人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のRNAを取得

我々は、死後、人間の脳の上側頭回の層IIIの均質な細胞集団、錐体細胞からRNAを分離して抽出するためにレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用してプロセスを説明します。私たちは、その後直線的に（T7ベース）mRNAを増幅し、Affymetrix社人間X3Pマイクロアレイにサンプルをハイブリダイズする。

この手順は、摂氏マイナス17度に設定されたクライオスタット上で8マイクロメートルの液体窒素蒸気凍結組織ブロックを無負荷のスライドガラス上に切片化することから始まります。その後、切片をhisto遺伝子染色キットで染色します。錐体ニューロンを同定した後、約500個の細胞をHSキャプチャキャップにレーザー捕捉します。

細胞の入ったキャップを、50マイクロリットルの抽出バッファーを逆さまにして入れたマイクロ遠心チューブに入れ、以前にイラクで設置されていたファルコンチューブに入れ、摂氏42度に設定された水浴に座らせます。短い遠心分離ステップの後、キャップを取り外します。その後、残りの溶液はRNA単離の準備が整います。

こんにちは、マクリーン病院の構造分子神経科学科のウィルソン・ウー研究室のシャーメイン・ピーターソンです。今日は、ヒトの死後脳組織からパラメタルニューロンをレーザーキャプチャする手順をご紹介します。当研究室では、この手法を用いて、統合失調症患者の上回回と不良回における遺伝子発現の差次をマイクロアレイ技術を用いて研究しています。

それでは始めましょう。脳組織は、組織切片化の前に、Harvard Brain Tissue Resource Centerから液体窒素蒸気凍結ブロックとして取得されました。RNAの汚染を減らすことが重要です 作業エリア、切片作成ブレード、スライドを含むすべての表面は、RNA SAPなどのRNA除染液で処理され、100%エタノールで拭き取りられます。

この手順は、マイナス17°Cに設定されたクライオスタット上の液体窒素蒸気凍結組織ブロックを、無負荷のスライドガラス上に切片化することから始まります。これで、組織切片は、histo gene quick staining kitを使用して錐体ニューロンを同定する準備が整いました。エタノール脱水シリーズを調製し、25ミリリットルの適切なエタノール濃度とRNAフリー水をhisto遺伝子キットに付属の染色ジャーに入れます。

75%エタノールジャー1つを除いて、すべてのジャーをアイスバケツに入れます。その75%エタノールをマイナス20°Cの冷凍庫に入れます。次に、染色液100マイクロリットルあたり1マイクロリットルのRNA阻害剤を添加して染色液を調製します。

2枚のスライドで4つの組織切片を染色するため、マイクロ遠心チューブ内の400マイクロリットルの染色溶液に4マイクロリットルのRNA阻害剤を添加します。染色液を氷の上に置いてください。ヒュームフードの下。

キシレンジャーにモレキュラーシーブを追加して余分な水分を取り除きますが、これは組織の持ち上げを損なう可能性があります。温度を摂氏42度に設定してウォーターバスのスイッチを入れ、ラックで支えられた50ミリリットルのファルコンチューブをウォーターバスに入れます。マイナス80°Cの冷凍庫から2つのスライドを取り出し、キムワイプで解凍します。

約30秒間、またはスライドの角が解凍され始めるまで、マイナス20°Cの冷凍庫で組織を75%エタノールに30秒間短時間固定します。次に、RNAフリー鉗子を使用して、スライドをヌクレアーゼフリー水に移し、32回目の洗浄を行います スライドを洗浄した後、PAPバリアペンで切片の輪郭を描き、染色溶液を切片に集中させます ヒスト遺伝子染色溶液で4つの切片を20秒間染色します。セクションあたり97マイクロリットルのステインスラッシュRNA阻害剤を使用して、ステップごとに30秒間、氷上で事前に調製したエタノールの切片を脱水します。

最後の100%エタノールステップは、適切な組織リフトのための十分な脱水を達成するために3分に延長する必要があります。.最後に、スライドをキシレンに5分間浸し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションに進む前にスライドを完全に風乾させ、シングルセルレーザーキャプチャーの手順を染色した後、錐体ニューロンを直ちに除去する必要があります。MICRODISSECTIONまたはLCMは、以前に設定されたaによって支えられた50ミリリットルのファルコンチューブを含む摂氏42度の水浴を必要とします。

シングルセルLCMは、ARCTURUS XTレーザーキャプチャシステムとソフトウェアで実現されます。この手順を開始するには、スライドとキャップをarcturus XT装置にロードします。キャプチャHSキャップを使用しますが、プログラム設定はマクロのままにします。

ボックスロードの概要をクリックして、各スライドの概要写真を取得します。輝度の焦点を2倍の倍率で調整して、レーザーキャプチャに最適なセクションを決定します。過度に折りたたまれている組織切片は避け、無傷で滑らかで汚れた切片を選択してください。

キャプチャする一般的な領域にキャップをしっかりと置き、キャプチャする領域をケースに含めるようにしてください。皮質のレイヤー3。キャップレールが折り目の上に乗らないようにしてください。これによりキャップが傾き、スポットサイズが変動します。

次に、40倍の倍率でIRレーザースポットの位置を手動で確認します。青い十字は、IRレーザースポットの中央に配置する必要があります。そうでない場合は、スポットを右クリックして、配置されたIRスポットを選択して、その位置を調整します。

40倍の拡大で、次の基準に従って錐体ニューロンを特定します、1つは私たちのピラミッド型の形状を細胞化し、2つは、頂端および/または基底樹状突起の近位部分が識別可能です。位置機能のプラス記号をクリックして、キャップの位置を保存します。このように、キャップを動かしても、スポットサイズを調整したのとまったく同じ場所に常に

これらの値をコントロールボックスに入力します:70を電源に、16を期間に入力します。これらのパラメータは当社の組織に固有のものであるため、開始する前に、特定の組織サンプルに応じてこれらの変数をテストし、調整することをお勧めします。単一セルのレーザーキャプチャでは、自動移動ステージオプションをオフにし、正しいサイズのシンボルが右側のパネル上のシンボルと相関していることを確認します。

右下の円のオプションを選択して、キャプチャをテストするニューロンを選択します。そして、青い十字を円に合わせた後、テストIRスポットをクリックしてレーザーをアクティブにします。レーザーによって作られたスポットは、まず、キャプチャされたオブジェクトの周りに鮮明な暗いリングを持っている必要があります。

リングが細胞を囲むのに十分な大きさであるが、不要な組織や他の細胞を含まないほど小さいことを確認してください。このリングが軽すぎる場合、セルは捕捉されていません。ダークリングの中央にダークスポットがある場合、レーザー強度のスラッシュ持続時間が長すぎます。

キャプチャするレイヤー内の組織のさまざまな部分でこのプロセスを繰り返します。場所によってスポットサイズに差がないように、それに応じて調整してください。約500個の細胞を捕捉するための錐体ニューロンを同定します。

レーザーキャプチャボタンを押して細胞をキャプチャします。キャップをQCステーションに移動します。ニューロンの少なくとも90%が除去されたことを確認してください。

そうでない場合は、ほとんどのセルがキャプチャされた領域で、より多くのセルをキャプチャします。キャップを50マイクロリットルの抽出バッファーが入った0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。キャップは、バッファーの漏れを防ぐために完全にフィットするように設計されています。

アセンブリを逆さまにして、抽出バッファーがキャップ全体を覆っていることを確認し、摂氏42度に設定されたウォーターバスの50ミリリットルのファルコンチューブの底に置きます。インキュベーション後、ニューロンを30分間インキュベートしてキャップから組織を取り出し、チューブとキャップアセンブリを800 gで2分間遠心分離します。遠心分離後、キャップを取り外します。

RNAの分離が後でのみ行われる場合。残りの細胞抽出物は摂氏マイナス80度で保存します。それ以外の場合は、次のセクションに示すように、細胞抽出物からのRNAの単離を進め、LCMサンプルから少数の細胞を単離し、少量のmRNAを保持するように設計されたPICO純分キットを使用してRNA単離を行います。

この手順を開始するには、キットに付属の70%エタノールを細胞抽出物に加え、前処理済みの精製カラムで遠心分離します。洗浄後にRNAをカラムフィルターに結合させるためには、DNA干渉のリスクを排除するために、RNAをDNsで処理します。この手順は、リアルタイム R-T-P-C-R などのダウンストリーム アプリケーションで特に重要です。

DNAの消化は洗浄緩衝液1の40マイクロリットルを加え、8、000 Gs.Afterで15秒間精製カラムを遠心分離した後、キットに付属のプロトコルに従って洗浄を進めるが、洗浄緩衝液2で最終洗浄ステップを2から2分半に延長して、カラムに洗浄緩衝液が残っていないことを確認します。 これにより、RNAの収量が減少する可能性があります。カラムを別のマイクロ遠心チューブに移します。elucianバッファーを添加し、カラム内のフィルターで1分間インキュベートし、カラムを遠心分離してRNAを溶出します。

最後に、Experian High Senseラボチップを実行して、1.3マイクロリットルのサンプルを0.5ミリリットルのチューブに仮想ゲルおよびエレクトロフェログラムピペットで供給して、抽出したRNAの品質を確認します。品質管理試験では、残りのサンプルを摂氏マイナス80度で凍結します。RNAの品質が確認されたら、RNAによって増幅し、標識してハイブリダイズすることができます。

遺伝子発現プロファイリング解析では、ribo amp HS plusキットを使用して2ラウンドの線形増幅を行い、マイクロアレイとQ-R-T-P-C-R実験の両方の性能に十分な約50マイクログラムの増幅RNAが得られるはずです。ターボビオチン標識キットと分子デバイスからの標識は、増幅されたRNAの標識に使用されます。最後に、atrixのヒトX3P遺伝子チッププロベレートを用いた遺伝子発現プロファイリングを行います。

組織切片化では、スライドごとに2つの切片を持つ2つのスライド、ケースごとに合計4つの切片を作成する必要があります。各セクションは、裂け目、ひび割れ、または折り畳みを最小限に抑えて滑らかである必要があります。錐体ニューロンは、ピラミッド型の形状と目に見える頂端樹状突起で、サイズが約20〜25マイクロメートルで暗く染色されている必要があります。

LCM中、レーザーが熱可塑性フィルムを透過した後、細胞はキャップに付着するため、スライド上には存在しなくなり、周囲の組織から離れます。ニューロンの約85〜100%の背後には、マクロ設定でキャプチャHSキャップを使用してキャップに付着し、レーザー出力と強度を正しく調整する必要があります。各切片について、切片あたり約500〜700個の細胞を得る必要があり、その結果、ケースあたり少なくとも500ピコグラムの全RNAが得られます。

全 RNA 単離後、BioRad Experian を介してエレクトロフェログラムと仮想ゲルを使用して RNA の品質を評価します。エレクトロフェログラムでは、18 s および 20 a s のリボソーム RNA ユニットに対応する 2 つの異なるピークが、死後組織とともに見られます。ただし、切片化前の要因により組織が劣化する可能性があるため、常にそうであるとは限りません。

通常、劣化を示す大きな隆起があり、赤い矢印で示されているように、18 秒付近に大きなピークと 28 秒の小さなピークがあります。対照的に、分解が多すぎる品質の悪いRNAは、その曲線の下に大きな領域を持つエレクトロフェログラムによって示されます。2回の線形増幅後のmRNAの品質をテストするために、スプレッドの位置をシフトダウンすることに加えて、BioRad Experian標準SenseラボチップとNanoDrop分光光度計の両方を使用します。

従来のAtricsマイクロアレイ技術では、このプロトコルで検出するためには、mRNA転写産物の広がりが少なくとも600ヌクレオチドであることが必要です。mRNAの広がりは、エレクトロフェログラムで示されるように1000ヌクレオチドの範囲に達し、大きなピークは時間の関数としてゆっくりと下降します。この結果は、仮想ゲルによっても確認されます。

転写産物の長さが600ヌクレオチドより短い場合、サンプルは含めないでください ハイブリダイゼーションの場合、NanoDropの読み取り値は、サンプル全体で平均して2つの60に対して2つの60の比率または2.5の純度を示しました。平均濃度は1マイクロリットルあたり1.7マイクログラムであり、サンプルあたり約50マイクログラムのmRNAが得られ、マイクロアレイ分析とその後の検証の両方に十分であり、15〜20マイクログラムのmRNAとその後のQR TPCRによる結果の検証が必要です。私たちの結果は、このプロトコルでは、得られたRNAの量と質の両方が、atrix human X three Pチップを介して遺伝子発現の違いを調査するのに十分であることを示しています。

Atrics Human X three Pチップへのハイブリダイゼーション後、平均26.6%のコール率を達成し、適切なハイブリダイゼーションとプローブ強度を示しました。私たちは、これらの細胞から得られたRNAを使用するために、死後のヒト脳組織からパラメタルニューロンをレーザーキャプチャする方法を示しました。この手順を実行する際のマイクロアレイGプロファイリング研究では、RNAの完全性を維持するために、RNAフリーの環境ですべてのステップを実行し、ステップをタイムリーに完了することが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。