Name: 組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: 学ぶQD-FRETとマイクロ流体を組み合わせたDNAナノコンプレックスの自己組織化リアルタイム監視法。静電気的相互作用によるポリエレクトロライト複合体形成過程を可視化し、遺伝子治療への応用可能性を探索します。

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DNAのA.ビオチン化プラスミドDNAを共有結合製造業者によって記載されたようグアニン特異的ビオチンラベルしたビオチン（Mirusバイオ、マディソン、ウィスコンシン州）が、DNAあ​​たり1〜2ビオチンラベルを持つようにスケールされた。プラスミドDNA（pEGFPを- C1、4.9キロバイト、クロンテック、マウンテンビュー、カリフォルニア州）は、このプロトコルで標識した。 <ol><li> 1μg/μLDNA溶液を作るためにDNaseフリー、RNaseフリーのTEバッファー（分子生物学グレードの品質）水にPDNAの所望量を溶解する。 </li><li>以下の反応混合物を用いて標識反応を行う。 ITは、試薬最後のラベルを追加します。 </li></ol> 100μgのDNA反応のための： <table border="1"><tbody><tr><td> DNaseフリー、RNaseフリーの水</td><td> 75μL </td></tr><tr><td> 10X標識バッファー</td><td> 20μL </td></tr><tr><td> 1μg/μLDNA </td><td> 100μL </td></tr><tr><td> IT試薬ラベルを付けます。 </td><td> 5μL </td></tr><tr><td> 合計ボリューム </td><td> 200μL </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 37反応℃で1時間インキュベートする。 </li><li>標準的なプロトコルは、次のエタノールまたはイソプロパノール沈殿により標識された試料を精製する。 </li></ol> 注：ゲルろ過ベースの列には、DNAの定量化や蛍光特性に影響を与える可能性が、高いUV吸光度または蛍光バックグラウンドにつながる可能性があります。 注：ビオチン化のレベルはHABAベースのテストによって決定されることがあります。 Cy5標識カチオン性ポリマーのB.標識キトサンは（390 kDaの、脱アセチル化83.5％、バンソン、レッドモンド、ワシントン州）、本研究におけるモデルカチオン性ポリマーとして使用されました。キトサンポリマー骨格の空き第一級アミンは、Cy5標識NHS（アマシャムバイオサイエンス社、ピスカタウェイ、NJ）で標識した。 <ol><li> Cy5の色素の完全な接合を容易にするために、Cy5標識NHSの必要量を計算するCy5のモル比というような：200：第一級アミンは1です。 </li><li> NaOHの添加により〜6.5にキトサン溶液（25mMの酢酸緩衝液中）のpHを調整します。 NHSの反応は、塩基性pHでより効率的ですが、ここキトサンの溶解度が動作pH範囲を制限することに注意してください。 </li><li>撹拌しながら、ゆっくりとドロップによるドロップの方法でキトサン溶液にCy5標識NHSの計算量（1 mg / mlのDMSO）を追加します。 </li><li>一晩室温で暗所で混合物をかき混ぜる。 </li><li>精製するために、暗所で室温で1％の酢酸緩衝液に対して2時間10K MWCOスライド- A - Lyzer（Pierce）で透析。 </li><li>バッファーを交換し、暗所で室温で別の2時間を透析。 </li><li>バッファーを交換し、4℃で一晩透析·ダークでCを。 </li><li>ストア精製は、-20℃でポリマーを標識し</li></ol> 注：本研究では、標準曲線は670 nmでCy5標識NHSエステルの発光強度を測定することによって構成されている。