベートする。あなたが間に染色の進行状況を監視できるように、この染色は、マージナルな背景を生成します。 注：10分後には、インキュベーションの2時間以内に約80％がそれに染色、最初に表れるの蛋白質スポットを見ることができますsの最大レベルは完了です。ほぼ100％の染色の場合は、一晩インキュベーションすることをお勧めします。いくつかのケースでは、染色されるタンパク質の量は膨大であり、解決策が明るい青色に変わるときに、染色液のリフレッシュは必要です。 </li><li>染色手順の後にクマの液を除去し、Milli - Q水で二回ゲルをすすぐ。 注：粒子が依然として残っているように限り、染色液を再利用できる、そうでなければ（あなたの研究室では廃棄物処理のための特別な規制があるかもしれないことに注意して）それを捨てる。 </li><li>糸くずの出ないペーパータオルで染色皿から染料粒子を付着取り外し、10秒間汚れを除く - 60分。 注：またばかりMilli - Q水でゲルを洗浄することができますが、スキャン手順中に発生する予定ゲルで不規則な、弱いクマの映画をそこに続くので、これは我々が取ゲルのためにのみお勧めします。 </li><li>最後にMilli - Q水で二回ゲルをすすぎ：ゲルは、元の厚さに達する（アルコール酸のメディアは、ゲルの縮小を行う）と中和水に加えてクマの色の強度を高めるでしょう。 </li></ul>パート3：代表的な結果あなたが上記のプロトコルに従うのであれば、あなたの2次元ゲル独特の解決と同様ステンドダークブルーの蛋白質スポットを取得します。にもシェフチェンコら 5、質量分析との良好な感度との互換性を主張するプロトコルに応じて銀で染色した2 - Dゲルと比較して、我々は同じ染色の結果を達成する。 <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：上記の実験の最終結果。カン氏のクマシープロトコル（）シェフチェンコらによれば、銀染色のように強く行います。（B）2 - Dゲル電気泳動後にタンパク質を検出する。 パート4：ヒントとテクニック<ul><li>独自のサンプルを処理する前にいくつかのテストstainingsを実行します。説明のつかない理由のため私たちはミリグラムが適用された場合でも、目的のタンパク質が正常に検出できないことが時々報告。このケースでは、感度をテストするための希釈系列を用意することをお勧めします。 </li><li>あなたがゲル内の一般のタンパク質の検出（の）低いがある場合は、SDS - PAGE中に分離ゲルにスタッキングから失敗の転送は、おそらく理由になります。あなたは、スタッキングエリアを含む完全なゲルを染色することによってそのような粘着性のタンパク質を確認することができます。 </li><li>あなたの等電点電気泳動結果の高速な検証では、直接それ以上の二次元分離することなくIPGストリップを染色することができます。 </li><li>彼らは（あなたがゲルに心を動かされない続ければ、色素がちょうどゲルの片側に結合する）両側から均等に染色されるので、時々染色手順の実行中にゲルを回します。 </li><li>私たちは、暗い瓶の中に染色液のその記憶を経験し、その寿命を（透明ボトルで、最大4ヶ月間まで）増加する。 </li><li>染色と文書化した後に、（あなたが酸性溶液を追加する場合には菌類による汚染を避けるために）数年間冷蔵庫でゲルを保つことができます。 </li><li>トリプシン消化物をゲルプラグの脱色は、ブロックヒーターで温暖化によって加速することができる。 </li></ul>

<ol><li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li>
<li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li>
</ol>

革新的なまたは単に別のクマのプロトコル？ 現時点ではクマシーブリリアントブルーで手続きを染色するための複数のプロトコルが存在する。それらのほとんどはNeuhoffと同僚2で最も一般的に使用されるプロトコルのいずれかのマイナーまたはメジャーの変更に起因する。また、カンのプロトコルは、Neuhoffの式に基づいた。しかし、それは本当にプロテオミクス研究のための代替クマシー染色法である？我々は、それが他のクマシープロトコルとさらに銀や蛍光stainingsに比べて間違いなく有益な染色プロトコールだという証拠に、2つの主要な問題、検出限界と使いやすさを想像されます。 私のフォーカス：検出限界をカンの出版物では、彼らはは1 ng /バンド（図2）にいくつかのマーカータンパク質を検出する。しかし、我々の意見では4月8日/ NGバンドの検出限界は、より多くの可能性練習（表1）に関連しています。彼らはさらに、アマシャムファルマシアバイオテクノロジーからCBBリン酸、...

