Name: 人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のRNAを取得 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: 学ぶレーザー捕捉顕微解剖法を用いた人間の死後脳組織からの錐体細胞単離と高品質RNA抽出法。マイクロアレイ解析による統合失調症の遺伝子発現研究に応用可能です。

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我々は感謝して分子デバイスの研究に使用される試薬の彼らの寛大な寄付のための分析技術/アルクトゥルスを認めます。我々はまた、死後、人間の脳組織を提供するためにハーバード大学の組織のリソースセンターに感謝資金 ：。RO1MH76060とP50MH080272。

<ol><li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).</li>
</ol>

このビデオ記事の生産は、Life Technologies社が後援した。

ここで、我々は、アルクトゥルスXTシステムと関連するRNA抽出キットを使用して異種の死後の脳組織から均質な細胞集団を抽出するためのプロトコルをカスタマイズしよう。上述のように、我々は、RNAの完全性を最大化するために、同社が提供するオリジナルプロトコルにいくつかの変更を行っている。単一細胞の正常なキャプチャリングは、単に良いRNAとの最大のセルを実現するために、キャプチャする前に手順を最適化に依存する。これらの手順は、組織の切片や染色に関連するさまざまなパラメータが含まれています。一言で言えば、組織の準備に関して、これらが含まれます：1）、2の切削時に温度勾配を減少）のみ4、氷の上のすべての脱水の手順を実行して、スライドごとに2セクション、3）を配置すること）の増加）染色、5のRNase阻害剤を追加する3分に最後の100％エタノールで脱水期間。 キャプチャに関しては、我々はポイカプセルHSキャップの組み合わせと感じ、マクロの設定上のソフトウェアで、最適な結果を確認する必要があります。高湿度が大幅に組織&quot;リフト&quot;を減少させるように湿度制御環境は、単一細胞を捕捉するために重要です。高温はまた、RNAの品質に悪影響を与えることができる。 PicoPureキットでRNA分離プロトコール中に、2つの洗浄ステップがあります。すべての洗浄バッファーが最終的なサンプル中のバッファのいずれかが存在するが、増幅のための小さい開始RNAにつながるとして、RNA溶出のための別のマイクロ遠心チューブに移す前に削除されていることを確認することが重要です。これを確実にするために、我々は、提供するプロトコルで提案されている2.5分の代わりに2分間の最後の洗浄ステップを遠心してください。 ほとんどの部分については、リニア増幅プロトコールは、製造元の指示に従ってでした。このプロトコルを使用するただし、次の2つの重要な点を考慮する必要があります：1）サーマルサイクラーで0.5ミリリットルのブロックと組み合わせて提供される唯一の0.5ミリリットルチューブを使用することにより、チューブ間のサンプルの過剰移籍を経由してRNAの損失を制限しようとする、および2）cDNAの精製のための精製カラムにサンプルを転送するとき、最初の転送の後にサンプルチューブをスピンダウンしてください。これは、精製カラムに追加するため、cDNAの回収を増加させることができるサンプルの追加1 - 2ulになります。 あなたの限られたaRNAのサンプルのビオチン標識用ターボ末端標識キットを利用する場合、我々は余分な数μlを添加すると収率は、列から抽出された標識RNAを高めるために、遠心分離のステップの前に水から出ているとのこと。遠心分離の余分な分はあなたがそのようなFFPE組織などの劣化した組織、と作業している場合は特に、この点で役立ちます。 我々は、このプロトコルは、異種の死後の脳組織内で、ユーザーがそのような単一の細胞集団としての小さな均質構造を、単離するために有効になると確信しています。これは、調査中の特定の細胞タイプをターゲットに結果につながる、脳内の様々な層に位置し、周囲の構造および他の細胞タイプの希釈効果を、減らすことができます。得られたRNAの質は、マイクロアレイ研究には十分なので、我々は、病気の状態に影響を受ける特定の細胞集団の特定の分子の署名を特定するために始めることができます。

