Name: 共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学ぶ成体ラット心筋細胞の単離培養とアデノウイルス遺伝子導入による蛍光タンパク質発現法。共焦点顕微鏡で細胞構造を可視化し、心臓生理学や薬理学的研究に応用する手法を解説します。

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この作品は、ドイツの国立科学財団（DFG）およびリスク評価のための連邦研究所（BfRは、ドイツ）によってサポートされていました。

<ol><li>Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Molecular+Imaging+II%22">Molecular Imaging II</a>. Licha, K., Lin, C. P. Vol. 7370, SPIE. Bellingham. 737008-737008 (2009).</li>
<li>Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).</li>
<li>Shorte, S. L., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22">Imaging Cellular and Molecular Biological Functions</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. 289-289 (2007).</li>
<li>Kaestner, L., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Optics+in+Life+Science%22">Optics in Life Science</a>. Popp, J., von Bally, G. Vol. 6633, SPIE. Munich. 66330K-66330K (2007).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).</li>
</ol>

ラット心筋細胞の単離のために説明する手順は、必要に応じて他の種、例えばマウス4に適合させることができます。適応を必要とするパラメータは、消化のための酵素ミックス（下記参照）、また、消化の期間です。一部の種（例えばマウス）の細胞が他の人（例えばラット）よりも壊れやすいかもしれないことに注意してください。 コラゲナーゼの選択は、おそらく分離手順の中で最も重要なステップです。それは事実上無バッチ間のばらつきを持つ合成酵素ミックスなので、我々は、リベラーゼBlendzymeを選択します。従来の方法も有効な方法であるクロストリジウムヒストリ、から抽出された、いわゆる原油コラゲナーゼの使用です。しかし、バッチ間のばらつきは、それぞれの新しいバッチのための新しい最適化が必要です。 離れて蛍光融合タンパク質とGEBの伝達からアデノウイルス遺伝子導入は、機能性タンパク質またはそれらのダウンレギュレーション（RNAiの5によるなど）の過剰発現のために使用することができます。導入効率が高い（&gt; 95...

<table><tbody><tr><td>麻酔液</td><td>Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin)、Bayer Health Care (Rompun)</td><td></td><td>1 mlのUrsotamin (100 mg/ml ケタミン塩酸塩) と 240 &amp;#x03BC;lのRompun (2% キラジリン塩酸塩) の混合液</td></tr><tr><td>クエン酸溶液</td><td></td><td></td><td>10 mlの0.9% NaCl溶液に117,64 mgのクエン酸ナトリウムを溶解</td></tr><tr><td>溶液A</td><td></td><td></td><td>134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.2 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 10 mM HEPES、10 M NaOHを用いてpH 7.35に調整し、滅菌フィルターろ過</td></tr><tr><td>溶液A+</td><td></td><td></td><td>溶液Aの組成に0.2 mM EGTAを添加し、10 M NaOHを用いてpH 7.35に調整し、滅菌フィルターろ過</td></tr><tr><td>Liberase溶液</td><td>F. Hoffmann&amp;#8208; La Roche Ltd.</td><td>11988476 001</td><td>15 mlの溶液Aに、ストック溶液を500 &amp;#x03BC;l添加 (ストック溶液：蒸留水に10 mg/ml Liberase Blendzyme 4を溶解)</td></tr><tr><td>溶液B</td><td></td><td></td><td>溶液Aの組成に200 &amp;#x03BC;M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;および0.1% DNase溶液を添加</td></tr><tr><td>溶液B&lt;sub&gt;1/2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>溶液Aと溶液Bを1:1で混合</td></tr><tr><td>DNase溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>牛膵臓由来Deoxyribonuclease I (Type 2) 40 KU (15 mg) を、pH 7.35に調整した5 mlの10 mM Tris&amp;#8208;HClバッファーに溶解。追加組成：50 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM dithi&amp;#8211;rythritol。この溶液を5 mlのグリセロールと混合する</td></tr><tr><td>細胞外マトリックス（ECM）タンパク質溶液</td><td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td><td>E1270</td><td>購入したストック溶液1 mlを6 mLのM199培地で希釈</td></tr><tr><td>培養培地M199</td><td>PAA Laboratories</td><td>E15&amp;#8208;834</td><td>ITS溶液を1 &amp;#x03BC;l/ml、およびペニシリン&amp;#8208;ストレプトマイシン溶液 (5000 units/ml) を20 &amp;#x03BC;l/ml添加したM199培地</td></tr><tr><td>ITS溶液</td><td></td><td></td><td>25 mgのインスリン、25 mgのトランスフェリン、および50 &amp;#x03BC;lの亜セレン酸ストック溶液を5 mlの蒸留水に溶解 (ストック溶液：蒸留水に0.5 mg/ml 亜セレン酸ナトリウムを溶解)。溶液が透明になるまで1 M HClを数滴加える。分注して凍結保存可能</td></tr><tr><td>タイロッド液</td><td></td><td></td><td>135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10 mM glucose, 10 mM HEPES、10 M NaOHを用いてpH 7.35に調整し、滅菌フィルターろ過</td></tr><tr><td>マスターミックス</td><td></td><td></td><td>サンプルあたり：5 &amp;#x03BC;l 10&amp;#215;PCR&amp;#8208;バッファー, 5 &amp;#x03BC;l MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (25 mM), 2 &amp;#x03BC;l フォワードプライマー, 2 &amp;#x03BC;l リバースプライマー, 1 &amp;#x03BC;l dNTP&amp;#180;s (各10 mM), 33 &amp;#x03BC;l H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1 &amp;#x03BC;l DMSO, 1 &amp;#x03BC;l Taq&amp;#8208;DNAポリメラーゼ</td></tr><tr><td>LB&amp;#8208;培地</td><td></td><td></td><td>10 g/l トリプトペプトン, 5 g/l 酵母エキス, 5 g/l NaCl (固体培地として使用する場合は15 g/l Agarを添加), pH 7.0</td></tr><tr><td>Pac I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547L</td><td>調製：50 &amp;#x03BC;g DNA, 5 &amp;#x03BC;l 10&amp;#215;バッファー, 0.5 &amp;#x03BC;l 100&amp;#215;BSA, 0.75 &amp;#x03BC;l Pac I を加え、H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Oで最終容量を50&amp;#x03BC;lにする</td></tr></tbody></table>