<table border="1" ><tr><td> 製品の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> IEFとSDS - PAGE用： </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イモビDryStripゲル</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-6001-94 </td><td>さらに有効期限を2年後に使用することができます。 </td></tr><tr><td>イモビDryStrip Reswellingトレイ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 80-6371-84 </td><td>有機溶剤で洗浄しないでください。 7〜18センチメートルIPGストリップのために設計されています。 </td></tr><tr><td>イモビDryStripキット</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1004-30 </td><td>トレイ、電極ホルダー、アノードとカソード電極、アライナーとサンプルカップバーとサンプルカップを含みます。 </td></tr><tr><td> EPS 3501 XLの電源</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1130-05 </td><td>消耗品は、3500までの電圧V </td></tr><tr><td> Multiphor II電気泳動ユニット</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1018-06 </td><td>可動電極は、すべての長さのIPGストリップにIEFを有効にする（7〜24センチメートルはストリップをIPG） </td></tr><tr><td> PerfectBlueゲルシステムツインS </td><td> Peqlab </td><td> 45から1010 - C </td><td> 10 × 10センチメートルミニゲルフォーマットでSDS - PAGE。ゲルチャンバーは、冷却システムが含まれています。 </td></tr><tr><td> コロイドクマG - 250染色の場合： </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓋付染色皿</td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td>ミニゲルのはめあい。シェーカーでスタッカブル。 </td></tr><tr><td>硫酸アルミニウム- 18 -水和物</td><td>メルク</td><td> 1.01102.5000 </td><td>我々は、メルクとの最高の体験をしました。 5kgのパッケージでだけ利用できる。 </td></tr><tr><td>オルトリン酸</td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td>ガラスびんで販売。 </td></tr></table>

ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質の迅速かつ高感度コロイドクマg - 250染色

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

クマシーブリリアントブルー（CBB）は、一般的にシンプルな染色法と高い定量を提供し、SDS - PAGEにより分離されたタンパク質の可視化のために使用される色素です。さらに、質量分析、タンパク質の同定と完全に互換性があります。しかし、これらの利点にもかかわらず、CBBは、銀や蛍光stainingsよりも感度が低いとみなされるため、分析用ゲル電気泳動ベースのプロテオミクスのアプローチ中のタンパク質の検出に用いることはめったにありません。 オリジナルのクマプロトコル1のいくつかの改良がCBBの感度を高めるために行われています。二つの主要な変更は、コロイド粒子に色素分子を変換することにより、低濃度タンパク質の検出を強化するために導入されました：1988年、Neuhoffらは、CBB G - 250ベースの染色液2に20％メタノールおよび硫酸アンモニウムの高濃度を適用し、そして2004年にCandiano ら 。硫酸アンモニウムとメタノール3の存在下でリン酸とCBB G - 250を使用して確立されたブルーシルバー 。それにもかかわらず、これらすべての修正はわずか約10 ngのタンパク質の検出を可能にする。コロイドクマシー染色のための広くfamelessプロトコルは、Kang らによって出版された。彼らは錯化物質に関するNeuhoffのコロイドCBB染色のプロトコルを変更した2002年。代わりに硫酸アンモニウムを彼らは硫酸アルミニウムとメタノールが毒性の少ないエタノール4によって置き換えられたために使用。小説アルミベースのカンの研究では染色はタンパク質によって若干の感度のばらつきとは1 ng /バンド（ホスホリラーゼb）のように低い検出する優れた感度を示した。 ここでは、分析目的のタンパク質の迅速かつ高感度コロイドクマシー染色のためのカンのプロトコルのアプリケーションを示しています。我々は日常的に私たちのワーキンググループで行われる二次元のゲルを使って素早く簡単にプロトコルを説明します。

このビデオでは、カンによるとコロイドクマG - 250染色プロトコールを普及するものと<em&gt;ら。</em&gt;ゲルの平均4 ngのタンパク質の検出のための。染色は2時間以内と何の努力もせずに完了します。我々は日常的にゲルベースの​​プロテオミクス、分析目的のためにカンのプロトコルを使用してください。

ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質の迅速かつ高感度コロイドクマG - 250染色

クマシーブリリアントブルー（CBB）は、SDS-PAGEによって分離されたタンパク質の可視化に一般的に使用される染料であり、簡便な染色手順と...