<table><tbody><tr><td>4.5&amp;#8221; ピンセット</td><td>VWR international</td><td>82027-392</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus XT&amp;#8482; レーザーキャプチャーマイクロダイセクション (LCM) システム</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>13821-00</td><td></td></tr><tr><td>CapSure&amp;#8482; HS LCM キャップ</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>LCM 0214</td><td></td></tr><tr><td>CapSure&amp;#174; Macro LCM キャップ</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>LCM 0211</td><td></td></tr><tr><td>Experion&amp;#8482; 自動電気泳動ステーション</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7001</td><td></td></tr><tr><td>Experion&amp;#8482; RNA HighSens チップ</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7155</td><td>10 chips</td></tr><tr><td>Experion&amp;#8482; RNA HighSens 試薬</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7156</td><td>10 chips</td></tr><tr><td>Experion&amp;#8482; RNA StdSens チップ</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7153</td><td>10 chips</td></tr><tr><td>Experion&amp;#8482; RNA StdSens 試薬</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7154</td><td>10 chips</td></tr><tr><td>Falcon&amp;#174; ポリプロピレン製コニカルチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp&amp;#174; ドーム型キャップ付き薄壁反応チューブ</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip&amp;#174; Human X3P アレイ</td><td>Affymetrix</td><td>900516</td><td>6 chips</td></tr><tr><td>Histogene&amp;#174; LCM 凍結切片染色キット</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>KIT0401</td><td>染色液、ジャー、エタノール、キシレンを含む</td></tr><tr><td>Histogene&amp;#8482; LCM スライド</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>12231-00</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスライドボックス</td><td>VWR international</td><td>48444-004</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 505E クライオスタット</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22-050-350</td><td>現行製品が提供終了しているため、類似製品のカタログ番号を記載</td></tr><tr><td>マイクロプロセッサ制御 280 シリーズ ウォーターバス</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>51221048</td><td>モデル 282</td></tr><tr><td>モレキュラーシーブ</td><td>EMD Millipore</td><td>MX1583L-1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 分光光度計</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>n/a</td><td>NanoDrop 1000 は提供終了していますが、NanoDrop 2000 が同等です</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>PEN メンブランスライドガラス</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>LCM 0522</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure&amp;#174; RNA 分離キット</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RiboAmp&amp;#174;HS&lt;sup&gt;PLUS&lt;/sup&gt;（ビオチン標識付）</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>KIT0511B</td><td>12 反応分。TURBO ビオチン標識&amp;#8482; キットを含む</td></tr><tr><td>RNase Zap&amp;#174;</td><td>Ambion</td><td>AM9780/2</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase セット</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNasin&amp;#174; Plus</td><td>Promega Corp.</td><td>N261B</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;#8482; III 逆転写酵素</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr></tbody></table>

人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のrnaを取得

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

我々は、レイヤーIIIの錐体細胞の遺伝子発現プロファイルを問い合わせることにより、統合失調症の患者に見られる上側頭回の灰白質の減少を調査することを提案した。それは、大脳皮質は多様な領域、層および別個の細胞および分子組成物およびそのための差動遺伝子発現プロファイルによって特徴づけられるそれぞれの細胞タイプを、構成する非常に不均質構造であることはよく知られています。組織の不均一性の交絡の影響を回避するために、我々は特定の細胞型、すなわち錐体細胞を単離するために、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を使用。 Histogene染色液で染色された約500個の錐体細胞は、アルクトゥルスXT LCMシステムを使用して捕獲された。 RNAを捕捉細胞から単離され、アルクトゥルス/分子デバイスのキットを用いてT7ベースの線形増幅を2回施行した。 Experion LabChip（Bio - Rad社）ゲルや電気泳動図では、マイクロアレイに必要な過去の600ntを拡張する転写産物の長さで、良質の（m）のRNAを示した。得られたmRNAの量は2.5、A260/280比で示されるように許容可能な平均値サンプルの純度で、51μgの平均値。遺伝子発現は、アフィメトリクスからヒューマンX3PのGeneChipプローブアレイを用いてプロファイリングした。

我々は、死後、人間の脳の上側頭回の層IIIの均質な細胞集団、錐体細胞からRNAを分離して抽出するためにレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用してプロセスを説明します。私たちは、その後直線的に（T7ベース）mRNAを増幅し、Affymetrix社人間X3Pマイクロアレイにサンプルをハイブリダイズする。

