Name: LAD -ライゲーション：心筋梗塞のマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-14T23:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶマウス心筋梗塞モデルにおけるLAD結紮術の外科的手法。気管挿管、左側開胸、冠動脈結紮を含む手技を解説し、虚血性心疾患の病態生理研究と治療法開発への応用を示します。

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著者は、彼女の技術支援と実行組織学のためにクリスティPahrmannに感謝。

<html> 8から12週齢で20gの最小の重量を量るのBalb / Cマウスをチャールズリバー（Sandhoferウェグ7、D - 97633 Sulzfeld）から購入しています。 マウスは、通常の条件、飼育、標準のマウスのペレットと水を自由の下に収容されています。誘導チャンバーを用いて（2％）イソフルランでマウスを麻酔。 <ol><li>首の領域と胸郭の左側にひげをそると80％エタノールを用いて消毒する。 </li><li>その背中にマウスを置き、麻酔を維持するために、その鼻と口にフェイスマスクを置く。 </li><li>マウスが十分anesthesizedであることを確認するために、尾と後ろ足の足をつまんで反射神経をチェックしてください。 </li><li>微視的な視点の下で気管を覆う皮膚、筋肉や組織を分離する正中頸部切開を行います。 </li><li>気管は、気管内チューブ（図1）を挿入するには声門下の2つのカートリッジの環の間の組織に小さな穴をカットさらされている場合。マイクロ手術foreceptsを使用して気管の頭蓋の一部を保持する気管内チューブを挿入します。両方の肺がよく換気されていることを確認するために胸部の動きを確認してください。 </li><li>呼吸速度（RR）は、17〜18センチメートルH 2 Oの吸気圧で、約110分毎にする必要がありますその左側に面して、その右側に横たわって、慎重にマウスを回す。 3番目と4 番目の肋骨の間にleftsided開胸を行い、出血を防ぐために焼灼器を使用して、慎重に組織や筋肉を細かく分析。 </li><li>胸部が開かれると、慎重に胸部を開き、任意のとがったもので肺に触れることなく、心を見つける。今の心を覆っている心膜の一部を削除してください。 </li><li> LADは、肺動脈と左心耳の間に位置しています。一つの縫合（図2）と近位LADを連結する8から0 Proleneの縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を使用してください。 </li><li> 4 番目と5 番目のリブの間に胸腔チューブを（28G、腐敗したカテーテル）、置きます。 </li><li>肋骨と皮膚を閉じるには、縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を実行して4から0 Proleneを適応させるために6から0 Prolene実行されている縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を使用して、レイヤーの胸部切開を閉じます。 </li><li>慎重に2ミリリットル注射器（図3）の助けを借りて胸部を排出します。その背中にマウスを置きます。今すぐ気管内チューブを取り出して、7から0 Prolene縫合を（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）使用して、1つのシングルステッチで気管カートリッジのリングを適応させる。 </li><li>マウスの顔のマスクを置き、4から0 Prolene実行されている縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を使用して皮膚を閉じます。 </li></ol>検証 LAD -ライゲーションの成功を確認するために、異なる可能性があります。 トロポニンテストは、動物を安楽死させることなく、唯一の150リットルの血液を使用して、手術後6時間から18時間を行うことができます。血液は、カスタマイズされたトロポニンテストキット（過度にTセンシティブ、ロシュ、マンハイム）（図4）に適用されます。トロポニンが筋細胞のアクチンフィラメントの調節的蛋白質である、筋肉の3つのタイプの異なるアイソタイプがあります。アイソタイプcTnIとcTnTを中心に発見され、組織損傷にリリースされます。トロポニンT（cTnT）のための標準化されたテストは、2つの心臓特異的モノクローナル抗体を、一つのトラップ血液試料中のトロポニンに基づいている、もう一つはマーカーです。 梗塞部位は、3日間（図5）の後に肉眼的に識別できます。 TTC（2,3,5 - 塩化トリフェニルテトラゾリウム）染色対策組織の生存率は梗塞サイズを評価するために使用。エバンスブルー色素（1,5％、1.0mL）中のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）は心筋の虚血領域を測定するために左室内腔に注入される。マウスを安楽死であり、心臓はスライスに採取し、切片化されています。組織切片は20分、37 ° Cで1​​％TTC PBS溶液、pH7.4でインキュベートする。組織は2〜8℃で一晩PBS -バッファ、10％ホルマリンで固定されている℃のTTCは、色素エバンスブルー陰性の領域（図6）にex vivoで投与される。 組織学のためにマウスは安楽死されなければならないと心はさらなる処理のために埋め込まれなければなりません。パラフィン切片を実行した後、スライドはH＆E（ヘマトキシリン​​とエオジン）で染色または線維性組織（図7）を可視化するために三色のされています。 <img src="/files/ftp_upload/1438/1438fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：気管チューブ。 1A：気管を露出、腹側頸部切開後。 1B：気管は喉頭に尾two軟骨リングを開かれます。 1C：気管チューブを気管に挿入されます。 <img src="/files/ftp_upload/1438/1438fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：心臓が左サイド開胸を介して公開され、LADを結紮される。 t&quot;は&gt; <img src="/files/ftp_upload/1438/1438fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：胸部を閉じた後、胸膜のドレインが行われる。マウスは、麻酔下ではまだです。 <img src="/files/ftp_upload/1438/1438fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：トロポニンテストが陽性の場合に2行には、数分後に表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1438/1438fig5.jpg" alt="図5" /> 図5：植心臓を表示します。 5A：色あせた白っぽい色で虚血領域と心のマクロビュー。 5B：梗塞心臓の断面図、虚血領域は、右上隅に表示されます。