このビデオでは、ポリアクリルアミドゲル中の数ナノグラムのタンパク質を検出するための、改良されたクマシー染色プロトコルの有用性を実演します。例として、一次元分離前の二次元ゲル電気泳動を用います。固定化pH勾配ストリップを、変性バッファー条件下で再水和させます。ストリップを一晩再膨潤させた後、アノードカップを用いてタンパク質サンプルを導入します。フォーカシング工程において、タンパク質は等電点に基づいて分離されます。2次元目の分離はSDS-PAGEによって行われます。その後、ゲルを染色皿に移し、コロイド状クマシーで染色してタンパク質を検出します。こんにちは、オロール大学バイオメディカル研究センターのSabina Meka研究室のNadine de Balaです。本日は、多くの同僚の間でそれほど知られていない手法についてご紹介します。Coomassie Brilliant Blueは、電気泳動分離後のタンパク質可視化に一般的に使用される染料ですが、比較プロテオミクスへの適用性は低いとしばしば考えられています。しかしながら、Coomassie Brilliant Blue（CBB）コロイド染色（cos colloidal staining）は、感度、コスト、および実用性の面で優れた特長を備えています。当研究室では、ほぼ全てのゲルベースのアプリケーション、特に心筋タンパク質発現の変化を決定する分析プロテオミクスにおいて、CBB染色プロトコルを用いています。ここでは、二次元電気泳動ゲルのアルカリpH領域において心筋タンパク質を検出するための、本手法の使用方法を実演します。それでは始めましょう。2次元ゲル電気泳動の1次元目は等電点電気泳動（IEF）であり、この解析には固定化pH勾配ストリップ（IPGストリップ）が使用されます。IEFに先立ち、4本のIPGストリップをIM Mobillyドライストリップ膨潤トレイを用いて、125 µLの再水和溶液でそれぞれ10時間以上再水和させ、タンパク質サンプルの適用に備えます。4つの異なる心臓調製物からTCA沈殿させたタンパク質サンプルを、IEFサンプルバッファーに溶解し、タンパク質濃度を100 µg/100 µLに調整します。タンパク質サンプルの可溶化は、ボルテックスを用いて室温で少なくとも30分間行います。その間に、マルチフォー電気泳動装置で等電点電気泳動（IEF）を行うため、IM Moleneドライストリップキットの追加コンポーネントを準備します。まず、冷却ユニットの温度を20 °Cに設定し、カバー液を3〜4 mL冷却プレート上にピペッティングし、赤色の電極接続側をアノードに向けてImmobilienドライストリップトレイを配置します。Immobilienドライストリップトレイにカバーオイルを約10 mL注ぎ、溝側を上にしてImmobilienドライストリップアライナーをオイルで満たされたトレイの上に置きます。次に、再膨潤トレイから再水和させたストリップを取り出し、ゲル面を上にしてアライナーの溝に移動させます。ストリップの酸性端が陽極側を向くようにしてください。最終的に、すべてのストリップの陽極端が揃っている状態にします。蒸留水で飽和させた電極ストリップをゲルストリップの両端に横方向に配置し、電極ストリップがゲルの表面に少なくとも部分的に接触していることを確認します。最後に、カラーマークが対応する電子接点に向くように、電極ストリップ上に電極を配置します。immobilienドライストリップトレイのアノード付近にサンプルカップバーを配置し、各IPGストリップの上にサンプルカップを置きます。サンプルカップを軽く押し下げ、IPGストリップと十分に接触するようにします。トレイにカバーオイルを70～80 mL注ぎ、IPGストリップを覆います。オイルがサンプルカップの中に漏れ出さないように注意してください。カップの中にオイルが漏れ出した場合は、ピペットで除去し、再度カップの位置を調整してください。最後に、サンプルカップを完全に覆うように、カバーオイルを約150 milliliters加えます。その後、カバー液の表面下でピペッティングを行い、タンパク質サンプルをサンプルカップに分注します。カップの容量は100 µLです。すべてのタンパク質試料をアプライした後、すべてのリード線を接続します。マルチフォーユニットを電源に接続し、グラジエントモードで11.1 kVhの等電点電気泳動（IEF）を行います。IEF後、IPGストリップをゲル面を上にしてトレイに配置し、平衡化の間、還元およびアルキル化処理を行います。還元のため、ストリップ1枚につき1% DTT平衡化溶液2.5 millilitersを使用します。その後、15分間振盪させ、DTT溶液を完全に除去してから、2.5% iodoacetamide平衡化溶液中でさらに15分間振盪させてストリップをアルキル化します。