人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のRNAを取得

遺伝子発現を解析することにより、統合失調症患者に見られる上側頭回の灰白質減少を調査することを提案した。

この手順は、-17°Cに設定したクライオスタットを用いて、液体窒素蒸気で凍結させた組織ブロックを8 µmの厚さで切片化し、チャージ処理されていないプレーンなガラススライドに貼付することから始まります。その後、切片をhisto gene染色キットで染色します。錐体ニューロンを特定した後、約500個の細胞をHSキャプチャーキャップにレーザーキャプチャーします。細胞が含まれるキャップを、50 µLの抽出バッファーが入ったマイクロ遠心チューブに入れ、逆さまにして、あらかじめラックに設置し42 °Cに設定したウォーターバスに入れたFalconチューブに配置します。短時間の遠心分離後、キャップを取り除きます。これで、残った溶液を用いてRNA単離を行う準備が整いました。こんにちは。私はマクリーン病院の構造・分子神経科学部門、Wilson Wu研究室のCharmaine Petersonです。本日は、ヒト死後脳組織からパラメタールニューロンをレーザーキャプチャーで回収する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手法を用いて、マイクロアレイ技術により統合失調症患者の上側頭回および下側頭回における遺伝子発現の差異を研究しています。それでは開始しましょう。組織切片作成に先立ち、脳組織を液体窒素蒸気凍結ブロックとしてハーバード脳組織リソースセンター（Harvard Brain Tissue Resource Center）から入手しました。RNA汚染を最小限に抑えることが重要であるため、作業エリア、切断刃、スライドを含むすべての表面をRNA除染溶液（RNA SAPなど）で処理し、100% ethanolで拭き取りました。この手順は、温度を-17°Cに設定したクリオスタットを用いて、液体窒素蒸気で凍結した組織ブロックを、電荷のないプレーンなガラススライド上に薄切することから始まります。これにより、histo geneクイック染色キットを用いて錐体ニューロンを同定するための組織切片が準備されます。エタノール脱水系列を準備するため、histo geneキットに付属の染色瓶に、適切な濃度のエタノールおよびRNaseフリー水をそれぞれ25mLずつ分注します。1つの75%エタノール瓶を除き、すべての瓶をアイスバケットに入れます。その75%エタノールは、-20°Cのフリーザーに入れます。次に、染色液100 µLあたり1 µLのRNA阻害剤を添加して、染色液を調製します。2枚のスライドで4枚の組織切片を染色するため、マイクロ遠心チューブ内で400 µLの染色液に4 µLのRNAインヒビターを加えます。染色液は氷上で保持してください。この操作はドラフトチャンバー内で行ってください。組織の剥離を招く恐れがある過剰な水分を除去するため、キシレン容器にモレキュラーシーブを加えます。ウォーターバスの電源を入れ、温度を42 °Cに設定し、ラックに立てた50 mLのFalconチューブをウォーターバスに入れます。－80 °Cのフリーザーからスライドを2枚取り出し、キムワイプの上で解凍します。約30秒間、またはスライドの角が解凍し始めるまで、-20 °Cのフリーザー内で75% ethanolを用いて組織を短時間固定します。次に、RNAフリーのピンセットを使用してスライドをnuclease free waterに移し、30秒間洗浄します。洗浄後、染色液を組織切片に集中させるため、PAPバリアペンで切片の周囲を囲みます。その後、histo gene染色液を用いて4つの切片を20秒間染色します。切片あたり97 µLの染色液/RNA阻害剤を用いて、あらかじめ氷上に準備しておいたethanolで、1ステップにつき30秒間、切片を脱水します。組織を十分に立ち上げるための十分な脱水を達成するため、最後の100%エタノール浸漬ステップは3分間に延長する必要があります。最後に、スライドをキシレンに5分間浸し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションに移行する前に、スライドを完全に自然乾燥させます。単一細胞レーザーキャプチャーのための染色手順後、ピラミッドニューロンを直ちに除去する必要があります。マイクロダイセクション（LCM）には、あらかじめ準備しておいた、50 mL Falconチューブを保持した42 °Cの水槽が必要です。単一細胞LCMは、ARCTURUS XTレーザーキャプチャーシステムおよびソフトウェアを用いて行います。この手順を開始するには、スライドとキャップをarcturus XT装置にセットします。キャプチャー用HSキャップを使用しますが、プログラム設定はmacroのままにしてください。「overview」のロードボックスをクリックして、各スライドの俯瞰写真を表示します。