標準曲線にCy5標識キトサンから670 nmで得られた発光を測定することにより、ラベルの密度を特徴づける。吸光度は、標識効率を決定するために使用されることがありますが、ここで実行されませんでした。 QD -標識DNAとCy5 -ポリマーのC.の準備 PDNAへの量子ドットの完全な接合を確保するためにQDにPDNAのモル比が過剰（2：：QD≈1 PDNA）に保たれた。各PDNAに標識された量子ドットの数は、TEM像や他の同等の機能を介して推定することができる。我々の研究では、PDNAあたりのドット数は、TEMおよび単一分子分光法による〜1月3日と推定される。調製時1使用ミリポアのMilli - Q勾配の水（&gt; 18.0 MW、0.2umのフィルタリング）。 <ol><li>所望のN / P比によると10μgのPDNA、DNA溶液に負のリン酸にキトサン溶液中のプロトン化アミンの理論上の比率のためのキトサンの必要量を計算します。 </li><li>ビオチン化PDNA液にストレプトアビジン官能605QDs（Qdot ®二605 ITK、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）を追加します。 </li><li> 15分間暗所に室温で溶液をインキュベートする。 </li><li>最終的な音量200μLを作るために、50mMの硫酸ナトリウム溶液にQD -標識DNAを追加。 </li><li>最終的な音量200μLを作るためにMilli - Q水で、所望のN / P比によると、Cy5標識キトサンを希釈する。 </li></ol> 注意：可能な光退色を防ぐために、暗所で反応しておいてください。 重要：このカタログの量子ドットは、FRETの目的のために設計されているとしてQdot ®二605 ITK™ストレプトアビジンコンジュゲート（ITKシリーズ）を使用するように注意が必要です。正規のQdot ®二シリーズは、特に携帯電話ラベリングのために、非特異的結合を防ぐためにPEG層との共役複素数である。しかし、この追加のコーティングはrで、その結果、ドナー - アクセプターの距離を拡大エネルギー伝達効率をeduced。 標準的なフォトリソグラフィーを用いたSU - 8マスターズのD.作製<ol><li> Siウェーハはピラニア℃で5分間洗浄し、200で焼成です。 </li><li> 25μmのの指定されたマスターの厚さ、スピンコート用2000rpmでシリコンウェハ上にネガ型フォトレジスト（SU - 8 2025、マイクロケム、ニュートン、マサチューセッツ州）30秒。 </li><li>ソフトベーク65のランプとホットプレート上にウェーハ℃〜95℃/時間℃の</li><li>マイクロチャネルの設計を含むマスク膜（CAD /アートサービス、バンドン、OR）を介して250mJ/cm 2のUV光（波長365nm）にさらす。 </li><li>暴露後は、65のランプをホットプレート上にウエハを焼く° C / hrで95℃を</li><li> SU - 8フォトレジストの現像剤を用いてウェハを開発する。 </li><li>パターン付きウェーハは、ハード65のランプをホットプレートで焼いている° C / hrで200℃室温へのダウンウェハその後徐々に涼しく、少なくとも5時間、200℃でウェハを保持する。 </li></ol> 重要：SU - 8マスターベーキング処理が必要な時に徐々にランプが、そうでなければSU - 8構造体は、SU - 8構造が応力緩和により誘導されることがありますでシリコンウェハやクラックから剥離することがあります。 マスターとボンディングからカバーガラスにPDMSのE.レプリカ成形<ol><li> SU - 8のマスターは、秤量ボートに配置されます。 </li><li> 10のミックスシリコーンエラストマーと硬化剤（ポリ（ジメチルシロキサン）、PDMS、Sylgard 184、ダウコーニング、ミッドランド、MI）：1の割合。 </li><li> SU - 8マスターにPDMSの混合物を注ぎ、気泡を除去するため真空デシケーター中で秤量ボートを残す。 </li><li> 1〜2時間、65℃でPDMSを治す。 </li><li>のSiマスターモールドからPDMSストリップピール。 </li><li>パンチのチャネル入口と流体デバイスのアウトレット。 </li><li> PDMSのストリップを洗浄し、エタノールとして空気乾燥してガラスをカバーする。 </li><li>酸素プラズマによるクリーニングPDMSストリップとカバーガラスを（1分間20W）と同様に取り扱う。 </li><li>カバーガラスとすぐに結合PDMSストリップ。 </li><li> 95℃で一晩オーブンに結合マイクロ流体チップを残す。 </li></ol> 重要：プラズマ処理と一晩ベーキングは、強化された接着強さには不可欠です。 F.モニターマイクロ流体デバイス中のDNA Nanocomplexesの形成<ol><li>実験時のスムーズな流れを確保するために試薬をロードする前に、水とマイクロ流体チャネルを（マイクロ流体チャネル内に気泡がないことを確認するために）記入してください。 </li><li>ビデオで説明されているチューブを介して、二つの個々のガラスシリンジにQD -標識DNAとCy5標識キトサンソリューションを読み込みます。 </li><li>マイクロ流体デバイスには2つの入口とチューブを接続します。プロセス中に空気を導入しないように注意が必要です。層流条件下で、20nL/min（PHD - 2000シリンジポンプ、ホリストン、MA）で流量を設定します。 </li><li>顕微鏡下でマイクロチャネルを確認してください。 </li><li>流れは、（〜15〜20分）安定した量子ドットを介したフレットの場合はチャネルの中心に観察する必要があります。 </li><li>チャネルに沿って異なる位置で蛍光画像を（冷却CCD、Qimaging、BC、カナダ）を取る。 </li><li> ImageJとOriginLabのと蛍光画像を解析する。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 QD - FRETは、DNAのNanocomplexes自己組織化の発症の敏感な指標を提供 <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>量子ドットを介した蛍光共鳴エネルギー移動（QD - FRET）は、DNAや遺伝子のキャリア間の相互作用の発症の明確な検出を可能にする、余分なまたは細胞内の環境のいずれかでpolyplex安定性の定量的かつ高感度指標を提供することができます。 FRETのペア、605QDとCy5は、ドナーとアクセプター間のスペクトルの重なりを最大化し、潜在的なクロストークを最小限に基づいて選択されまし​​た。このペアの場合は、フェルスター距離は69.4Åです3。 </li><li> QD - FRETのDNA nanocomplexesの自己集合。アニオンプラスミドDNA（PDNA）とカチオン性遺伝子キャリアは、それぞれ、QD（エネルギー供与体）とCy5（エネルギーアクセプター）で標識した。 QD - FRET nanocomplexesは、静電複合コアセルベーションを経て形成された。 488nmで励起されると、QD - FRETを介したCy5の発光は、コンパクトでそのままnanocomplexの形成を示した。滞留時間は、（T R）2つのストリームが調査対象の反応の位置、及び平均流の速度（v）に合致した場所から測定する距離（X）により算出することができる。混合、層流の性質上は、t Rの関数としての質量輸送の正確な計算を可能にする、インターフェース（各画像の中央）で行われます。時間分解能はapplieを変えることによって調整することができます。dフローのレート。 （挿入図）FRETの介在シグナルは、適用される流量に応じて数ミリ秒以内に起こる、その結合が急速であったことを示す、2つのストリームが満たさインターフェースですぐに観察された。スケールバー：100μmの。 </li></ol>