平衡化したストリップを水を入れたビーカーで1回すすぎ、フィルターペーパーで吸い取って余分な平衡化バッファーを除去します。次に、ストリップをXSDSランニングバッファーに転写します。これで、ストリップ中のタンパク質を2次元ゲル電気泳動の2次元目に供する準備が整いました。2次元目は、垂直電気泳動システムを用いたSDS-PAGEによって行われます。厚さ1 mmの12%アクリルアミドゲルを必要数、使用の前日に作製し、濡れたペーパーで覆って保存しておく。室温で、平衡化したIPGストリップを分離ゲルの上端に配置し、ホットアガロース溶液で固定する。その後、タンパク質を2.5時間かけて分離させる。まず80 Vで15分間通電し、続いて色素前線がゲルカセットの底部に到達するまで120 Vで通電する。SDS-PAGEによるタンパク質の分離が行われている間に、ゲルのコロイダルクマシー染色のための溶液を調製します。染色液を調製する際は、以下の順序で各成分を逐次的に添加することが非常に重要です。まず、ビーカーに100 gの硫酸アルミニウムと約1.5 LのMilli-Q水を入れ、撹拌して溶解させます。硫酸アルミニウムが溶解した後、200 mLのエタノールを混ぜ合わせ、さらに0.4 gのCBB G-250を溶液に加えます。CBB G two 50が完全に溶解したら、直ちに47 millilitersの正リン酸を加えます。この工程により、kamasi分子がコロイド状態で凝集します。最後に、milli Q waterを加えて最終容量をtwo litersにします。最終的な静置溶液中では、粒子が泳いでいる状態になります。この溶液をろ過しないでください。染色溶液はあらかじめ調製し、使用時まで暗所で保存することも可能です。SDSゲルが完成したら、ガラスプレートから慎重にゲルを取り出し、Milli Q水を満たした染色皿に移します。ゲルを入れた皿を水平振盪機に載せ、10分間振盪します。この洗浄をさらに2回、各回約5〜10分間繰り返します。ゲルに残ったSDSは、色素のタンパク質への結合を妨げ、感度の低下を招く可能性があるため、新鮮なmilli cube水でゲルを十分に洗浄することが重要です。3回目の洗浄が終わったら、ディッシュから水を捨てます。これでゲルの染色準備が整いました。まず、クマシー溶液を振ってコロイド粒子を均一に分散させます。次に、ゲルが完全に浸るまで十分な量の溶液を加えます。Kumasi溶液を入れたディッシュに蓋をします。シェーカーにゲルを載せ、2～12時間振盪させます。10分後には、最初のタンパク質スポットが現れるのが確認できます。インキュベーション後2時間以内に、染色の80%から100%を完了させることができます。しかし、100%に近い染色率を達成するためには、一晩のインキュベーションを推奨します。染色が完了したら、クマシー溶液を除去し、ゲルをMilli Q水で2回洗浄します。ゲルの洗浄後、糸くずの出ないペーパータオルを用いて染色容器に付着した染料粒子を取り除きます。ゲルに脱染色溶液を加え、シェーカー上で10〜60分間脱染色します。最後に、Milli Q水でゲルを2回洗浄します。ゲルは元の厚さに戻り、クマシー染色の色の強度も高まります。このプロトコルに従えば、2Dゲルの分離能は明確になり、タンパク質スポットが濃い青色に良好に染色されるはずです。我々が行った2Dゲルのクマシー染色の結果は、銀染色に匹敵します。高感度かつ質量分析との適合性が高いと報告されているChef Chenkoらによるプロトコルに従います。二次元ゲル電気泳動を例に、kangs cooma染色がいかに迅速で簡便、かつ高感度であるかを示しました。ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を検出するための染色は、2時間以内に完了させることができます。この手順自体の手間はほとんどかかりません。そして最後になりますが、わずか 1 ng のタンパク質までも検出できる可能性があります。したがって、このプロトコルはゲルベースのプロテオミクスにおける非標識法に代わる優れた選択肢となります。染色手順を行う際は、分析グレードの試薬および最高純度の水を使用することが重要です。さらに、染色液への成分の順次添加は、調製における重要なステップとなります。最後に、電気泳動分離後、ゲルから残留したSDSを効率的に洗浄することを忘れないでください。そうしないと、ゲルに何も表示されません。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしています。

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