2倍の倍率で輝度とフォーカスを調整し、レーザーキャプチャーに最適なセクションを決定します。過度に折り畳まれた組織セクションは避け、完全で平滑かつ染色されたセクションを選択してください。キャプチャを行う大まかな領域の上にキャップを配置し、今回のケースでキャプチャ対象となる領域、すなわち皮質の第3層が含まれていることを確認してください。キャップのレールが襞（ひだ）の上に当たらないように注意してください。当たってしまうとキャップが傾き、スポットサイズにばらつきが生じる原因となります。次に、40倍の倍率でIRレーザースポットの位置を手動で確認します。青い十字線がIRレーザースポットの中心にある必要があります。中心にない場合は、スポットを右クリックして「located IR spot」を選択し、位置を調整してください。40倍の倍率で、以下の基準に従って錐体ニューロンを特定します。1つ目は細胞が錐体状であること、2つ目は頂状および/または基底樹状突起の近位部が確認できることです。ポジション機能のプラス記号をクリックして、キャプの位置を保存してください。これにより、キャプが移動しても、スポットサイズを調整した正確に同じ場所へ常に戻ることができます。コントロールボックスに、パワーに70、持続時間に16の値を入力します。これらのパラメータは使用する組織に依存するため、開始前にご自身の組織サンプルに合わせてこれらの変数をテストし、調整することを推奨します。単一細胞のレーザーキャプチャを行う際は、「auto move stage」オプションのチェックを外し、適切なサイズのシンボルが右側のパネルにあるシンボルと一致していることを確認してください。右下の円形のオプションを選択し、キャプチャをテストしたいニューロンを選択します。次に、青い十字を円に合わせた状態で、「test IR spot」をクリックしてレーザーを起動させます。レーザーによって形成されるスポットは、まず、キャプチャされた物体の周囲に鮮明な暗いリングを持つはずです。リングが細胞を囲むのに十分な大きさであり、かつ、不要な組織や他の細胞が含まれない十分な小ささであることを確認してください。このリングが薄すぎる場合は、細胞が捕捉されていません。黒いリングの中央に黒い点がある場合は、レーザーの強度または照射時間が強すぎます。収集したい層の中にある組織の異なる部位で、このプロセスを繰り返します。場所によってスポットサイズに差が出ないかを確認し、適宜調整してください。収集対象となるピラミッドニューロンを約500細胞特定します。レーザーキャプチャーボタンを押して細胞を回収します。キャップをQCステーションに移動させてください。ニューロンが少なくとも90%除去されていることを確認してください。そうでない場合は、より多くの細胞が回収された領域でさらに細胞を捕捉してください。キャップを、50 µLの抽出バッファーを含む0.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。キャップは、バッファーの漏れを防ぐために完全に適合するように設計されています。アセンブリを逆さまにし、抽出バッファーがキャップ全体を覆っていることを確認して、42 °Cに設定したウォーターバス内の50 mL Falconチューブの底に配置します。ニューロンを30分間インキュベートして、キャップから組織を除去します。インキュベーション後、チューブとキャップのアセンブリを800 gで2分間遠心分離します。遠心分離後、キャップを取り除きます。RNA抽出を後日行う場合は、残りの細胞抽出液を-80°Cで保存してください。それ以外の場合は、次節に示す手順に従って細胞抽出液からRNAの抽出を行います。RNA抽出には、LCMサンプルから少数の細胞を抽出し、低発現のmRNAを回収するように設計されたPICO Pure isolation kitを使用します。この手順を開始するには、キットに付属の70% ethanolを細胞抽出液に加え、あらかじめコンディショニングした精製カラムで遠心分離します。洗浄後、RNAをカラムフィルターに結合させるため、DNaseで処理してDNAによる干渉のリスクを排除します。このステップは、リアルタイムR-T-P-C-Rなどのダウンストリームアプリケーションにおいて特に重要です。DNA消化後、40 µLの洗浄バッファー1を加え、精製カラムを8,000 Gで15秒間遠心分離します。その後、キットに付属のプロトコルに従って洗浄を行いますが、洗浄バッファー2による最終洗浄ステップを2分から2分半に延長し、カラム内に洗浄バッファーが残らないようにしてください。バッファーが残っていると、RNAの回収量が減少する可能性があります。カラムを別のマイクロ遠心チューブに移します。溶出バッファーを加え、カラム内のフィルター上で1分間インキュベートした後、カラムを遠心分離してRNAを溶出させます。最後に、バーチャルゲルおよびエレクトロフェログラムを提供するExperian High Senseラボチップを用いて、抽出したRNAの品質を確認します。