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

成人の心臓から単離された心筋細胞は広くどこかにモデル片側の胚および新生児の筋細胞と他の上で働く心臓の間に半分の方法として受け入れられています。従って、心筋細胞は心臓細胞生理および病態生理のため、医薬品の調査のためだけでなく、トランスジェニック動物モデルを検証するための良いモデルとなる。ここでは、心臓から細胞を単離する方法を説明します。さらに我々は心筋細胞で遺伝子操作がトランスジェニック動物を飼育することなく実行できる方法を示します：これは長期の培養（1週間）とアデノウイルス遺伝子導入を組み合わせたものです。後者は、ウイルスの構造から細胞の形質導入に記述されています。それは、RNAiを用いて、例えば、発現とダウンレギュレーションを介して遺伝的に符号化されたバイオセンサー（GEBs）、蛍光融合タンパク質を発現させるためだけでなく、蛋白質に使用することができます。ここでは、細胞内構造（ゴルジ体）を染色する融合タンパク質を発現させるための例を提供しています。このようなタンパク質の発現は、細胞内構造の3次元再構築のためのz -スタックの共焦点イメージングで可視化することができる。プロトコルは、細胞培養、分子生物学と生物物理学の最先端を構成し、従って細胞の心臓病の新たな地平を探索するためのアプローチを提供します。

成人心筋細胞は動物の心臓から分離し、数日間培養することができる主要な細胞である。この培養期間内にアデノウイルス遺伝子導入は、遺伝的に符号化されたバイオセンサー（GEBs）または蛍光融合タンパク質を発現させることができる。両方のアプローチは、共焦点顕微鏡による細胞の調査を許可する。

