ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質の迅速かつ高感度コロイドクマG - 250染色

このビデオでは、ポリアクリルアミドゲル中の数ナノグラムのタンパク質を検出するための、改良されたクマシー染色プロトコルの有用性を実演します。例として、一次元分離前の二次元ゲル電気泳動を用います。固定化pH勾配ストリップを、変性バッファー条件下で再水和させます。

ストリップを一晩再膨潤させた後、アノードカップを用いてタンパク質サンプルを導入します。フォーカシング工程において、タンパク質は等電点に基づいて分離されます。2次元目の分離はSDS-PAGEによって行われます。

その後、ゲルを染色皿に移し、コロイド状クマシーで染色してタンパク質を検出します。こんにちは、オロール大学バイオメディカル研究センターのSabina Meka研究室のNadine de Balaです。本日は、多くの同僚の間でそれほど知られていない手法についてご紹介します。Coomassie Brilliant Blueは、電気泳動分離後のタンパク質可視化に一般的に使用される染料ですが、比較プロテオミクスへの適用性は低いとしばしば考えられています。

しかしながら、Coomassie Brilliant Blue（CBB）コロイド染色（cos colloidal staining）は、感度、コスト、および実用性の面で優れた特長を備えています。当研究室では、ほぼ全てのゲルベースのアプリケーション、特に心筋タンパク質発現の変化を決定する分析プロテオミクスにおいて、CBB染色プロトコルを用いています。ここでは、二次元電気泳動ゲルのアルカリpH領域において心筋タンパク質を検出するための、本手法の使用方法を実演します。

それでは始めましょう。2次元ゲル電気泳動の1次元目は等電点電気泳動（IEF）であり、この解析には固定化pH勾配ストリップ（IPGストリップ）が使用されます。

IEFに先立ち、4本のIPGストリップをIM Mobillyドライストリップ膨潤トレイを用いて、125 µLの再水和溶液でそれぞれ10時間以上再水和させ、タンパク質サンプルの適用に備えます。4つの異なる心臓調製物からTCA沈殿させたタンパク質サンプルを、IEFサンプルバッファーに溶解し、タンパク質濃度を100 µg/100 µLに調整します。タンパク質サンプルの可溶化は、ボルテックスを用いて室温で少なくとも30分間行います。

その間に、マルチフォー電気泳動装置で等電点電気泳動（IEF）を行うため、IM Moleneドライストリップキットの追加コンポーネントを準備します。まず、冷却ユニットの温度を20 °Cに設定し、カバー液を3〜4 mL冷却プレート上にピペッティングし、赤色の電極接続側をアノードに向けてImmobilienドライストリップトレイを配置します。Immobilienドライストリップトレイにカバーオイルを約10 mL注ぎ、溝側を上にしてImmobilienドライストリップアライナーをオイルで満たされたトレイの上に置きます。

次に、再膨潤トレイから再水和させたストリップを取り出し、ゲル面を上にしてアライナーの溝に移動させます。ストリップの酸性端が陽極側を向くようにしてください。最終的に、すべてのストリップの陽極端が揃っている状態にします。

蒸留水で飽和させた電極ストリップをゲルストリップの両端に横方向に配置し、電極ストリップがゲルの表面に少なくとも部分的に接触していることを確認します。最後に、カラーマークが対応する電子接点に向くように、電極ストリップ上に電極を配置します。immobilienドライストリップトレイのアノード付近にサンプルカップバーを配置し、各IPGストリップの上にサンプルカップを置きます。

サンプルカップを軽く押し下げ、IPGストリップと十分に接触するようにします。トレイにカバーオイルを70～80 mL注ぎ、IPGストリップを覆います。オイルがサンプルカップの中に漏れ出さないように注意してください。

カップの中にオイルが漏れ出した場合は、ピペットで除去し、再度カップの位置を調整してください。最後に、サンプルカップを完全に覆うように、カバーオイルを約150 milliliters加えます。その後、カバー液の表面下でピペッティングを行い、タンパク質サンプルをサンプルカップに分注します。

カップの容量は100 µLです。すべてのタンパク質試料をアプライした後、すべてのリード線を接続します。マルチフォーユニットを電源に接続し、グラジエントモードで11.1 kVhの等電点電気泳動（IEF）を行います。IEF後、IPGストリップをゲル面を上にしてトレイに配置し、平衡化の間、還元およびアルキル化処理を行います。