サンプルの1.3 µLを0.5 mLチューブにピペットで分注します。品質管理試験用に、サンプルの残りを-80 °Cで凍結保存します。RNAの品質が確認できれば、増幅、標識、およびハイブリダイゼーションを行うことができます。遺伝子発現プロファイリング解析のため、ribo amp HS plus kitを用いて2 roundsの線形増幅を行います。これにより、マイクロアレイおよびQ-R-T-P-C-Rの両実験に十分な、約50 microgramsの増幅RNAが得られます。増幅されたRNAの標識には、molecular devices社のturbo biotin labeling kitおよびlabelingを使用します。最終的に、atrix社のhuman X three P gene chip pro beretを用いて遺伝子発現プロファイリングを実施します。組織切片作成により、1枚のスライドにつき2枚の切片、1症例につき計4枚の切片を2枚のスライドに作成する必要があります。各切片は、破れ、ひび割れ、または折り畳みが最小限に抑えられた滑らかな状態でなければなりません。錐体ニューロンは、サイズが約20から25 µmで、錐体状の形態をしており、頂端樹状突起が視認でき、濃く染色されている必要があります。LCMでは、レーザーが熱可塑性フィルムを透過してパルス照射されると、細胞がキャップに付着し、スライド上から周囲の組織と共に切り離されます。キャプチャーHSキャップを使用し、マクロ設定およびレーザー出力と強度の調整を適切に行えば、約85〜100%のニューロンがキャップに付着するはずです。切片あたり約500〜700個の細胞を回収することで、1症例あたり少なくとも500 picogramsの総RNAを得ることができます。全RNAの抽出後、BioRad Experianを用いて、エレクトロフェログラムとバーチャルゲルによりRNAの品質を評価します。死後組織の場合、エレクトロフェログラムには18 sおよび20 a sリボソームRNAユニットに対応する2つの明確なピークが見られるはずです。しかし、切片作成前の要因により組織が分解している可能性があるため、必ずしも常にそうとは限りません。通常、赤色の矢印で示されているように、18 s付近に大きなピークがあり、28 s付近にそれより小さいピークが見られ、分解を示す大きな盛り上がり（バンプ）が確認されます。対照的に、分解が進みすぎた低品質なRNAでは、エレクトロフェログラムの曲線下の面積が大きくなります。2回の線形増幅後のmRNAの品質を評価するため、拡散位置の下方シフトを確認することに加え、BioRad Experian standard Sense lab chipとNanoDrop分光光度計の両方を使用します。従来のAtricsマイクロアレイ技術では、本プロトコルで検出するためにはmRNA転写産物のスプレッドが少なくとも600ヌクレオチドの長さである必要があります。エレクトロフェログラムにおいて、大きなピークが時間の経過とともに緩やかに下降していることから、mRNAスプレッドが1000ヌクレオチドの範囲に達していることが示されました。この結果は、バーチャルゲルによっても確認されています。転写産物の長さが600ヌクレオチド未満の場合、そのサンプルは除外する必要があります。ハイブリダイゼーションにおいて、NanoDropの測定値は、サンプル全体で平均 A260/A280比（純度）が2.5であることを示しました。平均濃度は1.7 µg/µLであり、1サンプルあたり約50 µgのmRNAが得られました。これは、15～20 µgのmRNAを必要とするマイクロアレイ解析および、その後の定量RT-PCRによる結果の検証の両方に十分な量です。我々の結果は、本プロトコルを用いることで、Affymetrix Human X3-Plusチップによる遺伝子発現差の解析に十分な量と質のRNAが得られることを示しています。Atrics Human X three Pチップへのハイブリダイゼーション後、平均26.6%のパーセントコールを得ており、これはハイブリダイゼーションおよびプローブ強度が適切であったことを示しています。以上の手順で、これらの細胞から得られるRNAを利用するために、死後ヒト脳組織からパラメタニューロンをレーザーキャプチャーする方法を示しました。この手順を用いてマイクロアレイGプロファイリング研究を行う際は、RNAの完全性を維持するために、すべての工程をRNaseフリーの環境で実施し、適宜迅速に完了させることが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

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Biology

生物学

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