<ol><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li>
<li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

<ul><li>我々の仕事の意義： <ol><li>これは、単純なマイクロ流体チップ内にQD - FRET応答を通じてリアルタイム（ミリ秒の分解能）で高分子DNAのnanocomplex自己組織化の動態を監視する最初の試みです。 </li><li>マイクロフルイディクスは、空間的にDNAのnanocomplexの合成時にプロセスを分析するために十分に制御された微小環境を提供するのに対し、QD -媒介FRETは、分子間相互作用の発症のと自己組織化プロセス全体で高感度かつ定量的な指標を提供する。 </li><li>マイクロフルイディクスとナノフォトニクスの統合は、錯体形成反応の任意のタイプを調査するために新しいし、面白いアプローチを示唆している。 </li><li>結果として得られる高分子DNAのnanocomplexesが容易な構造と機能の関係を確立するために適用される可能性QD - FRET。1,2 </li></ol></li></ul>

<table><tbody><tr><td>SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>プラスミドDNA</td><td>Clontech Laboratories</td><td>pEGFP-C1</td><td>4.9 kb, MW = 3.3 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Label&lt;/em&gt;IT ビオチン標識キット</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR 3400</td><td>標準プロトコルでは、二本鎖DNAの20-60 bpごとに約1つの標識という標識効率が得られる。本研究では標識密度を調整した。</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン 605QD</td><td>Invitrogen</td><td>Qdot&amp;#174; 605 ITK&amp;#174; ストレプトアビジン複合体</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-NHS エステル</td><td>Amersham</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>キトサン</td><td>Vanson</td><td>390 kDa</td><td>脱アセチル化度 83.5%</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545C</td><td>No. 1; サイズ: 40 x 22mm</td></tr><tr><td>ガスタイトガラスシリンジ</td><td>Hamilton Co</td><td>TLL シリーズ</td><td>サンプル量に応じて 50&amp;#x03BC;L から 500&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Tygon チュービング</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>0.02 ID, 100ft</td><td>Tygon チューブ マイクロボア, 0.02 ID, 100ft</td></tr><tr><td>コネクタ</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-23R</td><td>長さ 0.750&quot;にカスタマイズ</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>QImaging</td><td>Intensified Retiga Cooled</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX-51</td><td>100W 水銀アークランプ</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>v1.36b</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>Origin Pro8</td><td>OriginLab</td><td>Student Version</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡フィルターセット</td><td>Omega Optical</td><td>475AF40</td><td>両チャンネルの励起フィルター</td></tr><tr><td>顕微鏡フィルターセット</td><td>Omega Optical</td><td>595AF60</td><td>605QD チャンネルの透過フィルター</td></tr><tr><td>顕微鏡フィルターセット</td><td>Omega Optical</td><td>670DF40</td><td>QD-FRET チャンネルの透過フィルター</td></tr><tr><td>顕微鏡フィルターセット</td><td>Omega Optical</td><td>500 DRLP</td><td>605QD チャンネルのロングパスダイクロイックミラー</td></tr><tr><td>顕微鏡フィルターセット</td><td>Omega Optical</td><td>595DRLP</td><td>QD-FRET チャンネルのロングパスダイクロイックミラー</td></tr></tbody></table>

組み合わせるqd - fretとマイクロ流体はリアルタイムでdnaのnanocomplex自己組織化を監視する

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

ゲノミクスの進歩により、細胞および分子レベルでの病態をターゲットにできる治療薬の開発に燃料を供給し続けます。細胞内で一般的に機能的、核酸ベースの治療法は、効率的な細胞内送達システムが必要です。 One広く採用されているアプローチは、劣化に対してそれを保護しながら、DNAの細胞取り込みを促進する、自己組織化電経由nanocomplexesを形成するために遺伝子キャリアーとの複合体のDNAにすることです。時期尚早の解離または過度に安定な結合が細胞への取り込みや治療効果に有害となるので、課題は、効率的な遺伝子キャリアの合理的な設計にあります。混合バルクで合成さNanocomplexesはnanocomplexesの大きさと安定性の異質性に起因した、開梱、細胞内及び人身売買の行動の多様な範囲を示した。そのような異質性が自己組織化の動態の正確な評価を妨げられ、トランスフェクション効率や生理活性にその物理的性質を相関させるのが困難に追加されます。我々は、層流の下nanocomplexの自己組織化のリアルタイム動態を特徴づけるために、新規ナノフォトニクスの収束（すなわち、QD - FRET）とマイクロフルイディクスを提示する。マイクロフルイディクスは、空間的に高時間分解能（〜ミリ秒）を使用してプロセスを分析するために十分に制御された微小環境を提供するのに対し、QD - FRETは、合成プロセス全体を通して、分子間相互作用との定量的測定値の発症の高感度指標を提供する。高分子nanocomplexesのモデルシステムの場合は、自己組織化プロセスの2つの異なるステージがこの分析プラットフォームによって捕獲された。マイクロスケールで得られた自己組織化プロセスの速度論的側面は、多くのマイクロおよびナノスケールのアプリケーションに関連するマイクロリアクターベースの反応は特に有用であろう。さらに、nanocomplexesは、マイクロ流体デバイスの適切な設計を使用してカスタマイズすることができ、結果として得られる高分子DNAのnanocomplexesが容易な構造と機能の関係を確立するために適用される可能性QD - FRET。

我々は将来の核酸ベースの治療のために均一とカスタマイズ可能なpolyplexesのよりよい制御および合成を提供することが期待される高分子電解質polyplexes、の形成を調査するナノフォトニクス（QD - FRET）とマイクロフルイディクスの小説や、強力な統合を提示する。

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

ゲノミクスの進展は、細胞および分子レベルで病原性を標的とする治療法の開発を促進し続けています。通常、...