<ol><li>Atkins, B. Z., Hueman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+cardiomyoplasty+improves+diastolic+properties+of+injured+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular cardiomyoplasty improves diastolic properties of injured Heart.</a> J Surg Res. 85 (2), 234-242 (1999).</li>
<li>Jaquet, K., KT, K. rause <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+myocardial+scar+size+after+implantation+of+mesenchymal+stem+cells+in+rats%3A+what+is+the+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism.</a> Stem Cells Dev. 14 (3), 299-309 (2005).</li>
<li>Joung, B., Kim, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mononuclear+stem+cells+transplanted+in+rat+infarct+myocardium+improved+the+electrical+conduction+without+evidence+of+proarrhythmic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med+J%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mononuclear stem cells transplanted in rat infarct myocardium improved the electrical conduction without evidence of proarrhythmic effects.</a> Yonsei Med J. 48 (5), 754-764 (2007).</li>
</ol>

資金本研究は、大学病院ハンブルク（MK、女性ハビリテーショングラント）、DFG（SS、SCHR992/3-1）、ISHLT（TD、研究賞2009年）によってサポートされていました。 文すべての動物は、動物実験は医学研究とによって公開実験動物の管理と利用のためのガイドのための国立協会が定めるガイドラインおよび規制に準拠して行われた、実験動物のケアの原則に準拠して人間のケアを受け国立衛生研究所（厚生出版物85から23の国立研究所、1985年改訂）。 すべての動物は、チャールズリバーラボラトリーズ（Sulzfeld、ドイツ）から入手し、大学病院ハンブルクエッペンドルフの動物医療施設で維持した。動物は、標準の固形飼料と水を自由に摂取を受けた。

要約すると、このビデオでは、LAD -ライゲーションモデルのステップバイステップを視覚化し、容易に実現可能な外科的処置として、マウスのLAD -ライゲーションを識別します。

lad -ライゲーション：心筋梗塞のマウスモデル

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

心筋梗塞や心筋虚血の研究のモデルは、心筋虚血の急性および慢性のpathobiologicalと病態生理学的プロセスを調査し、将来の治療法の開発と最適化するために不可欠です。 心筋虚血を作成するための二つの異なる方法が実験用げっ歯類で実行されます。最初の方法は、低温ペンが心臓（1-3）の表面に適用されているクライオ心筋梗塞、高速だが不正確なテクニックを、作成することです。科学者は、クライオ傷跡が虚血につながることを保証できない場合、このメソッドを使用して、また広大な心筋障害は、心筋梗塞に関連していない病態生理学的な副作用を示すことが作成されます。第二の方法は、左前下行枝（LAD）の恒久的なライゲーションです。ここでLADはほぼ即座に見ることができる虚血を形成し、単一のステッチと連結する。周囲の心筋組織がほとんど影響されないままLADを閉じることで、それ以上の血流は、その領域で許可されていません。この手術は、心筋梗塞に関連する心筋虚血の発生pathobiologicalと病態生理学的側面を模倣する。 このビデオで紹介した方法では、LADを結紮することにより、マウスの心筋梗塞モデルの外科的手順を示しています。このモデルでは、心筋梗塞でpathobiologicalおよび病態生理学的ならびに免疫生物学的研究のために便利です。示した手法は、高い精度を提供し、組織切片とよく相関している。

このビデオでは、心筋虚血のpathobiologicalと病態生理学的プロセスを研究するために高速で信頼性の高いモデルを使用する方法を示します。

LAD -ライゲーション：心筋梗塞のマウスモデル

梗塞および心筋虚血の研究モデルは、急性および慢性の病理生物学的および病態生理学的プロセスを調査するために不可欠です...

正中頚部切開を行い気管を露出させ、気管に小さな穴を開けて気管内チューブを挿入します。マウスを右側臥位にし、第3肋骨と第4肋骨の間で左側胸腔切開を行います。心臓を露出させ、LADを単結紮で結紮します。胸腔ドレーンを挿入し切開部を閉じた後、シリンジで慎重に吸引して胸腔内をドレナージします。最後に、マウスを仰向けにします。気管チューブを抜去し、気管および頸部の切開部を閉鎖します。こんにちは、Sonya Refaです。私はハンブルク大学心臓センター心臓血管外科の免疫学および心臓外科の教授です。私の研究室では、幹細胞免疫生物学および移植免疫学に重点を置いて研究を行っています。本日は、LID結紮モデルについてご紹介します。当研究室では、心筋梗塞後の心臓再生に対する幹細胞療法の効果を研究するために、このモデルを使用しています。スタンフォード大学の学生であり、Drer教授のTSI研究室のサマーフェローであるKA Wanです。そして、ハンブルク大学心臓センターTSI研究室のMandy Coochです。今回は、左前下降枝結紮術の実施方法について説明し、その後、さまざまな方法を用いて心筋梗塞の成功を確認する方法を紹介します。それでは開始します。麻酔をかけたマウスの頸部と肋骨の左側を剃毛します。マウスを背臥位にし、鼻と口にフェイスマスクを装着して、2% isof fluorine で麻酔を維持します。手術を開始する前にベータアイソフルランを用い、マウスの尾と後肢をつまんで、十分に麻酔がかかっていることを確認します。顕微鏡下で、気管を覆う皮膚、筋肉、組織を分離するように、頚部正中切開を行います。気管が露出したら、声門下の2つの軟骨輪の間の組織に小さな穴を開け、気管内チューブを挿入します。気管の頭側を保持しながら、気管内チューブを挿入します。マイクロサージカル鉗子を用いて胸部の動きを確認し、両肺が十分に換気されていることを確かめます。呼吸数は毎分約110回、吸気圧は17〜18 cmH2Oに設定してください。マウスを慎重に回転させ、左側を向いた状態で右側を下にして寝かせます。第3肋骨と第4肋骨の間で左側胸腔切開を行い、組織と筋肉を剥離します。止血には慎重にコヘア（止血鉗子）を使用してください。胸郭を慎重に開きます。胸郭を開いた後、鋭利な器具で肺に触れないように注意しながら心臓を確認します。次に、心臓を覆っている心膜の一部を除去します。LADは肺動脈と左前下行枝の間に位置しています。近位LADを8-0プロリン縫合糸1本で固定します。気管内チューブを挿入し、第4肋間と第5肋間の間に28ゲージの静脈カテーテルを留置します。6-0プロリンの連続縫合で肋骨を固定し、4-0プロリンの連続縫合を用いて、胸部の切開部を層状に閉鎖します。皮膚を閉鎖する前に、2 mLシリンジを用いて胸腔内を慎重にドレナージします。ドレナージ後、マウスを仰向けにしてください。マウスにフェイスマスクを装着し、気管内チューブを抜去します。7-0 Prolene縫合糸を用いて1針で気管カニューレのリングを固定し、4-0 Proleneの連続縫合で皮膚を閉鎖します。本研究では、LAD結紮マウスモデルが心筋梗塞を誘発するための簡便かつ信頼性の高い手法であることを示しました。心筋梗塞が正常に誘発されたかを確認する方法はいくつかあります。その一つがトロポニン検査であり、マウスから採取した150 µLの血液を専用のトロポニン検査キットに適用します。数分後に2本のラインが現れる陽性結果は、組織損傷により心臓からトロポニンTが放出されたことを示しています。心筋梗塞が正常に誘発されたかを確認するためのもう一つの手法は、心臓の横断面を 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）で染色し、組織の生存能を測定して梗塞サイズを評価することです。心臓をTTCで覆い、37 °Cで20分間インキュベートします。生存組織は赤色に染まり、梗塞領域は白色に現れます。最後に、マウスの心臓をパラフィン包埋し、組織学的に切片を作成します。切片をトリクローム染色し、線維化組織を可視化します。以上で、マウスにおけるLID結紮の手順を説明しました。LID結紮の数時間後、あるいは数週間後に、心筋梗塞が成功したことを確認するためのさまざまな方法を説明しました。肺損傷を避けるため、肺組織には触れないようにすることが重要です。以上で終了です。ビデオをご視聴いただきありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

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Biology

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