成体心臓から単離された心筋細胞は、一方に胚性および新生児期の筋細胞があり、もう一方に……という、その中間に位置するモデルとして広く認められています。

まず、成体ラットから心臓を摘出します。心臓を消化し、単一の心筋細胞を単離します。単離した細胞を培養します。アデノウイルスによる遺伝子導入により、蛍光融合タンパク質または遺伝子コード型バイオセンサーが発現します。レポータータンパク質を発現している心筋細胞を共焦点顕微鏡で可視化し、さらに解析を行います。こんにちは、私はSland大学医学部分子細胞生物学研究所のKainです。私は同じく分子細胞生物学研究所のLarsです。そして、同じ研究室のuncleです。本日は、蛍光融合タンパク質または遺伝子組み込み型バイオセンサーを導入した心筋細胞の単離手順、およびそれに先立つ共焦点イメージングの手順について解説します。当研究室では、細胞レベルで心臓の生理学、病態生理学、および薬理学を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めましょう。本手順を開始するために、LOR灌流セットを準備し、すべての溶液を調製して充填し、装置を37 °Cに予熱します。すべての溶液が酸素で飽和しており、チューブ内からすべての気泡が除去されていることを確認してください。体重約250 gの6〜12週齢の成体雄性Wistarラットを使用し、動物のハンドリングを容易にするため、二酸化炭素吸入によりあらかじめ鎮静させます。麻酔は、体重100gあたり170µLの麻酔液を腹腔内投与することで行います。さらに、手術中の血液凝固を防ぐため、体重1gあたり2µLのクエン酸溶液を注射します。ラットが麻酔状態になったら、手術台に固定し、身体の上部を70% ethanolで消毒します。頸動脈を切断して動物を安楽死させた後、ハサミを用いて胸腔を開きます。心臓と大動脈が露出したら、心膜を除去します。26ゲージの針を用いて、心停止および血液の洗い出しを行うため、両心室に氷冷したSolution A+を5 mL注入します。次に、クランプで大動脈を掴み、大動脈から最初の分枝が生じる大動脈弓の箇所で切断します。切断後、胸部から心臓を取り出し、ピンセットとクランプを用いて大動脈を灌流装置のカニューレに接続します。この際、大動脈弁を損傷させないよう注意してください。心臓を大動脈の結紮によって固定します。カニューレ、アセンブリ、および開放血管も同様に結紮する必要があります。その後、酸素飽和溶液を用いて心臓の逆行性灌流を行い、室温で約70 millibarの圧力で10分間維持します。10分後、大動脈に気泡が入っていないことを確認します。灌流液を37 °Cのライアゼ溶液に切り替え、ペリスタポンプを用いて4 mL/minの速度で約25分間灌流します。灌流終了時に、心臓がマーブル状の白色を呈している必要があります。消化時間は心臓のサイズに応じて調整してください。リアーゼ溶液で消化した後、灌流装置から心臓を取り出し、溶液Aを入れたペトリ皿に置きます

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Biology

生物学

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

野生型および突然変異マウスの個々の心筋細胞を心臓から分離し、その収縮性とカルシウム過渡性を研究することができます。これにより、細胞機能障害が何らかの原因から心臓機能障害に寄与していることを特徴付けることができます。...

マウス心筋細胞の単離と生理解析

我々は、成体マウス心筋細胞の単離のための信頼できる方法を記載している。このプロトコルは、遺伝子改変マウスの様々から機能大人の心筋細胞の培養のための一貫性のある結果が得られます。...

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

心筋細胞では、管状の膜構造は、細胞内のネットワークを形成している。私たちは、品質管理、最先端の蛍光顕微鏡用ii）の生細胞染色を含むマウスの心臓から心筋細胞のi）の単離のためのプロトコルを最適化について説明し、およびiii）直接画像解析は、コンポーネントの複雑さおよび細胞内膜の可塑性を定量化するネットワーク。...

心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析

このプロトコルは、成体マウス心筋細胞の再現性のある単離と長期培養のための段階的な方法を説明しています。これは、高収率、純度、および生存率を備えています。...

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

このプロトコルは、チャンク消化アプローチを使用して、成人マウス心臓から単一の心筋細胞を単一の心筋細胞を分離するために使用される。このアプローチは、パッチクランプ研究で心房筋細胞電気生理学を特徴付けるために使用できる右または左心房筋細胞を単離するために使用されます。...

成体マウスからの心房筋細胞の単離

マウス筋細胞の単離の方法論と、同時デジタル細胞幾何学的測定と蛍光光光測定を用いたサルコメア短縮トレースと同時に電圧またはカルシウムの痕跡を得る方法を提示する。...

単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

本研究の目的は、心筋細胞を成体から再現的に単離し、DNAの含有量と核形成を測定する方法を開発することです。...

免疫細胞化学とプロイド分析のための固定心からの心筋細胞の分離

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

このプロトコルは、成体マウスからの心房および心室筋細胞の同時分離のための大歯カンヌレーションの深さを含むランゲンドルフ法の修飾を記述する。...

成体マウスからの心房と心室筋細胞の同時分離のためのランゲンドルフ法の改変

細胞および分子機能実験の心臓病学のゴールドスタンダードは心筋細胞です。この記事では、マウス心筋細胞を単離するための非ランゲンドルフ法への適応について説明します。...

マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

学ぶ成体ラット心筋細胞の単離培養とアデノウイルス遺伝子導入による蛍光タンパク質発現法。共焦点顕微鏡で細胞構造を可視化し、心臓生理学や薬理学的研究に応用する手法を解説します。

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

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