この手順は、量子ドット（QD）FRETペアを生成するためのDNAおよびポリマーの標識から始まります。まず、DNAを量子ドットに結合させます。エネルギー供与体となる量子ドットと、エネルギー受容体となる有機ポリマーに有機蛍光色素であるCy5を標識します。QD FRETを混合すると、静電的な自己組織化によってナノ複合体が形成され、相互作用が進むにつれてQD介在性のFRET信号を追跡することができます。このQD FRETシステムをマイクロ流体チャネルに導入すると、成分は混合界面における拡散を通じてのみ相互作用します。これにより、QD FRETとマイクロ流体デバイスの組み合わせによって、DNAナノ複合体の自己組織化をモニタリングすることが可能になります。こんにちは。ジョンズ・ホプキンス大学機械工学部のBiosおよび単一分子ダイナミクス研究室のMegan Hoです。本日は、量子ドットとマイクロ流体デバイスを組み合わせて、DNAナノ構造の自己組織化をリアルタイムでモニタリングする手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手法を用いて、遺伝子治療への応用のためのDNAナノ構造複合体の研究を行っています。それでは始めましょう。MIRIs bio社製のビオチン標識キットを使用して、プラズマDNAのグアニン特異的な部位にビオチン標識を共有結合させますが、DNA 1分子あたり約1〜2個のビオチン標識が付加されるようにスケールを調整します。まず、必要な量のプラズマDNAをTEバッファーに溶解し、1 µg/µLのDNA溶液を作成します。プラズミドDNA、RNAフリーの水、10x ラベリングバッファーA、およびLabelIt試薬を混合して、ラベリング反応を準備します。LabelIt試薬は最後に添加してください。反応液を37°Cで1時間インキュベートします。1時間のインキュベーション後、エタノール沈殿により標識サンプルを精製します。標準的なプロトコルに従ってください。標識したDNAは、使用時まで-20°Cで保存します。次のステップは、イオン性ポリマーの標識です。本デモンストレーションでは、モデルイオン性ポリマーとしてキトサンを使用し、キトサンポリマー主鎖上の遊離一次アミンを sci-fi NHS で標識します。まず、sci-fi と一次アミンのモル比が 1:200 になるように、必要な sci-fi NHS の量を算出してください。これにより、sci-fi 染料の完全なコンジュゲーションが促進されます。ゆっくりと攪拌しながら、25 millimolar 酢酸バッファー中のキトサン溶液に水酸化ナトリウムを加え、pHを約6.5に調整します。その後、算出量のsci-fi NHSをキトサン溶液に一滴ずつ加えます。遮光するため、バイアルをアルミホイルで覆い、室温で一晩振盪します。翌日、Pierce社の10 K-M-W-C-Oスライドを用い、1% 酢酸バッファーに対して室温・遮光下で2時間透析を行い、混合物を精製します。2時間後、1%酢酸バッファーを交換し、さらに2時間透析を行います。室温かつ暗所にて再度バッファーを交換し、4°Cの暗所で一晩透析します。翌日、透析カセットから精製された標識ポリマーを取り出します。その後、SCI 5でラベル付けしたキトサンをマイクロ遠心チューブに回収し、-20 °Cで保存します。ストレプトアビジン機能化605ドットをビオチン化プラズマDNA溶液に加えます。ITKシリーズの量子ドットはFRETを目的として設計されているため、通常の量子ドットシリーズではなく、ITKシリーズのQドットストリッパー共役体を使用してください。溶液を室温で15分間インキュベートします。光退色の可能性を防ぐため、QD標識反応は暗所で行ってください。15分後、QD標識DNAに50 millimolar 硫酸ナトリウム溶液を加え、最終容量を200 microlitersにします。SFポリマーを調製するには、希望するNP比（キトサン溶液中のプロトン化されたアミンとDNA溶液中の負電荷リン酸基の理論比）に基づき、10 µgのプラスミドDNAに必要なキトサン量を算出します。希望するNP比に従ってSFキトサンをMilli Q水で希釈し、最終容量を200 µLにします。これで、QDラベル化DNAおよびSFキトサン溶液が、セクション6で説明するマイクロ流体デバイスへのロード準備完了となります。シリコンウェハーは、事前にピラニア洗浄およびベーキングを行い、ウェハー上の水分を除去して、指定のマスター厚である25 µmに調製しておきます。ネガ型フォトレジストをシリコンウェハー上に2000 RPMで30秒間スピンコートします。ホットプレートを用いて、1時間あたり65 °Cの昇温レートで95 °Cまでウェハーをソフトベークします。これにより、SU-8フォトレジスト中の溶媒が蒸発し、UV光に曝露される前にレジストが硬化します。ソフトベイク後、マイクロチャネルの設計を含むマスクフィルムをシリコンウェハーに貼り付け、365 nmのUV光を250 mJ/cm²で露光します。