還元のため、ストリップ1枚につき1% DTT平衡化溶液2.5 millilitersを使用します。その後、15分間振盪させ、DTT溶液を完全に除去してから、2.5% iodoacetamide平衡化溶液中でさらに15分間振盪させてストリップをアルキル化します。平衡化したストリップを水を入れたビーカーで1回すすぎ、フィルターペーパーで吸い取って余分な平衡化バッファーを除去します。

次に、ストリップをXSDSランニングバッファーに転写します。これで、ストリップ中のタンパク質を2次元ゲル電気泳動の2次元目に供する準備が整いました。2次元目は、垂直電気泳動システムを用いたSDS-PAGEによって行われます。

厚さ1 mmの12%アクリルアミドゲルを必要数、使用の前日に作製し、濡れたペーパーで覆って保存しておく。室温で、平衡化したIPGストリップを分離ゲルの上端に配置し、ホットアガロース溶液で固定する。その後、タンパク質を2.5時間かけて分離させる。まず80 Vで15分間通電し、続いて色素前線がゲルカセットの底部に到達するまで120 Vで通電する。

SDS-PAGEによるタンパク質の分離が行われている間に、ゲルのコロイダルクマシー染色のための溶液を調製します。染色液を調製する際は、以下の順序で各成分を逐次的に添加することが非常に重要です。まず、ビーカーに100 gの硫酸アルミニウムと約1.5 LのMilli-Q水を入れ、撹拌して溶解させます。硫酸アルミニウムが溶解した後、200 mLのエタノールを混ぜ合わせ、さらに0.4 gのCBB G-250を溶液に加えます。

CBB G two 50が完全に溶解したら、直ちに47 millilitersの正リン酸を加えます。この工程により、kamasi分子がコロイド状態で凝集します。最後に、milli Q waterを加えて最終容量をtwo litersにします。

最終的な静置溶液中では、粒子が泳いでいる状態になります。この溶液をろ過しないでください。染色溶液はあらかじめ調製し、使用時まで暗所で保存することも可能です。

SDSゲルが完成したら、ガラスプレートから慎重にゲルを取り出し、Milli Q水を満たした染色皿に移します。ゲルを入れた皿を水平振盪機に載せ、10分間振盪します。

この洗浄をさらに2回、各回約5〜10分間繰り返します。ゲルに残ったSDSは、色素のタンパク質への結合を妨げ、感度の低下を招く可能性があるため、新鮮なmilli cube水でゲルを十分に洗浄することが重要です。3回目の洗浄が終わったら、ディッシュから水を捨てます。

これでゲルの染色準備が整いました。まず、クマシー溶液を振ってコロイド粒子を均一に分散させます。次に、ゲルが完全に浸るまで十分な量の溶液を加えます。

Kumasi溶液を入れたディッシュに蓋をします。シェーカーにゲルを載せ、2～12時間振盪させます。10分後には、最初のタンパク質スポットが現れるのが確認できます。

インキュベーション後2時間以内に、染色の80%から100%を完了させることができます。しかし、100%に近い染色率を達成するためには、一晩のインキュベーションを推奨します。染色が完了したら、クマシー溶液を除去し、ゲルをMilli Q水で2回洗浄します。

ゲルの洗浄後、糸くずの出ないペーパータオルを用いて染色容器に付着した染料粒子を取り除きます。ゲルに脱染色溶液を加え、シェーカー上で10〜60分間脱染色します。最後に、Milli Q水でゲルを2回洗浄します。

ゲルは元の厚さに戻り、クマシー染色の色の強度も高まります。このプロトコルに従えば、2Dゲルの分離能は明確になり、タンパク質スポットが濃い青色に良好に染色されるはずです。我々が行った2Dゲルのクマシー染色の結果は、銀染色に匹敵します。

高感度かつ質量分析との適合性が高いと報告されているChef Chenkoらによるプロトコルに従います。二次元ゲル電気泳動を例に、kangs cooma染色がいかに迅速で簡便、かつ高感度であるかを示しました。ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を検出するための染色は、2時間以内に完了させることができます。

この手順自体の手間はほとんどかかりません。そして最後になりますが、わずか 1 ng のタンパク質までも検出できる可能性があります。したがって、このプロトコルはゲルベースのプロテオミクスにおける非標識法に代わる優れた選択肢となります。

染色手順を行う際は、分析グレードの試薬および最高純度の水を使用することが重要です。さらに、染色液への成分の順次添加は、調製における重要なステップとなります。最後に、電気泳動分離後、ゲルから残留したSDSを効率的に洗浄することを忘れないでください。

そうしないと、ゲルに何も表示されません。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしています。