人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のRNAを取得

この手順は、-17°Cに設定したクライオスタットを用いて、液体窒素蒸気で凍結させた組織ブロックを8 µmの厚さで切片化し、チャージ処理されていないプレーンなガラススライドに貼付することから始まります。その後、切片をhisto gene染色キットで染色します。錐体ニューロンを特定した後、約500個の細胞をHSキャプチャーキャップにレーザーキャプチャーします。

細胞が含まれるキャップを、50 µLの抽出バッファーが入ったマイクロ遠心チューブに入れ、逆さまにして、あらかじめラックに設置し42 °Cに設定したウォーターバスに入れたFalconチューブに配置します。短時間の遠心分離後、キャップを取り除きます。これで、残った溶液を用いてRNA単離を行う準備が整いました。

こんにちは。私はマクリーン病院の構造・分子神経科学部門、Wilson Wu研究室のCharmaine Petersonです。本日は、ヒト死後脳組織からパラメタールニューロンをレーザーキャプチャーで回収する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手法を用いて、マイクロアレイ技術により統合失調症患者の上側頭回および下側頭回における遺伝子発現の差異を研究しています。

それでは開始しましょう。組織切片作成に先立ち、脳組織を液体窒素蒸気凍結ブロックとしてハーバード脳組織リソースセンター（Harvard Brain Tissue Resource Center）から入手しました。RNA汚染を最小限に抑えることが重要であるため、作業エリア、切断刃、スライドを含むすべての表面をRNA除染溶液（RNA SAPなど）で処理し、100% ethanolで拭き取りました。

この手順は、温度を-17°Cに設定したクリオスタットを用いて、液体窒素蒸気で凍結した組織ブロックを、電荷のないプレーンなガラススライド上に薄切することから始まります。これにより、histo geneクイック染色キットを用いて錐体ニューロンを同定するための組織切片が準備されます。エタノール脱水系列を準備するため、histo geneキットに付属の染色瓶に、適切な濃度のエタノールおよびRNaseフリー水をそれぞれ25mLずつ分注します。

1つの75%エタノール瓶を除き、すべての瓶をアイスバケットに入れます。その75%エタノールは、-20°Cのフリーザーに入れます。次に、染色液100 µLあたり1 µLのRNA阻害剤を添加して、染色液を調製します。

2枚のスライドで4枚の組織切片を染色するため、マイクロ遠心チューブ内で400 µLの染色液に4 µLのRNAインヒビターを加えます。染色液は氷上で保持してください。この操作はドラフトチャンバー内で行ってください。

組織の剥離を招く恐れがある過剰な水分を除去するため、キシレン容器にモレキュラーシーブを加えます。ウォーターバスの電源を入れ、温度を42 °Cに設定し、ラックに立てた50 mLのFalconチューブをウォーターバスに入れます。－80 °Cのフリーザーからスライドを2枚取り出し、キムワイプの上で解凍します。

約30秒間、またはスライドの角が解凍し始めるまで、-20 °Cのフリーザー内で75% ethanolを用いて組織を短時間固定します。次に、RNAフリーのピンセットを使用してスライドをnuclease free waterに移し、30秒間洗浄します。洗浄後、染色液を組織切片に集中させるため、PAPバリアペンで切片の周囲を囲みます。その後、histo gene染色液を用いて4つの切片を20秒間染色します。切片あたり97 µLの染色液/RNA阻害剤を用いて、あらかじめ氷上に準備しておいたethanolで、1ステップにつき30秒間、切片を脱水します。

組織を十分に立ち上げるための十分な脱水を達成するため、最後の100%エタノール浸漬ステップは3分間に延長する必要があります。最後に、スライドをキシレンに5分間浸し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションに移行する前に、スライドを完全に自然乾燥させます。単一細胞レーザーキャプチャーのための染色手順後、ピラミッドニューロンを直ちに除去する必要があります。マイクロダイセクション（LCM）には、あらかじめ準備しておいた、50 mL Falconチューブを保持した42 °Cの水槽が必要です。

単一細胞LCMは、ARCTURUS XTレーザーキャプチャーシステムおよびソフトウェアを用いて行います。この手順を開始するには、スライドとキャップをarcturus XT装置にセットします。キャプチャー用HSキャップを使用しますが、プログラム設定はmacroのままにしてください。

「overview」のロードボックスをクリックして、各スライドの俯瞰写真を表示します。2倍の倍率で輝度とフォーカスを調整し、レーザーキャプチャーに最適なセクションを決定します。過度に折り畳まれた組織セクションは避け、完全で平滑かつ染色されたセクションを選択してください。

キャプチャを行う大まかな領域の上にキャップを配置し、今回のケースでキャプチャ対象となる領域、すなわち皮質の第3層が含まれていることを確認してください。キャップのレールが襞（ひだ）の上に当たらないように注意してください。当たってしまうとキャップが傾き、スポットサイズにばらつきが生じる原因となります。

次に、40倍の倍率でIRレーザースポットの位置を手動で確認します。青い十字線がIRレーザースポットの中心にある必要があります。中心にない場合は、スポットを右クリックして「located IR spot」を選択し、位置を調整してください。

40倍の倍率で、以下の基準に従って錐体ニューロンを特定します。1つ目は細胞が錐体状であること、2つ目は頂状および/または基底樹状突起の近位部が確認できることです。ポジション機能のプラス記号をクリックして、キャプの位置を保存してください。これにより、キャプが移動しても、スポットサイズを調整した正確に同じ場所へ常に戻ることができます。

コントロールボックスに、パワーに70、持続時間に16の値を入力します。これらのパラメータは使用する組織に依存するため、開始前にご自身の組織サンプルに合わせてこれらの変数をテストし、調整することを推奨します。単一細胞のレーザーキャプチャを行う際は、「auto move stage」オプションのチェックを外し、適切なサイズのシンボルが右側のパネルにあるシンボルと一致していることを確認してください。

右下の円形のオプションを選択し、キャプチャをテストしたいニューロンを選択します。次に、青い十字を円に合わせた状態で、「test IR spot」をクリックしてレーザーを起動させます。レーザーによって形成されるスポットは、まず、キャプチャされた物体の周囲に鮮明な暗いリングを持つはずです。

リングが細胞を囲むのに十分な大きさであり、かつ、不要な組織や他の細胞が含まれない十分な小ささであることを確認してください。このリングが薄すぎる場合は、細胞が捕捉されていません。黒いリングの中央に黒い点がある場合は、レーザーの強度または照射時間が強すぎます。

収集したい層の中にある組織の異なる部位で、このプロセスを繰り返します。場所によってスポットサイズに差が出ないかを確認し、適宜調整してください。収集対象となるピラミッドニューロンを約500細胞特定します。

レーザーキャプチャーボタンを押して細胞を回収します。キャップをQCステーションに移動させてください。ニューロンが少なくとも90%除去されていることを確認してください。

そうでない場合は、より多くの細胞が回収された領域でさらに細胞を捕捉してください。キャップを、50 µLの抽出バッファーを含む0.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。キャップは、バッファーの漏れを防ぐために完全に適合するように設計されています。

アセンブリを逆さまにし、抽出バッファーがキャップ全体を覆っていることを確認して、42 °Cに設定したウォーターバス内の50 mL Falconチューブの底に配置します。ニューロンを30分間インキュベートして、キャップから組織を除去します。インキュベーション後、チューブとキャップのアセンブリを800 gで2分間遠心分離します。遠心分離後、キャップを取り除きます。

RNA抽出を後日行う場合は、残りの細胞抽出液を-80°Cで保存してください。それ以外の場合は、次節に示す手順に従って細胞抽出液からRNAの抽出を行います。RNA抽出には、LCMサンプルから少数の細胞を抽出し、低発現のmRNAを回収するように設計されたPICO Pure isolation kitを使用します。

この手順を開始するには、キットに付属の70% ethanolを細胞抽出液に加え、あらかじめコンディショニングした精製カラムで遠心分離します。洗浄後、RNAをカラムフィルターに結合させるため、DNaseで処理してDNAによる干渉のリスクを排除します。このステップは、リアルタイムR-T-P-C-Rなどのダウンストリームアプリケーションにおいて特に重要です。

DNA消化後、40 µLの洗浄バッファー1を加え、精製カラムを8,000 Gで15秒間遠心分離します。その後、キットに付属のプロトコルに従って洗浄を行いますが、洗浄バッファー2による最終洗浄ステップを2分から2分半に延長し、カラム内に洗浄バッファーが残らないようにしてください。バッファーが残っていると、RNAの回収量が減少する可能性があります。カラムを別のマイクロ遠心チューブに移します。溶出バッファーを加え、カラム内のフィルター上で1分間インキュベートした後、カラムを遠心分離してRNAを溶出させます。

最後に、バーチャルゲルおよびエレクトロフェログラムを提供するExperian High Senseラボチップを用いて、抽出したRNAの品質を確認します。サンプルの1.3 µLを0.5 mLチューブにピペットで分注します。品質管理試験用に、サンプルの残りを-80 °Cで凍結保存します。RNAの品質が確認できれば、増幅、標識、およびハイブリダイゼーションを行うことができます。

遺伝子発現プロファイリング解析のため、ribo amp HS plus kitを用いて2 roundsの線形増幅を行います。これにより、マイクロアレイおよびQ-R-T-P-C-Rの両実験に十分な、約50 microgramsの増幅RNAが得られます。増幅されたRNAの標識には、molecular devices社のturbo biotin labeling kitおよびlabelingを使用します。最終的に、atrix社のhuman X three P gene chip pro beretを用いて遺伝子発現プロファイリングを実施します。

組織切片作成により、1枚のスライドにつき2枚の切片、1症例につき計4枚の切片を2枚のスライドに作成する必要があります。各切片は、破れ、ひび割れ、または折り畳みが最小限に抑えられた滑らかな状態でなければなりません。錐体ニューロンは、サイズが約20から25 µmで、錐体状の形態をしており、頂端樹状突起が視認でき、濃く染色されている必要があります。

LCMでは、レーザーが熱可塑性フィルムを透過してパルス照射されると、細胞がキャップに付着し、スライド上から周囲の組織と共に切り離されます。キャプチャーHSキャップを使用し、マクロ設定およびレーザー出力と強度の調整を適切に行えば、約85〜100%のニューロンがキャップに付着するはずです。切片あたり約500〜700個の細胞を回収することで、1症例あたり少なくとも500 picogramsの総RNAを得ることができます。

全RNAの抽出後、BioRad Experianを用いて、エレクトロフェログラムとバーチャルゲルによりRNAの品質を評価します。死後組織の場合、エレクトロフェログラムには18 sおよび20 a sリボソームRNAユニットに対応する2つの明確なピークが見られるはずです。しかし、切片作成前の要因により組織が分解している可能性があるため、必ずしも常にそうとは限りません。

通常、赤色の矢印で示されているように、18 s付近に大きなピークがあり、28 s付近にそれより小さいピークが見られ、分解を示す大きな盛り上がり（バンプ）が確認されます。対照的に、分解が進みすぎた低品質なRNAでは、エレクトロフェログラムの曲線下の面積が大きくなります。2回の線形増幅後のmRNAの品質を評価するため、拡散位置の下方シフトを確認することに加え、BioRad Experian standard Sense lab chipとNanoDrop分光光度計の両方を使用します。

従来のAtricsマイクロアレイ技術では、本プロトコルで検出するためにはmRNA転写産物のスプレッドが少なくとも600ヌクレオチドの長さである必要があります。エレクトロフェログラムにおいて、大きなピークが時間の経過とともに緩やかに下降していることから、mRNAスプレッドが1000ヌクレオチドの範囲に達していることが示されました。この結果は、バーチャルゲルによっても確認されています。

転写産物の長さが600ヌクレオチド未満の場合、そのサンプルは除外する必要があります。ハイブリダイゼーションにおいて、NanoDropの測定値は、サンプル全体で平均 A260/A280比（純度）が2.5であることを示しました。平均濃度は1.7 µg/µLであり、1サンプルあたり約50 µgのmRNAが得られました。これは、15～20 µgのmRNAを必要とするマイクロアレイ解析および、その後の定量RT-PCRによる結果の検証の両方に十分な量です。我々の結果は、本プロトコルを用いることで、Affymetrix Human X3-Plusチップによる遺伝子発現差の解析に十分な量と質のRNAが得られることを示しています。

Atrics Human X three Pチップへのハイブリダイゼーション後、平均26.6%のパーセントコールを得ており、これはハイブリダイゼーションおよびプローブ強度が適切であったことを示しています。以上の手順で、これらの細胞から得られるRNAを利用するために、死後ヒト脳組織からパラメタニューロンをレーザーキャプチャーする方法を示しました。この手順を用いてマイクロアレイGプロファイリング研究を行う際は、RNAの完全性を維持するために、すべての工程をRNaseフリーの環境で実施し、適宜迅速に完了させることが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。