露光後、ホットプレートを用いて、1時間あたり65 °Cの昇温速度で95 °Cまでウェハーをベイクします。SU-8フォトレジスト現像液を用いてウェハーを現像し、完全に現像されているか確認します。ウェハーをイソプロピルアルコールに浸します。イソプロピルアルコールが白濁しないことを確認してください。最後に、SU-8構造を強化するため、ホットプレートを用いて、1時間あたり65 °Cの昇温速度で200 °Cまでパターン形成済みウェハーをハードベークします。ウェハを200 °Cで少なくとも5時間保持します。その後、ウェハを室温まで徐々に冷却します。SU-8マスターをウェイイングボートに入れます。シリコーンエラストマーと硬化剤のポリジメチルシロキサン（PDMS）を10:1の比率で混合します。PDMS混合液をSU-8マスターに注ぎ、気泡を除去するため、ウェイイングボートに入れたまま真空デシケーター内に放置します。PDMSを65 °Cで1〜2時間硬化させます。PDMSの硬化後、ホールパンチを使用して流体デバイス用の2つの流入口と1つの流出口を形成し、PDMSストリップをシリコンマスターモールドから剥がします。PDMSストリップとカバーガラスをエタノールで洗浄し、風乾させます。洗浄したPDMSストリップとカバーガラスを20 wattsの酸素プラズマで処理します。まず、PDMSストリップをカバーガラスに直ちに接合します。接合したマイクロ流体チップを95 °Cのオーブンに入れ、一晩放置します。接合強度を高めるためには、プラズマ処理と一晩のベーキングが不可欠です。試薬を導入する前に、マイクロ流路内に気泡がないことを確認するため、水で満たします。これにより、スムーズな流れが確保されます。実験中は、あらかじめ調製したQD、標識DNA、およびsci-fi標識キトサン溶液を、チューブを介して2本の個別のガラス製シリンジに充填します。マイクロ流体デバイスの2つの入口にチューブを接続します。この際、気泡が混入しないよう注意してください。層流条件下で、流速を20 nanoliters per minuteに設定します。流速が安定してからの約15分から20分後に、顕微鏡下でマイクロチャネルを確認します。チャネルの中央にQD介在性のFRETが観察されるはずです。冷却CCDカメラを用いて、チャネルに沿った異なる位置で蛍光画像を取得します。これらの画像をImage JおよびOriginLabで解析します。FRET介在信号は、チャネルに沿った異なる軸方向の位置でモニタリングされます。滞在時間は、以下の式を用いて、適用された流量に基づいて算出されます。ここでTISAバーが滞在時間を表します。時間Xは、2つの流れが合流する地点から調査対象の反応位置までの距離です。また、Vは平均流速です。これにより、本システムにおいてFRET介在性のSCI-Fi信号の断面強度プロファイルを解析することが可能になります。実験的に測定されたプロファイルはガウス分布を示しています。ここまで、単純なマイクロ流体チャネル内の量子媒介スレッドを通じて、DNAネイル複合体をモニタリングする方法について説明しました。これらの手順を行う際は、適用した流量とチャネルの形状に基づいて滞留時間を直線的に算出できるよう、マイクロ流体チャネルにマーカーを設計することが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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ここでは、1分子イメージング法であるDNAカーテンを使用して、DNA上に集合するEWS-FLI1凝縮物の生物物理学的メカニズムを研究します。...

DNA上に集合したEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング

マイクロ流体チャンバーを介して研究される視覚的な単一分子生化学は、ガラスバレル、気密シリンジ、チューブとフローセルへのチューブの安定した接続、およびシリンジとチューブの間に切り替えバルブを配置することによる気泡の除去を使用して大幅に促進されます。このプロトコルは、DNAトランザクションと分子間相互作用の視覚化を可能にするデュアルオプティカルトラップを記述します。...

1分子研究のためのデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学の使用

学ぶQD-FRETとマイクロ流体を組み合わせたDNAナノコンプレックスの自己組織化リアルタイム監視法。静電気的相互作用によるポリエレクトロライト複合体形成過程を可視化し、遺伝子治療への応用可能性を探索します。

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

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